高順華，王興敏，劉 菲，康欣悅，王保霖，周賀霞

（1.成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，四川成都610500；2.四川省動物源性食品獸藥殘留防控技術工程實驗室，四川成都610500）

希瓦菌（Shewanellaspp.）被認為是引起水產(chǎn)高蛋白食品腐敗變質的主要細菌類群。也有研究指出，希瓦菌是人和水生動物的機會致病菌，但由于其多數(shù)為嗜冷菌而不為臨床微生物學家所關注[1]。其生長發(fā)育受溫度影響較大，生長的溫度范圍為1～40℃[2-3]?，F(xiàn)作為生物催化劑被應用于發(fā)酵、發(fā)電、采礦等多個領域[4-6]。由于抗生素的普遍使用，由希瓦菌引起的感染日益增加。近年來，國內外有大量關于腐敗希瓦菌感染海水養(yǎng)殖動物、淡水養(yǎng)殖動物甚至部分臨床患者感染案例的報道。汪永祿等[7]國內首次從2起聚餐性食物中毒腹瀉患者標本中分離到海藻希瓦菌和腐敗希瓦菌，并提出其可能為食物中毒的病原菌。魏超等[8]首次從鮮豬肉中檢出腐敗希瓦菌，并發(fā)現(xiàn)其對復方新諾明、土霉素、卡那霉素完全耐藥。秦蕾等[9]報道了異育銀鯽暴發(fā)的腐敗希瓦菌感染，發(fā)現(xiàn)感染發(fā)病的魚軀干充血發(fā)紅，肛門紅腫，解剖發(fā)現(xiàn)有腹水，花斑肝，高濃度組發(fā)病魚腹腔可見點狀出血。郭全友等[10]經(jīng)研究確定，冷藏大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌為腐敗希瓦。張瑩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，腐皮綜合癥病灶中部分優(yōu)勢菌存在N-?；呓z氨酸內酯類化合物介導的群體感應系統(tǒng)，其中，腐敗希瓦菌活性最高。KOZI?SKA等[12]從鯉魚、鱒魚體內分離得到2株腐敗希瓦菌，對魚進行腹腔注射后產(chǎn)生疾病征兆；KORUN等[13]從鱸魚體內分離得到腐敗希瓦菌，該菌株可引起皮膚潰瘍、腎功能受損、脾臟腫大。方四倍[14]報道了希瓦菌引起的2例血流感染；丁秀榮等[15]報道了希瓦氏菌感染7例肝病患者，其中，血流感染2例，腹膜炎4例，膽道感染1例。朱聰智[16]也從老年肺炎患者痰液中檢出腐敗希瓦菌。ROUZIC等[17]也曾報道過腐敗希瓦菌感染肝硬化和糖尿病患者的案例。這些研究都證明了腐敗希瓦菌的潛在危險性。故該菌應引起微生物學和臨床學界的高度關注。沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，需氧及兼性厭氧，無芽孢無莢膜，大多周生鞭毛，為常見致病菌，感染沙門氏菌的人或食用帶菌者糞便污染的食品均會引起食物中毒。而腐敗希瓦菌與沙門氏菌同為革蘭氏陰性桿菌，周生鞭毛，能運動，二者在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基上的菌落特征較相似，并且均可在血平板上發(fā)生溶血。腐敗希瓦菌雖為條件致病菌，但其近年來引起多起臨床感染，在養(yǎng)殖動物及病人分泌物中多次被分離出。

本試驗從魷魚中分離檢測出腐敗希瓦菌一株，經(jīng)ATB生化鑒定和基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜（Laser Desorption lionization Time of Flight Mass Spectrometry）鑒定后接種血平板和BS培養(yǎng)基，并用5類9種常見抗生素對其進行抗性比較，以期為腐敗希瓦菌防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試凍藏魷魚購于市場。

1.2 儀器設備與試劑

ATB微生物鑒定儀、ATB試劑條ID 32E、NaCl 0.85%Medium（法國生物梅里埃公司）；MALDITOF-MS（日本島津，AMIMA Confidence）；生物安全柜（上海立申儀器設備有限公司，HF-safe-1200）；生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司，LRH-500F）。

緩沖蛋白胨水（BPW）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血平板（北京陸橋技術有限責任公司）；法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（上海欣中生物工程有限公司）；抗生素藥敏片：青霉素G、土霉素、氯霉素、鏈霉素、羅紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明（Oxoid公司，Φ6 mm）、甲酸（TEDIA，色譜純）、乙腈（Thermo Fisher Scientific，色譜純）、α-氰-4-羥基肉桂酸（α-CCA）（SIGMA，suitable for MALDI-TOF-MS）。

1.3 試驗方法

1.3.1 腐敗希瓦菌的分離純化和生化試驗 于無菌間準確稱取25.0g樣品置于裝有225mLBPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器以8 000～10 000 r/min均質2 min。將均質后樣品放于36℃恒溫培養(yǎng)箱中前增菌培養(yǎng)18 h，混勻后移取1 mL轉種于10 mL TTB內，于（42±1）℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL轉種于10 mL SC內，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。于生物安全柜中劃線接種于沙門氏菌顯色平板和BS瓊脂。挑取可疑單菌落接種三糖鐵瓊脂，先于斜面劃線再于底層穿刺，并接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。

1.3.2 腐敗希瓦菌的鑒定

1.3.2.1 生化鑒定 挑取血平板上的單菌落于比濁管，混勻并調整至0.5麥氏濃度（約1.5×108cfu/mL），用移液槍將樣品加至試劑條樣杯中，其中，鳥氨酸脫羧酶（ODC）、精氨酸雙水解酶（ADH）、賴氨酸脫羧酶（LDC）、尿素酶（URE）、L- 阿拉伯醇（LARL）、d-半乳糖酸鹽同化（GAT）、5-酮葡萄糖酸（5KG）7個項目用石蠟油液封，保證其孔為厭氧狀態(tài)，由ATB微生物鑒定系統(tǒng)檢測分析數(shù)據(jù)并得到最終結果。

1.3.2.2 質譜鑒定 挑取血平板上單個菌落于1 mL乙醇中，振蕩 1 min，40 kHz超聲 10 min，8 000 r/min離心2 min，棄上清后加入70%甲酸水溶液50～100 μL，振蕩混勻超聲10 min，再加入100%乙腈50～100 μL，振蕩混勻靜置 30 min，超聲 10 min，8000r/min離心2min，取上清液1μL點至靶板，自然晾干后加入1 μLα-CCA，靜置晾干后上機檢測。

1.3.2.3 檢測條件 ESI離子源，氮氣激光器，固定聚焦337 nm，激光能頻72～88 Hz，初始能頻80 Hz，收集范圍3 000～13 000，采用ATCC 8739標準大腸桿菌校準，將微生物圖譜質荷比（m/z）信息導入MALDI-TOF/SARAMIS數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)與其中的超級譜圖進行匹配，從而得出微生物質譜鑒定結果。

1.3.3 腐敗希瓦菌藥敏試驗 取1.3.2.1中菌懸液55 μL于空白平皿中，將配制好的營養(yǎng)瓊脂冷卻至45～50℃后傾注平皿，振蕩混勻，待培養(yǎng)基凝固后，將藥敏片用無菌鑷子貼于培養(yǎng)基表面，每種藥敏片做一個平行，每皿2片，以空白為對照，于36℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈形態(tài)并測量其直徑。按照藥敏試驗抗性標準抑菌圈直徑判定敏感度：抑菌圈直徑在20 mm以上為極敏，在5～20 mm為高敏，在10～14 mm為中敏，在10 mm以下為低敏，0 mm為不敏[18]。

2 結果與分析

2.1 菌落特征

表1 培養(yǎng)基上的菌落特征

該菌在沙門氏菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基呈光滑淡紫色菌落、BS瓊脂上呈灰綠色菌落，在血平板上發(fā)生溶血，在TSI瓊脂上斜面呈紅色、底層呈黃色、底部形成黑色沉淀，穿刺接種呈擴散性生長（表1）。

2.2 生化鑒定和質譜鑒定

生化鑒定結果如表2所示。經(jīng)系統(tǒng)鑒定，該微生物為腐敗希瓦菌（Shewanellaputrefaciens SP.），其中，T值為1.0，ID值為98.4%。其中，T值表示其生化反應結果與該菌最典型生化譜的接近程度，ID值為根據(jù)被鑒定菌株的生化反應模式得出的鑒定結果，其可信度在已知的菌庫細菌中所占的百分比。當ID＞90.9%、T＞0.25時鑒定結果較好。因此，腐敗希瓦菌的鑒定為好的鑒定結果。

表2 腐敗希瓦菌生化鑒定結果

質譜鑒定結果 MALDI-TOF-MS圖譜如圖1所示。經(jīng)與SARAMIS數(shù)據(jù)庫中匹配，鑒定該菌為腐敗希瓦菌。

2.3 藥敏試驗結果

本試驗采用常見的9種人用或獸用抗生素進行抗性試驗，β內酰胺類抗生素采用青霉素G；氨基糖苷類抗生素采用慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素；四環(huán)素類采用土霉素；大環(huán)內酯類抗生素采用羅紅霉素；氯霉素類抗生素類采用氯霉素；磺胺類抗生素采用復方新諾明；喹諾酮類抗生素采用環(huán)丙沙星。并且該菌傾注平皿后呈表面生長，表明其為嚴格需氧型。抑菌情況列于表3，氯霉素及青霉素敏感試驗如圖2、3所示。從表3可以看出，卡那霉素、慶大霉素、羅紅霉素、土霉素、氯霉素、鏈霉素、復方新諾明、環(huán)丙沙星都表現(xiàn)出對此菌的明顯抑制作用（氯霉素抑制效果最強，復方新諾明效果有限），僅青霉素G對其無抑制作用。

表3 腐敗希瓦菌藥敏試驗結果

2.4 腐敗希瓦菌和沙門氏菌的差異性比較

試驗用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）方法對魷魚樣品進行檢測，選擇分離所得菌落在BS瓊脂與沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為沙門氏菌可疑菌落，并且該菌在血平板上發(fā)生溶血。分離菌株經(jīng)ATB生化鑒定和質譜鑒定確定為腐敗希瓦菌。接種TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基后三糖鐵瓊脂斜面產(chǎn)堿底層產(chǎn)酸，H2S陽性，賴氨酸脫羧酶試驗呈陰性。根據(jù)GB4789.4—2016方法可初步判斷為可疑沙門氏菌屬；再與沙門氏菌屬生化反應初步鑒定表反應序號A1對應，只有賴氨酸脫羧酶一項反應結果不一致，與甲型副傷寒沙門氏菌十分相似。這可能會對沙門氏菌的鑒定帶來較大干擾。但將腐敗希瓦菌藥敏試驗結果（表3）與沙門氏菌生化表進行比較發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌通常能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇，不發(fā)酵乳糖、蔗糖和側金盞花醇，不產(chǎn)吲哚，不水解尿素。而由腐敗希瓦菌生化鑒定結果可以看出（表2），腐敗希瓦菌不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇和側金盞花醇；不產(chǎn)吲哚，不水解尿素，但能利用丙二酸鹽，產(chǎn)L-天冬氨酸芳胺酶。由此可以看出，二者生化反應差別較大。

3 結論與討論

3.1 腐敗希瓦菌與沙門氏菌的差異性分析

試驗從魷魚中分離純化得到一株腐敗希瓦菌，該菌在BS瓊脂與沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為沙門氏菌可疑菌落，并且該菌在血平板上發(fā)生溶血。這與沙門氏菌在BS瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、血平板等培養(yǎng)基上的菌落特征十分相似。而進一步生化試驗比較發(fā)現(xiàn)，二者在生化反應中存在較大區(qū)別。故可以通過生化反應的差異性將二者進行區(qū)分。關于兩菌在BS瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、血平板上菌落特征相似的機制還有待進一步試驗研究。

3.2 菌株耐藥性及潛在危險性分析

藥敏試驗結果顯示，該菌株對8種常用抗生素極為敏感，其中，復方新諾明抑制效果不佳，菌苔抑菌圈內完全渾濁，并且青霉素G對其毫無抑制效果。近年來相關研究表明，腐敗希瓦菌分別對磷霉素、氨芐西林、復方新諾明、土霉素、卡那霉素等多種常見抗生素表現(xiàn)出完全抗性。感染動物主要表現(xiàn)為體表潰爛、肝腫大、皮膚黏膜出血性病變。其耐藥性菌株間存在較大差異，其原因可能與抗生素的濫用及地區(qū)環(huán)境差異密不可分。這種抗性抗致使受到感染后治療恢復極其困難，對其進行耐藥性總結對臨床用藥具有較大參考意義。