培養(yǎng)條件及表面活性劑的添加對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

馮靜靜，楊自名，吳靜，李偉，Sokhna Mbacke Gningue，趙禮軍，周文豪，薛正蓮,2，王洲,2，劉艷,2*

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

生物膜(biofilm，BF)是具有高度組織性的微生態(tài)系統(tǒng)，是細(xì)菌由浮游的單細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止的多細(xì)胞狀態(tài)的過程，隨后的生長(zhǎng)導(dǎo)致了有組織的群落以及細(xì)胞分化[1]。能夠附著在非生物介質(zhì)的表面以及氣液相交的界面上，分泌的細(xì)胞外聚合物(extracellular poly-mericsubatances，EPS)主要包括胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)，以此來增強(qiáng)對(duì)外界不利環(huán)境的抗性以及耐受能力[2-3]。作為一種細(xì)菌群體合作和競(jìng)爭(zhēng)并存的表現(xiàn)形式，生物膜在細(xì)菌抵制外界有害物質(zhì)入侵和外部環(huán)境壓力，調(diào)整內(nèi)部細(xì)菌個(gè)體協(xié)同代謝和遺傳物質(zhì)橫向傳遞等方面，起著非常重要的作用。細(xì)菌的這種群體合作的行為，賦予了很多細(xì)菌個(gè)體所不具備的特殊功能，如近些年發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌生物膜抵抗外來抗生素的進(jìn)入[4]、促使結(jié)直腸癌的發(fā)生[5]等，在食品加工過程中菌體附著在設(shè)備的濕潤(rùn)拐角處形成生物膜，難以清除，造成設(shè)備腐蝕以及清理成本的增加。生物膜形成量的增加使其厚度增加，溫度傳感器不敏感造成生產(chǎn)過程中的損失。其內(nèi)部調(diào)控機(jī)制成為當(dāng)前學(xué)術(shù)界競(jìng)相研究的熱點(diǎn)，也是近幾年Science、Cell及PNAS等國(guó)際頂級(jí)期刊研究報(bào)道的熱門[6-12]。同時(shí)，生物膜的形成導(dǎo)致細(xì)胞密度過高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限、代謝產(chǎn)物的積累和細(xì)胞的高滲透壓，細(xì)菌也會(huì)承受很大的壓力。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌也可能使用不同的附著機(jī)制來應(yīng)對(duì)這些被修飾過的非生物介質(zhì)，過度地使用表面活性劑也可能使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[13]。因此，研究生物膜具有重要意義。納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto，Bsn)是革蘭氏陽性菌，屬于好氧型細(xì)菌，且具有耐熱以及較強(qiáng)的酸堿穩(wěn)定性，在胃酸的環(huán)境下能夠存活4 h[14]。Bsn不僅能分解大分子物質(zhì)，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等，使發(fā)酵產(chǎn)品中擁有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、寡糖等易被人體吸收的小分子化合物；還能在發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生對(duì)人類有利的代謝產(chǎn)物，如具有凝血功能和治療三高(高血糖、高血壓、高血脂)的維生素K2以及高強(qiáng)溶血栓功能的納豆激酶[15]。因此，Bsn對(duì)于人類的健康起著重要的作用。而且有研究表明，Bsn生物膜的形成與維生素K2和納豆激酶的含量之間具有密切的關(guān)系[16]，更加明確了研究納豆芽孢桿菌生物膜的意義。本文探究了培養(yǎng)條件及表面活性劑的添加對(duì)Bsn生物膜形成的影響，為研究其他革蘭氏陽性菌生物膜及其致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

目前，對(duì)于生物膜的研究多集中在革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌和銅綠假單胞菌等，但是對(duì)于Bsn生物膜的研究卻鮮有報(bào)道，尤其是關(guān)于生物膜形成的調(diào)控因素研究。文章通過在不同溫度、pH值[17]以及幾種具有代表性的表面活性劑[13]對(duì)Bsn形成生物膜的能力進(jìn)行分析，明確Bsn生物膜的形成條件，并且闡述不同代表類型的表面活性劑對(duì)生物膜形成的影響特性，從而為研究生物膜奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)CGMCC2108，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

培養(yǎng)基：LB固體瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptose soya broth, TSB)。

試劑：0.1 g/100 mL結(jié)晶紫染液、33%體積分?jǐn)?shù)乙酸、PBS緩沖液、葡萄糖、NaCl、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、檸檬酸二銨、苯扎溴銨，上海生工生物有限公司。

雙層振蕩培養(yǎng)箱，知楚儀器；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5。固體培養(yǎng)基即加入2 g/L的瓊脂粉。

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨17、大豆木瓜蛋白酶消化物3、NaCl 5、K2HPO42.5、葡萄糖2.5。

1.2.2 納豆芽孢桿菌菌種活化及培養(yǎng)

從-80 ℃的冰箱中取出1管菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，挑取單菌落于裝有30 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h，吸取2 mL轉(zhuǎn)接至50 mL TSB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.3 改良微孔板法

以有蓋的24孔板為載體，每孔中加入300 μL的菌液，然后加入2.5 mL的新鮮TSB培養(yǎng)基，3個(gè)重復(fù)孔，并且以空TSB培養(yǎng)基作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)72 h定量測(cè)定生物膜。首先緩慢移除每孔中的培養(yǎng)物，然后用PBS緩沖液清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，自然干燥后加入3 mL 0.1 g/mL的結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色20 min，再用PBS進(jìn)行緩慢沖洗，直至流出無色為止，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入3 mL體積分?jǐn)?shù)33%乙酸進(jìn)行脫色15 min，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570 nm的值衡量生物膜的多少。

OD570 nm是用來反映生物膜與非生物介質(zhì)表面黏附的牢固程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較分析參考文獻(xiàn)所述方法，即：以只有TSB培養(yǎng)基的對(duì)照孔的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差(ODc)與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較，來表示生物膜的黏附等級(jí)： OD≤ODc為無黏附(-)，ODc4ODc為強(qiáng)黏附(+++)[14]。

1.2.4 納豆芽孢桿菌生物膜形成時(shí)間篩選

將活化培養(yǎng)之后的菌液加入TSB培養(yǎng)基中，平行3次，37 ℃分別在12、24、36、48、60、72、84、96 h之后從恒溫培養(yǎng)箱中拿出，按照1.2.3的方法測(cè)定，拍照記錄。

1.2.5 培養(yǎng)基pH對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

在確定生物膜形成的最佳時(shí)間后，配制不同pH值(5、6、7、8)的TSB培養(yǎng)基，每個(gè)水平3個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)72 h，按照1.2.3的方法測(cè)定。

1.2.6 葡萄糖和NaCl的含量對(duì)納豆芽孢桿菌成膜的影響

配制含有不同質(zhì)量濃度的葡萄糖(0、1、3、5 g/100 mL)和NaCl(0、1、3、5 g/100 mL)排列組合的TSB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)72 h后，按照1.2.3的方法進(jìn)行菌株的成膜性能比較。

1.2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

確定生物膜形成的最適pH值后，分別在不同的溫度(16、30、37、42 ℃)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，平行3次，按照1.2.3的方法進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2.8 不同表面活性劑對(duì)納豆芽孢桿菌成膜能力的影響

選擇不同類型的表面活性劑：陽離子型的十六烷基三乙基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)、陰離子型的SDS、兩性離子型的檸檬酸二銨以及非離子型的聚乙二醇-200(polyethylene glycol-200,PEG-200)。配制上述不同濃度表面活性劑(表1)的母液加入24孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)平行，以不加表面活性劑的TSB培養(yǎng)基為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)72 h，測(cè)定生物膜形成量。

表1 不同類型表面活性劑加入培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度Table 1 The mass concentration of different surfactantsadded into the medium

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生物膜形成最佳時(shí)間的確定

生物膜的形成是一個(gè)有序過程，主要涉及細(xì)胞-介質(zhì)表面、細(xì)胞-胞外聚合物、細(xì)胞-細(xì)胞之間的互作，形成過程包括細(xì)菌在介質(zhì)表面的黏附、細(xì)菌集聚和微菌落發(fā)育以及生物膜的成熟與解離3個(gè)階段。

由圖1可知，在0～72 h之間，生物膜產(chǎn)生量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，72 h生物膜產(chǎn)生量到達(dá)最高，隨后生物膜產(chǎn)生量下降，胞外聚合物的產(chǎn)生能夠促進(jìn)生物膜剛性結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，尤其是胞外多糖的產(chǎn)生。36、48、60、72 h處于氣液界面的生物膜都很容易挑起，但在72 h生物膜的黏附量最大；在12、24、84、96 h時(shí)生物膜松散甚至不完整，容易受到外界的影響重新變回浮游狀態(tài)。因此，36～72 h之間Bsn的生物膜處于菌體聚集和發(fā)育的穩(wěn)定階段；0～24 h之間處于初始的黏附階段；72 h之后生物膜成熟并且解離進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。

圖1 不同時(shí)間下納豆芽孢桿菌生物膜的形成Fig.1 Formation of Bsn biofilms at different times

2.2 pH值對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

由圖2可知，在不同pH值的條件下，生物膜形成具有較大的差異，pH值為7時(shí)生物膜形成量最多，可能是因?yàn)?為Bsn生長(zhǎng)的最適pH值，生長(zhǎng)代謝旺盛，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)，菌體能夠在此條件下由原來的單細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂亩嗉?xì)胞狀態(tài)，是生物膜形成的重要條件之一；但是pH值為5時(shí)生物膜基本無黏附，在試驗(yàn)記錄過程中，前期并沒有生物膜形成，浮游的單細(xì)胞并沒有耐酸環(huán)境的能力；并且酸性環(huán)境會(huì)減弱細(xì)胞與物體表面的黏合力，導(dǎo)致生物膜產(chǎn)生量大幅降低。有趣的是，在72 h之后形成成熟的生物膜，然后測(cè)定不同初始pH值條件下菌液的pH值，發(fā)現(xiàn)pH值都維持在8.45左右，初步推測(cè)是Bsn產(chǎn)生生物膜，其胞外聚合物使pH值升高，但具體機(jī)制尚不明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

圖2 不同pH對(duì)Bsn生物膜形成的影響及其72 h之后菌液的pH值Fig.2 Effect of different pH values on biofilm formationof Bsn and pH value of bacteria solution after 72 h

2.3 不同質(zhì)量濃度的葡萄糖和NaCl條件下納豆芽孢桿菌生物膜的形成

由表2可知，在37 ℃、葡萄糖質(zhì)量濃度為0、NaCl質(zhì)量濃度為1、3 g/100 mL的條件下以及NaCl質(zhì)量濃度為5 g/100 mL, 葡萄糖質(zhì)量濃度為0、1、5 g/100 mL的條件下都能夠使生物膜黏附。比較葡萄糖和NaCl單獨(dú)作用和葡萄糖和NaCl聯(lián)合作用(表2)的結(jié)果來看，Bsn在葡萄糖和NaCl聯(lián)合作用的情況下生物膜的形成率最高。我們將Mn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Na+以1.0 g/L的質(zhì)量濃度加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行生物膜的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Na+存在的情況下生物膜的形成量最佳，Mg2+次之(圖3)。

表2 不同葡萄糖和NaCl含量下納豆芽孢桿菌生物膜的形成Table 2 Formation of Bsn biofilms at different glucoseand salt concentrations

注：括號(hào)中為測(cè)定生物膜時(shí)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)OD570nm的平均值

圖3 不同離子對(duì)Bsn生物膜形成的影響Fig.3 Effectof different ions on biofilm formation of Bsn

NaCl作為一種無機(jī)鹽，能夠維持細(xì)胞正常的滲透壓。納豆芽孢桿菌對(duì)高鹽的耐受性[18]使其能夠在5 g/100 mL的NaCl環(huán)境中存活, Na+的存在能夠使細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更加完整,但是過高或者過低的Na+質(zhì)量濃度均會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng), 生物膜結(jié)構(gòu)可能會(huì)隨鹽濃度的增加而逐漸解體, 膜密度變得疏松, 胞外多糖減少而不能使生物膜與非生物介質(zhì)進(jìn)行黏附。靳嘉巍等[19]的研究表明葡萄糖對(duì)表皮葡萄球菌的生物膜形成具有誘導(dǎo)作用, 主要是通過誘導(dǎo)其相關(guān)基因的表達(dá)從而使生物膜產(chǎn)生量增加。但生物膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程, 不同的外界環(huán)境條件具有不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

2.4 溫度的不同對(duì)納豆芽孢桿菌形成生物膜的影響

TONE等[20]研究表明溫度對(duì)生物膜的影響與葡萄糖和NaCl有關(guān)。由圖4可知，在不同溫度、葡萄糖和NaCl的質(zhì)量濃度的一系列組合下，Bsn的生物膜形成具有復(fù)雜性和多樣性。不同的溫度對(duì)Bsn生物膜產(chǎn)生的影響顯著，隨著溫度的升高，生物膜有不斷上升的趨勢(shì)，但在42 ℃時(shí)生物膜的量出現(xiàn)下降，空氣干燥不利于生物膜的生長(zhǎng)；16 ℃時(shí)生物膜形成量較少，且菌體沉淀在24孔板底部，低溫條件下，菌體生長(zhǎng)和代謝緩慢，運(yùn)動(dòng)能力急劇下降，因此低溫抑制生物膜的形成。且在37 ℃條件下成膜能力最強(qiáng)，較高的溫度不利于生物膜的形成。

圖4 不同溫度下葡萄糖和NaCl的含量對(duì)Bsn生物膜的影響Fig.4 Effect of glucose and NaCl concentrations onbiofilm formation of Bsn at different temperatures

2.5 表面活性劑對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜的影響

分子中具有親水基與疏水基，能富集(吸附)于界面，使界面性質(zhì)發(fā)生顯著改變而出現(xiàn)界面活性的物質(zhì)稱為表面活性劑。常用的表面活性劑為低分子量化合物，應(yīng)用于生物膜抗菌劑、藥物載體與控制釋放、生物模擬、聚合物L(fēng)B膜、乳液聚合等的研究。由于表面活性劑類型多樣導(dǎo)致作用不一，因此，本文選擇陰離子型、陽離子型、非離子型和兩性離子型的表面活性劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),探究表面活性劑對(duì)Bsn生物膜的影響。為了確定不同的表面活性劑對(duì)Bsn的生物量沒有顯著影響，因此在把菌液加入24孔板前測(cè)定了加入1.0 g/L不同表面活性劑的Bsn的生長(zhǎng)曲線，如圖5所示，在沒有形成生物膜之前，加入表面活性劑菌體的生物量沒有明顯的變化。

圖5 加入不同的表面活性劑后Bsn的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of Bsn after adding different surfactants

2.5.1 檸檬酸二銨對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖6可知，隨著檸檬酸二銨質(zhì)量濃度的增加，生物膜的形成反而降低，但是在0.8 g/L時(shí)生物膜形成量達(dá)到最高，但當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.8 g/L，生物膜形成量又下降。佘鵬飛等[21]研究表明，兩性離子化合物使銅綠假單胞菌的生物膜厚度和尺寸減小。DESROSIERS等[22]通過菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)檸檬酸兩性離子型表面活性劑使金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的菌落數(shù)明顯減少，同時(shí)，激光共聚焦顯微鏡顯示，其生物膜的覆蓋率也明顯下降?？赡苁且?yàn)闄幟仕岫@是一種兩性離子表面活性劑，在溶液中有兩種離子形態(tài)，在低濃度或者高濃度時(shí)能夠與胞外聚合物中的鈣離子橋結(jié)合，從而降低胞外聚合物的穩(wěn)定性，使Bsn生物膜形成量減少。

2.5.2 SDS對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜的影響

如圖6所示，SDS對(duì)Bsn的生長(zhǎng)具有很大的影響。即使在0.2 g/L的低濃度下也不能使菌體正常生長(zhǎng)，生物膜也基本無黏附。BOO等[23]的研究表明，陰離子抗菌劑更容易改變細(xì)胞膜的通透性，滲透到細(xì)胞中。產(chǎn)生此類現(xiàn)象的原因可能是SDS是一種陰離子表面活性劑，能夠進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部，對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的穿透力，可使細(xì)胞膜崩解，與膜蛋白疏水部分結(jié)合并使其與膜分離，高濃度SDS可破壞蛋白質(zhì)中的離子鍵和氫鍵等共價(jià)鍵，甚至改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及使胞外聚合物中的蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致生物膜不能形成或者解散脫落。

圖6 不同檸檬酸二銨和SDS質(zhì)量濃度對(duì)Bsn生物膜形成的影響Fig.6 Effect of different diammonium citrate and SDSconcentrationson biofilm formation of Bsn

2.5.3 CTAB對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖7可知，在所設(shè)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，生物膜產(chǎn)生量具有先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)CTAB的質(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，生物膜量到達(dá)峰值，之后又隨著質(zhì)量濃度的增加而降低，但是依然比對(duì)照組要高。MULCAHY等[24]研究發(fā)現(xiàn)eDNA能誘導(dǎo)銅綠假單胞菌陽離子抗菌肽耐藥性操縱子PA3552 PA3559的表達(dá)，從而使對(duì)陽離子抗菌劑的耐藥性增加2 560倍。eDNA是生物膜胞外聚合物的重要組分之一，穩(wěn)定生物膜的空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)菌體的聚集和生物膜的黏附。促進(jìn)生物膜的形成可能是因?yàn)镃TAB是一種常用的陽離子型表面活性劑，能在低濃度時(shí)與胞外聚合物中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用，增加細(xì)胞膜的通透性，使胞外聚合物分泌增多，尤其是eDNA的含量；但在高濃度時(shí)，長(zhǎng)鏈烷基能夠刺穿細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌體死亡，生物膜產(chǎn)生量下降。在加入2.0 g/L CTAB之后OD570nm稍微出現(xiàn)上升，查閱文獻(xiàn)[25]發(fā)現(xiàn),CTAB處理后存活的細(xì)菌細(xì)胞使生物膜得以再生和恢復(fù)，同時(shí)CTAB對(duì)生物膜的恢復(fù)似乎沒有抑制作用，雖然使生物膜的穩(wěn)定狀態(tài)受到了影響，但是生物膜也可以通過不同的方式恢復(fù)到新的穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5.4 PEG-200對(duì)納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖7可知，PEG-200對(duì)Bsn生物膜的影響在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)達(dá)到最高，低于或高于這個(gè)質(zhì)量濃度時(shí)都會(huì)使生物膜的產(chǎn)生量降低。PEG-200是一種非離子型表面活性劑，即在水溶液中不電離，不會(huì)產(chǎn)生離子；具有潤(rùn)濕、乳化等特性。EDGAR等[26]認(rèn)為非離子型表面活性劑在高濃度時(shí)能夠抵抗細(xì)菌黏附，因?yàn)槭杷鶊F(tuán)能產(chǎn)生很大的排斥體積和反滲透壓，影響生物膜形成過程中高聚物的形成，從而影響生物膜的形成和穩(wěn)定性。所以在大于1.0 g/L的質(zhì)量濃度之后，生物膜的產(chǎn)生量會(huì)下降，抑制生物膜的形成。但在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)能夠促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生，可能是因?yàn)镻EG-200能夠提供濕潤(rùn)的環(huán)境，適宜生物膜的生長(zhǎng)，另一方面是表面活性劑增加細(xì)胞膜的透性，使胞外聚合物的含量提高，促進(jìn)生物膜的黏附。

圖7 不同CTAB和PEG-200質(zhì)量濃度對(duì)Bsn生物膜形成的影響Fig.7 Effect of different CTAB and PEG-200 concentrat-ionson biofilm formation of Bsn

3 結(jié)論

目前，控制生物膜形成的策略有2大類：一是通過修飾改變表面性質(zhì)和表面活性劑來防止細(xì)菌的黏附和生物膜的形成；二是利用物理力、酶等消除或者破壞已經(jīng)形成的生物膜。本文通過采用結(jié)晶紫染色法確定Bsn生物膜形成最佳時(shí)間以及在不同溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件和不同類型的表面活性劑對(duì)Bsn的生物膜產(chǎn)生的影響進(jìn)行分析，篩選了檸檬酸二銨、SDS、CTAB、PEG-200這4種表面活性劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)條件為37 ℃、pH為7、1 g/100 mL NaCl、3 g/100 mL NaCl、5 g/100 mL NaCl、1 g/100 mL 葡萄糖-5 g/100 mL NaCl、3 g/100 mL 葡萄糖-5 g/100 mL NaCl、5 g/100 mL葡萄糖-5 g/100 mL NaCl條件下都能夠形成生物膜，且在37 ℃，培養(yǎng)72 h條件下，5 g/100 mL葡萄糖-5 g/100 mL NaCl成膜能力最佳。適當(dāng)?shù)柠}濃度和高溫促進(jìn)生物膜的形成，檸檬酸二銨的質(zhì)量濃度為0.8 g/L時(shí)能夠促進(jìn)生物膜的形成，PEG-200在1.0 g/L時(shí)可以促進(jìn)生物膜的形成，低于或高于這個(gè)濃度都會(huì)抑制生物膜的產(chǎn)生量，CTAB對(duì)Bsn生物膜的影響是先升高后降低，但都比對(duì)照組的生物膜產(chǎn)生量高，在0.4 g/L時(shí)達(dá)到最大值，此外，SDS對(duì)Bsn生物膜的形成具有很強(qiáng)的抑制作用。本研究結(jié)果能夠?yàn)锽sn的生物膜研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)在控制其生物膜的形成方面具有借鑒意義。