馬榕禎，吳 巖，陳秀菊，黃 璠，左 茜，丁巧峰，白金金，陳魯平，馮建宇

膿毒癥是一種由感染引起的致命綜合征，據(jù)報道在美國每年因膿毒癥死亡人數(shù)達20萬，其病理生理特征包括炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙和凝血障礙等［1］。眾所周知，免疫抑制是晚期膿毒癥患者死亡的主要原因。此外，值得注意的是，膿毒癥早期因炎癥反應(yīng)引起的感染性休克也是膿毒癥患者死亡的重要原因［2］。膿毒癥心肌病是因病原體感染引起的心肌病變，嚴重者可導(dǎo)致心衰、心律失常和心源性休克等。一項回顧性隊列研究報道，膿毒癥心肌病在膿毒癥和敗血癥性休克患者中發(fā)生率約為13.8%，且與膿毒癥患者預(yù)后密切相關(guān)［3］。因此，尋找有效心肌保護藥物減輕膿毒癥心肌病對于改善膿毒癥患者預(yù)后具有非常重要的臨床意義。

姜黃素（Curcumin，Cur），又稱為 1，7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1，6-庚二烯-3，5-二酮，是姜黃根莖中最主要的多酚成分，是治療咳嗽、鼻竇炎、哮喘、腹痛、風濕病、糖尿病等疾病傳統(tǒng)中藥的主要成分之一［4］。近些年來，Cur的心肌保護作用也越來越受到重視。Cur可減輕多柔比星引起的心臟毒性［5］、異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血和纖維化［6］、壓力負荷引起的心肌肥厚和慢性心肌衰竭［7］、糖尿病引起的心肌纖維化反應(yīng)［8］等。此外，也有研究表明，Cur能減輕脂多糖和盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP） 誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損害［9-10］。但是Cur抵抗膿毒癥心肌損害的具體分子機制尚未完全闡明。沉默信息調(diào)控因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）依賴的具有組蛋白去乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［11］。以往研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1是介導(dǎo)Cur心肌保護作用的關(guān)鍵性下游分子［12-13］。據(jù)此，筆者推測Cur可能通過激活SIRT1信號通路改善膿毒癥引起的心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 ①8～10 周齡 C57BL／6 小鼠（SPF級）購買自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于室溫環(huán)境，給予自由飲食飲水。②主要試劑。Cur（貨號：C1386）和 SIRT1特異性抑制劑 Sirtinol（貨號：S7942）購買自Sigma公司（美國）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（ma?londialdehyde，MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性檢測試劑盒購買自南京建成生物工程研究所（中國）；抗SIRT1（貨號：ab110304）和 Ac-p53（貨號：ab61241）抗體購買自Abcam 公司（美國）；抗 Bax（貨號：2772）、Bcl-2（貨號：3498）、Caspase 3（貨號：9662）和 β-actin（貨號：58169）抗體購買自CST公司（美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立 通過CLP法建立膿毒癥小鼠模型。具體建模方法參照Yu等［14］所述方案。簡言之，采用腹部小切口，在盲腸末端1 cm處用2-0絲線結(jié)扎盲腸，然后用23號針穿刺兩次。向腹腔內(nèi)擠壓少量糞便。然后用3-0絲線縫合腹部切口。假手術(shù)小鼠進行相同處理，但不進行CLP。

1.2.2 實驗分組及給藥方式 實驗小鼠隨機分組如下：假手術(shù)組（Sham組，n＝15）：小鼠假手術(shù)前3 d每日通過灌胃給予生理鹽水（0.2 ml），共灌胃3 d，隨后進行假手術(shù)處理；Cur預(yù)處理組（Cur組，n＝15）：小鼠假手術(shù)前3 d每日通過灌胃給予Cur（100 mg／kg），共灌胃3 d天，隨后進行假手術(shù)處理；CLP組（CLP組，n＝15）：小鼠CLP前3 d每日通過灌胃給予生理鹽水（0.2 ml），共灌胃 3 d，隨后進行 CLP；Cur預(yù)處理＋CLP 組（Cur＋CLP 組，n＝15）：小鼠 CLP前3 d每日通過灌胃給予 Cur（100 mg／kg），共灌胃3 d，隨后進行 CLP；Sirtinol預(yù)處理＋Cur預(yù)處理＋CLP組（Sirtinol＋Cur＋CLP 組，n＝15）：小鼠CLP 前3 d每日給予 Cur（灌胃，100 mg／kg）和 Sirtinol（腹腔注射，5 mg／kg），共處理 3 d，隨后進行 CLP；Sirtinol預(yù)處理＋CLP 組（Sirtinol＋CLP 組，n＝15）：小鼠 CLP 前 3 d每日給予 Sirtinol（腹腔注射，5 mg／kg），共處理 3 d，隨后進行CLP。

1.2.3 心肌收縮舒張功能檢測 CLP手術(shù)后48 h，通過 Millar導(dǎo)管技術(shù)（SPR-839，Millar Instruments公司）檢測心臟收縮與舒張功能。簡而言之，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉小鼠，并用小動物呼吸機（Minivent，Harvard Apparatus公司）輔助呼吸，潮氣量為 0.1～0.2 ml，呼吸頻率為 110～120 次／min。頸部正中切開皮膚，分離右頸總動脈，將1.4 Fr軟導(dǎo)管從右頸總動脈逆行插入左心室以測量心臟功能。用 PVAN 3.4軟件（Millar Instruments公司）計算左心室內(nèi)壓最大上升速率（＋dp／dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp／dtmax）。心臟功能分析完成后，取出心臟并用預(yù)冷的PBS清洗心臟2 min以除去剩余的血液。部分心臟組織固定于10%福爾馬林以備TUNEL染色，部分心臟儲藏在-80℃冰箱以備蛋白表達以及氧化應(yīng)激損傷指標檢測。

1.2.4 心肌組織凋亡率檢測 將固定于10%福爾馬林中的心臟組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，固定于切片機上，切成5 μm厚的石蠟切片。石蠟切片再經(jīng)脫蠟、至水后，根據(jù)試劑盒說明書，通過原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL）技術(shù)檢測心肌組織石蠟切片中的凋亡細胞。使用熒光顯微鏡拍照后計算心肌細胞凋亡率。

1.2.5 心肌組織氧化應(yīng)激指標檢測 從-80℃冰箱內(nèi)取出心臟組織，并勻漿為1／10濃度的組織蛋白液。根據(jù)試劑盒說明書所述步驟，分別檢測MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6 Western Blotting 檢測 SIRT1 信號通路和凋亡關(guān)鍵蛋白表達情況 將心肌組織勻漿后提取蛋白，然后煮沸10 min以使蛋白質(zhì)變性。將蛋白樣品用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）進行電泳，然后在200 mA恒流條件下將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移2 h至硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，在 4℃下孵育抗SIRT1、Ac-p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3 和 β-actin 抗體過夜。然后，將硝酸纖維素膜與二抗在室溫下孵育1 h，并用ECL化學發(fā)光液顯示蛋白條帶。使用Image J圖像分析系統(tǒng)（NIH，美國）半定量蛋白表達情況。β-actin作為Western Blotting內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計分析軟件為Graphpad prism 5，所有定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析對兩組以上的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組間比較用 LSD-t檢驗。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cur預(yù)處理改善膿毒癥引起的小鼠心臟收縮舒張功能障礙 如圖1A所示，與Sham組相比，CLP組小鼠＋dp／dtmax明顯降低，提示膿毒癥小鼠心肌收縮功能明顯受損（P＜0.05）。與CLP組小鼠相比，Cur預(yù)處理可以明顯提高＋dp／dtmax，提示Cur可以明顯改善膿毒癥小鼠心肌收縮功能（P＜0.05）。如圖1B所示，與Sham組相比，CLP組小鼠-dp／dtmax明顯降低，提示膿毒癥小鼠心肌舒張功能也明顯受損（P＜0.05）。 與CLP組小鼠相比，Cur預(yù)處理可以明顯提高-dp／dtmax，提示Cur可明顯改善膿毒癥小鼠心肌舒張功能（P＜0.05）。與Sham組相比，單純給予 Cur預(yù)處理對于＋dp／dtmax和-dp／dtmax和均無明顯影響，即Cur不影響正常小鼠的心肌收縮與舒張功能（P＞0.05）。

2.2 Cur預(yù)處理明顯減輕膿毒癥引起的小鼠心臟氧化應(yīng)激損傷 與Sham組小鼠相比，CLP組小鼠心肌組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增加，而心肌抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性明顯降低（P＜0.05）。與CLP組相比，Cur預(yù)處理可以明顯降低心肌組織MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性（P＜0.05）。單純給予正常小鼠Cur不影響心肌組織MDA含量以及SOD和 GSH-Px活性（P＞0.05，見圖1 C～E）。

2.3 Cur預(yù)處理抑制膿毒癥引起的小鼠心肌凋亡與Sham組小鼠相比，CLP組小鼠心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表達水平明顯增加，而心肌Bcl-2的表達水平明顯降低（P＜0.05）。與CLP組相比，Cur預(yù)處理可以明顯降低心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表達水平，提高 Bcl-2的表達水平（P＜0.05）。單純給予正常小鼠Cur不影響心肌組織凋亡率、Bax、Bcl-2和 Caspase 3的表達水平（P＞0.05，見圖1 F～J）。

2.4 Cur預(yù)處理激活膿毒癥小鼠心肌組織SIRT1信號通路 與Sham組小鼠相比，CLP組小鼠心肌SIRT1的表達量明顯降低，而SIRT1下游分子p53的乙?；矫黠@增加（P＜0.05）。與CLP組相比，Cur預(yù)處理可以明顯提高心肌SIRT1的表達量，降低Ac-p53的表達量（P＜0.05）。單純給予正常小鼠Cur對心肌組織SIRT1和Ac-p53的表達水平無顯著影響（P＞0.05，見圖1 K～L）。

2.5 Sirtinol減弱Cur對膿毒癥小鼠心臟功能的保護作用 與 Cur＋CLP 組相比，Sirtinol＋Cur＋CLP 組小鼠＋dp／dtmax和-dp／dtmax均明顯降低，即 Sirtinol可以減弱Cur對膿毒癥小鼠心臟收縮和舒張功能的保護作用（P＜0.05）。 與 CLP 組相比，給予 Sirtinol預(yù)處理對于＋dp／dtmax和-dp／dtmax均無明顯影響，即Sirtinol不影響膿毒癥小鼠的心肌收縮與舒張功能（P＞0.05，見圖 2 A～B）。

2.6 Sirtinol減弱Cur抗氧化應(yīng)激損傷和抗凋亡作用 與 Cur＋CLP 組相比，Sirtinol＋Cur＋CLP 組小鼠心肌MDA含量明顯增加，而SOD和GSH-Px的活性明顯降低（P＜0.05）。 此外，與 Cur＋CLP 組相比，Sirtinol＋Cur＋CLP組小鼠心肌凋亡率、Bax和Caspase 3的表達水平明顯增加，而心肌Bcl-2的表達水平明顯降低（P＜0.05）。與CLP組相比，單純給予Sirtinol預(yù)處理對于MDA含量、SOD和GSHPx活性、凋亡率、Bax、Bcl-2和Caspase 3的表達水平均無明顯影響（P＞0.05，見圖2 C～J）。

3 討 論

膿毒癥的主要致命后果之一是心臟功能出現(xiàn)障礙［15］，因此膿毒癥患者生存的重要預(yù)測因素之一是心肌功能障礙的恢復(fù)情況［16］。在該研究中，筆者發(fā)現(xiàn)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥對動物心臟收縮與舒張功能均造成嚴重損傷，表現(xiàn)為＋dP／dtmax和-dP／dtmax明顯降低。膿毒癥發(fā)生前給予Cur可通過減少心肌組織氧化應(yīng)激損傷和抑制細胞凋亡來預(yù)防膿毒癥誘發(fā)的心功能障礙。此外，Cur預(yù)處理可以明顯增強心肌中SIRT1的表達和活性，而抑制SIRT1信號通路可以明顯減弱Cur的心肌保護作用。

圖1 Cur預(yù)處理對膿毒癥小鼠心臟功能、氧化應(yīng)激、凋亡以及SIRT1信號通路的影響

Cur是在姜黃中發(fā)現(xiàn)的一種膳食多酚，近年來，越來越多的證據(jù)顯示Cur是一種重要的心肌保護藥物。Zhang等［5］發(fā)現(xiàn)，給予荷瘤小鼠 Cur與多柔比星共處理，一方面可以增加多柔比星的抗腫瘤效果，另一方面也可減輕多柔比星引起的心臟毒性。Al?lawadhi等［6］證實，Cur處理可以明顯減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟毒性、心肌缺血和心臟纖維化。Liu等［17］發(fā)現(xiàn)，Cur可以通過抑制炎癥反應(yīng)改善心肌缺血再灌注損傷。此外，Cur對于膿毒癥引起的心肌損害也發(fā)揮了保護作用［9-10］，但具體機制尚未完全闡明。

膿毒癥患者心肌細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯受損，出現(xiàn)線粒體功能障礙。線粒體功能障礙在膿毒癥的發(fā)病中起重要作用，且其程度與膿毒癥的預(yù)后密切相關(guān)［18］。當線粒體功能障礙持續(xù)時，心肌細胞將產(chǎn)生過量ROS，而ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激繼而引起線粒體損傷，加劇線粒體功能障礙［19］。近年來，越來越多證據(jù)顯示應(yīng)用抗氧化劑可以預(yù)防線粒體異常，改善膿毒癥心功能障礙并降低死亡率。Huang等［20］證實，丹參酮IIA通過抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶2相關(guān)信號通路減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的心功能障礙。Chen等［21］發(fā)現(xiàn)，紅景天甙治療可以通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生減輕膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)，從而改善脂多糖引起的心臟功能障礙。Cur是一種重要的天然抗氧化劑，其抗氧化應(yīng)激作用主要表現(xiàn)為：①上調(diào)內(nèi)源性抗氧化途徑，包括SOD、GSH-Px和過氧化氫酶等；②抑制ROS的產(chǎn)生，消除ROS，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量；③改善線粒體功能，特別是維持線粒體氧化還原電位［13，22］。 與此一致的是，在該研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，Cur可明顯增強膿毒癥小鼠心肌抗氧化酶SOD和GSH-Px活性。相反，Cur明顯降低氧化應(yīng)激標記物MDA的含量。以往研究證實，線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)量的增加可以通過激活線粒體途徑凋亡信號通路，進而引起心肌細胞發(fā)生凋亡，損害心臟功能［23］。而抑制凋亡途徑的激活也是減輕膿毒癥心肌損傷的重要方式［24］。該研究證實，Cur預(yù)處理可以明顯降低膿毒癥小鼠心肌凋亡率以及促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表達水平，提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。以上結(jié)果說明，Cur可通過抑制心肌氧化應(yīng)激損傷和凋亡改善膿毒癥引起的心肌損害。

圖2 SIRT1特異性抑制劑Sirtinol預(yù)處理對膿毒癥小鼠心臟功能、氧化應(yīng)激和凋亡的影響

SIRT1是NAD＋依賴的具有組蛋白去乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過去乙?；喾N靶蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和衰老等多種生理病理過程［25］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1信號通路受損是介導(dǎo)膿毒癥心肌損害的關(guān)鍵機制之一，而激活SIRT1信號通路有望成為膿毒癥心肌損傷防治的重要策略。 Han 等［26］發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，SIRT1-／-小鼠CLP后，死亡率明顯增加，心肌損傷明顯加重。而用T0901317激活SIRT1信號通路后，心肌炎性分子表達、氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡均受到明顯抑制。Hong等［27］證實，煙酰胺核糖可以通過激活SIRT1信號通路抑制心臟組織中氧化應(yīng)激損傷、炎癥和Caspase 3活性，從而改善脂多糖引起的心肌損傷。該研究中筆者發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，CLP組小鼠心肌SIRT1信號通路明顯受損。而Cur預(yù)處理可以激活膿毒癥小鼠心肌SIRT1信號通路。用Sirtinol抑制SIRT1信號通路后，Cur改善心臟功能障礙、氧化應(yīng)激損傷和凋亡的作用均明顯減弱。

綜上所述，Cur預(yù)處理可以通過激活SIRT1信號通路抑制心肌組織氧化應(yīng)激損傷和凋亡，改善膿毒癥引起的心肌損害。該研究對于促進Cur在膿毒癥心肌病防治方面的臨床應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。