王雨露， 許笑陽， 俞曉菡， 平 鍵,1b,2,3， 趙長青,1b,2,3

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a.肝病研究所； b.肝二科， 上海 201203； 2 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 3 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203

肝細(xì)胞癌(HCC)為最常見的原發(fā)性肝癌，是全球第六大惡性腫瘤。大多數(shù)HCC發(fā)生在肝硬化患者中，全世界高達(dá)80%的肝癌歸因于HBV、HCV感染。而在病毒感染率較低的西方國家，與酒精有關(guān)的肝病和非酒精性脂肪肝成為導(dǎo)致HCC的主要原因[1]。其他危險(xiǎn)因素包括黃曲霉毒素、肥胖、原發(fā)性膽汁性肝硬化等[2-4]。HCC常在晚期時(shí)被發(fā)現(xiàn)，其惡性程度高，浸潤和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，因此被列為最致命的癌癥之一。目前HCC的治療包括外科手術(shù)方面取得了一些進(jìn)展，但由于其發(fā)生缺乏可靠的生物標(biāo)志物，且異質(zhì)性遺傳和表觀遺傳學(xué)改變均不明確，預(yù)后不良，患者術(shù)后5年生存率仍難以令人滿意。在這種難治性惡性腫瘤發(fā)病率穩(wěn)步上升的背后，能否早期診斷與及時(shí)治療對取得遠(yuǎn)期療效具有重要意義。氧化應(yīng)激學(xué)說是HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的重要學(xué)說之一，證據(jù)顯示自噬在HCC中發(fā)揮重要作用，且與氧化應(yīng)激關(guān)系緊密。但二者在HCC中相互調(diào)節(jié)的機(jī)制至今尚未十分明確。本文主要對近年來氧化應(yīng)激和自噬在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用進(jìn)行綜述。

1 自噬與HCC

自噬是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，指細(xì)胞利用溶酶體，降解自身受損、變性或衰老的大分子物質(zhì)，以及細(xì)胞器的自我消化過程。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬后，在自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)下，細(xì)胞通過單層或雙層膜，包裹待降解的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器，形成囊泡狀的自噬體。自噬體再與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體，由溶酶體內(nèi)的一系列水解酶，降解其內(nèi)所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝和能量更新[5]。

自噬誘導(dǎo)的Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡，除了在正常條件下能夠維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，還在幫助細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的防御機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在機(jī)體能量不足或其他壓力條件下，通過自我降解清除受損細(xì)胞器和有害物質(zhì)，來獲取細(xì)胞生存必須的營養(yǎng)和能量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)成分循環(huán)，以促進(jìn)細(xì)胞存活[6]。相反，自噬失調(diào)則會對人類健康造成嚴(yán)重后果，如壓力過度引發(fā)的自噬會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞失去活性。尤其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬可能影響包括增殖生長和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的所有致病步驟。因此，自噬是一把“雙刃劍”[7]。

自噬在癌癥中亦扮演著雙重角色，既作為抑癌因素抑制腫瘤，也作為促癌因素促進(jìn)腫瘤發(fā)生，參與腫瘤轉(zhuǎn)移[8]。研究[9]認(rèn)為，正常情況下自噬是一種抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制，通過清除受損細(xì)胞器，降低細(xì)胞內(nèi)壓力從而減少癌變；或通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥和免疫反應(yīng)來清除癌細(xì)胞，以阻止癌癥的進(jìn)展；同時(shí)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞自噬能夠抑制腫瘤血管的生成。相反，一旦癌癥發(fā)生，自噬將轉(zhuǎn)為促癌機(jī)制，通過為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)能量和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抵抗放化療能力，來維持腫瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[10-11]。

1.1 自噬對于肝癌的抑制作用 在肝癌中，肝細(xì)胞降解主要依賴自噬，清除過量聚集的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和受損的線粒體，以防止過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成[12]導(dǎo)致氧化應(yīng)激。HCC的進(jìn)展與持續(xù)性炎癥刺激高度相關(guān)，自噬通過抑制炎癥來阻止這種進(jìn)展，而抑制自噬則引起炎癥水平升高。相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)[9,13]顯示，與野生型對照相比，在感染性休克的ATG16L1敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)缺乏自噬反應(yīng)，且與炎癥相關(guān)的IL-1β和IL-18細(xì)胞因子水平升高，這證明了自噬抑制炎癥的能力。另有研究[14]表明，在人肝癌組織中，能夠抑制自噬的趨化因子CXCL17表達(dá)明顯升高，這與肝癌組織學(xué)分期及預(yù)后不良有關(guān)；在體外實(shí)驗(yàn)中，CXCL17的高表達(dá)也能促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，而沉默CXCL17誘導(dǎo)自噬，則發(fā)現(xiàn)腫瘤體積減小伴重量減輕，提示自噬減輕腫瘤發(fā)展。Beclin1是一種與肝癌相關(guān)的自噬蛋白，并與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，Beclin1基因敲除的小鼠在胚胎期致死，而異種Beclin1小鼠則發(fā)展為自發(fā)性肝癌[15]。該蛋白在人肝癌組織中被觀察到表達(dá)下降，比在正常肝細(xì)胞中低，這也提示自噬具備腫瘤抑制作用[16]。一項(xiàng)用腎上腺素治療肝癌小鼠的實(shí)驗(yàn)[17]顯示，腎上腺素通過激活腎上腺素能受體，破壞Beclin1/VPS34/ATg14復(fù)合物來抑制細(xì)胞自噬，引起肝損傷加重，導(dǎo)致腫瘤體積增大伴數(shù)量增多。自噬還被證明有助于增強(qiáng)IFNγ來抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散，IFNγ多向性細(xì)胞因子可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抗病毒和抗增殖，在HCC細(xì)胞中刺激自噬細(xì)胞體形成以抑制細(xì)胞生長。沉默自噬能夠消除IFNγ的抑制作用，這表明自噬具有抗腫瘤活性[18]。

多個(gè)自噬靶向的miRNA包含自噬調(diào)節(jié)基因也可能參與HCC過程。在HCC中，抑癌miR-7水平顯著下調(diào)，其通過上調(diào)靶向mTOR通路增強(qiáng)自噬活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖減少。抑癌miR-185在人肝癌細(xì)胞株HepG2中，通過轉(zhuǎn)染上調(diào)自噬活性，引起細(xì)胞周期阻滯。而miR-375在肝癌細(xì)胞株和組織中均下調(diào)，其通過下調(diào)肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein, ATG)7抑制LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而抑制肝癌細(xì)胞自噬。在miR-375過表達(dá)的裸鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)腫瘤生長速度及大小顯著降低[19]。以上研究為支持自噬對肝癌的抑制作用提供了證據(jù)。

1.2 自噬對于肝癌的促進(jìn)作用 HCC發(fā)生過程中氧化應(yīng)激導(dǎo)致大量ROS堆積，自噬相關(guān)蛋白p62通過激活Keap1/Nrf2系統(tǒng)防御氧化應(yīng)激，參與蛋白聚集螯合及凋亡。相關(guān)研究[20]表明，肝臟中的腫瘤抑制蛋白DDX5與p62結(jié)合，能夠干擾p62/TRAF6的相互作用，從而誘導(dǎo)自噬，DDX5在人肝癌組織中的表達(dá)低于非腫瘤組織，提示自噬引起p62蛋白過度累積，繼而促使肝癌細(xì)胞生長和增殖。低氧誘導(dǎo)的自噬在肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中依賴于缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)1α，其上調(diào)BNIP3及BNIP3L蛋白與BCL-2蛋白的結(jié)合，從而抑制BCL-2和Beclin1之間的相互破壞作用，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以在低氧條件下存活。此外，在人肝癌細(xì)胞株中，低氧誘導(dǎo)的早期生長反應(yīng)基因EGR-1的上調(diào)誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移。自噬還可以通過釋放、降解損傷相關(guān)模式分子來調(diào)節(jié)炎性免疫應(yīng)答，其中自噬介導(dǎo)的高遷移率族蛋白(high mobility group box 1, HMGB1)在壞死或凋亡的肝細(xì)胞中被釋放出來，誘導(dǎo)細(xì)胞存活和調(diào)控凋亡程序。HMGB1的細(xì)胞內(nèi)易位促進(jìn)了其與胞質(zhì)中mtDNA的相互作用，以共同激活TLR9信號通路，促進(jìn)腫瘤生長[21-22]。

自噬在HCC轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了促進(jìn)作用，腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)現(xiàn)自噬的表達(dá)上調(diào)。當(dāng)原發(fā)性腫瘤生長并遭遇惡劣的微環(huán)境時(shí)，部分腫瘤在循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生逃逸，進(jìn)入全身循環(huán)，定位于遠(yuǎn)端器官。另外，自噬能夠引起細(xì)胞黏附信號的改變，引發(fā)癌細(xì)胞侵襲和遷移[23]，HCC的自噬通過上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表達(dá)來促進(jìn)轉(zhuǎn)移。研究[24]表明，通過沉默Beclin1和ATG5抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移模型的自噬，可顯著降低肝癌向肺遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。

2 氧化應(yīng)激與HCC

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞氧化還原失衡，引起過量ROS堆積，或抗氧化能力下降，導(dǎo)致機(jī)體氧化物和抗氧化系統(tǒng)之間失衡而造成的應(yīng)激狀態(tài)。ROS是體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的正常產(chǎn)物，由正常代謝產(chǎn)生或由吸煙、輻射、粉塵等外源因素誘導(dǎo)，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈斷裂，氧化生物膜和組織中的分子，造成損傷。然而，由于機(jī)體能夠在一定程度上清除ROS，低通量ROS介導(dǎo)的氧化還原信號可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖，并發(fā)揮核心作用；高通量ROS則引起靶分子的不可逆改變，從而損傷細(xì)胞，引起氧化還原穩(wěn)態(tài)的持續(xù)失衡，最終致使細(xì)胞死亡[25]。這顯示出保持氧化還原平衡的必要性。

在癌癥中，氧化應(yīng)激水平通常會增加，不同的增殖信號如生長因子受體與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的結(jié)合，引起ROS產(chǎn)生增多[26]。DNA氧化損傷產(chǎn)生的DNA突變和不受控的細(xì)胞增殖屬于典型的ROS致瘤。有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路作為促細(xì)胞增殖和存活的重要通路之一，可通過氧化間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，抑制MAP激酶磷酸酶Mkp3，或抑制MAPK亞家族成員Mkk6[27]。這證實(shí)一系列氧化還原反應(yīng)影響激酶的活性，并參與細(xì)胞增殖相關(guān)通路的調(diào)控，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

肝癌細(xì)胞的高增殖能力和持續(xù)性炎癥，都與氧化應(yīng)激有關(guān)。Nrf2作為氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，在HCC中發(fā)揮重要作用。缺乏Nrf2的小鼠更易受到環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)壓力的影響，導(dǎo)致DNA損傷而促進(jìn)癌癥發(fā)生，激活Nrf2則可抑制腫瘤。在肝癌中，HBV基因組編碼X蛋白(HBx)與線粒體中ROS的增加相關(guān)[28]；體外感染HCV的人肝癌細(xì)胞，和表達(dá)HCV核心蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟，均觀察到氧化DNA損害即8-氧化鳥嘌呤(8-oxyoguanine, 8-oxoG)水平增加[29]，HCV介導(dǎo)的ROS改變線粒體功能；酒精引起的氧化應(yīng)激失衡表現(xiàn)為黃嘌呤氧化酶促進(jìn)ROS[30]；由三酰甘油限速酶釋放的脂肪酸能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體，從而影響抗氧化反應(yīng)，也影響著肝癌的發(fā)展[31]。氧化應(yīng)激一方面直接在DNA上形成8-oxoG或脂質(zhì)過氧化引起畸變，另一方面通過表觀遺傳機(jī)制促進(jìn)肝癌發(fā)生。肝癌細(xì)胞中的位點(diǎn)特異性表觀遺傳學(xué)改變，包括H2O2處理引起的E-cadherin啟動子甲基化，和HBV誘導(dǎo)的線粒體ROS積累而發(fā)生的細(xì)胞因子信號抑制因子SOCS3的甲基化[32]?？偟膩碚f，ROS水平的增加是基因遺傳和表觀遺傳突變及增殖信號的原因，抗氧化劑導(dǎo)致的ROS失衡會引起細(xì)胞死亡。

3 自噬與氧化應(yīng)激的相互作用及其調(diào)控機(jī)制

氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬，也可誘導(dǎo)凋亡或壞死。從細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的角度來看，自噬是對氧化應(yīng)激的一種重要反應(yīng)，ROS又可以通過多種途徑激活自噬(圖1)。Nrf2-Keap1系統(tǒng)是抗氧化應(yīng)激的主要防御機(jī)制之一，HCC中Nrf 2的激活可能是獨(dú)立發(fā)生的，也可能依賴于p62積聚和自噬途徑激活。抗氧化蛋白Nrf2通過自噬上調(diào)，自噬蛋白p62磷酸化后與Nrf2抑制蛋白Keap1結(jié)合，引起Nrf2釋放，Nrf2進(jìn)一步結(jié)合sMaf、JunD、ATF4、ARE形成復(fù)合物來調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)。通過p62的過量積累，Nrf2的持續(xù)激活直接促進(jìn)了腫瘤發(fā)展，證實(shí)自噬誘導(dǎo)抗氧化通路的激活。Nrf2的持續(xù)激活在促進(jìn)自噬缺失的肝腫瘤中起關(guān)鍵作用，這在ATG5肝臟特異性敲除小鼠中亦得到證實(shí)，自發(fā)進(jìn)展為炎癥、肝纖維化和肝臟腫瘤，在沒有Nrf2的情況下這種現(xiàn)象被消除[33]。

ROS介導(dǎo)的自噬與HCC的生存機(jī)制和壓力條件相關(guān)，自噬活性和ROS在缺血再灌注損傷期間均增加，利于HCC細(xì)胞的增殖和存活[34]。自噬抑制ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制是通過自噬去除受損的線粒體，線粒體可以降解腫瘤抑制因子p53，線粒體損傷則導(dǎo)致p53的積累。其選擇性吞噬BCL2相互作用蛋白3(BNIP3)和NIP樣蛋白X(Nix)銜接蛋白，與E3泛素連接酶結(jié)合。隨著營養(yǎng)缺乏，HIF作為缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，能夠促進(jìn)BNIP3和Nix表達(dá)等自噬關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄[35]。Parkin蛋白敲除小鼠肝細(xì)胞增殖模型表明，Parkin蛋白可抑制HCC的發(fā)展。研究[36]發(fā)現(xiàn)，在ROS介導(dǎo)的乙醇致肝癌作用下，Parkin依賴的線粒體被激活。因此，在Parkin敲除的小鼠肝臟中，酒精誘導(dǎo)廣泛的線粒體損傷和氧化應(yīng)激，表現(xiàn)出線粒體自噬。并且在功能障礙線粒體中與乙醇處理大鼠肝臟中積累的8-oxoG呈高度一致性[37]。在慢性酒精性肝損傷中，顯示自噬對CYP2E1依賴性氧化應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)作用[38]。

文獻(xiàn)[39]顯示，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體自噬還可以抑制HCC遷移。相反，過度激活自噬則可能導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡。H2O2介導(dǎo)的ATG4被抑制，不能清除LC3，從而促進(jìn)其與自噬體p62結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)自噬水平增高。此外，ROS還可影響參與自噬的其他信號通路，自噬關(guān)鍵分子mTOR激酶的激活被Akt和MAPK信號通路抑制，蛋白激酶Akt誘導(dǎo)促進(jìn)生存的自噬，維持HCC中p53的降解和核因子NF-κB的表達(dá)[40]；而負(fù)調(diào)控mTOR的通路如對氧化應(yīng)激敏感的蛋白激酶AMPK和p53信號通路促進(jìn)自體吞噬[41]。在應(yīng)激條件下，依賴于ROS的p38的激活，也是抑制癌細(xì)胞自噬激活的必要條件[42]。綜上，自噬與遺傳改變的信號通路PI3K/Akt/mTOR/Ras/Raf/MAP激酶和Wnt-β連環(huán)蛋白通路交互，其中大部分由ROS觸發(fā)。以上進(jìn)一步表明了ROS與自噬之間的復(fù)雜聯(lián)系在受遺傳和慢性環(huán)境損害影響時(shí)可能促進(jìn)HCC進(jìn)展(圖1)。

4 結(jié)語

目前，對肝癌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外不同刺激條件下參與自噬復(fù)雜協(xié)調(diào)反應(yīng)的應(yīng)激信號通路了解甚少。氧化應(yīng)激作為與HCC相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與導(dǎo)致HCC發(fā)病的多種環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素相關(guān)。在氧化應(yīng)激和營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件下，自噬也是與其他應(yīng)激反應(yīng)通路協(xié)調(diào)運(yùn)行的重要途徑，在HCC中扮演雙重角色。自噬對HCC的發(fā)生發(fā)展既有促進(jìn)作用，也有抑制作用，受損的自噬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，增加發(fā)生肝細(xì)胞損傷和癌癥病變的風(fēng)險(xiǎn)。氧化應(yīng)激與自噬的相互作用對HCC的治療效果具有很大影響，通過調(diào)節(jié)p62介導(dǎo)的Nrf2-Keap1這一關(guān)鍵信號通路，自噬直接參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)。p62對Nrf2- keap1通路的交互調(diào)節(jié)作用已被確定為HCC的潛在抗癌治療靶點(diǎn)[43]。進(jìn)一步闡明氧化應(yīng)激與自噬在HCC中的作用機(jī)制還需要更深入的研究，改善腫瘤氧合或抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬信號可能是潛在的治療途徑。