崔家杰，謝強(qiáng)，翟雙雙，龔濤，朱勇文，楊琳，王文策

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州510642）

0 引言

【研究意義】家禽生產(chǎn)受多種環(huán)境因素的影響，光照強(qiáng)度是影響家禽生產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一，光照強(qiáng)度過高或過低均不利于家禽生產(chǎn)[1]。家禽的生物鐘系統(tǒng)受光信息影響[2-3]，光刺激也會(huì)引起中樞系統(tǒng)相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)變化。探究不同強(qiáng)度的光刺激下家禽腦部區(qū)域調(diào)節(jié)基因和生物鐘基因的表達(dá)變化對(duì)闡明光照強(qiáng)度在生物鐘系統(tǒng)發(fā)揮的作用有著重要的理論指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從藍(lán)藻到哺乳動(dòng)物，其晝夜節(jié)律均受到光照的影響[4]。哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律的主鐘在下丘腦的視交叉上核[5]，只有視網(wǎng)膜可以接收光信息；禽類視網(wǎng)膜、松果體和深腦部均可接收光信息[6]，因此其晝夜節(jié)律的主鐘更為復(fù)雜，包括視交叉上核、視網(wǎng)膜和松果體[7]。禽類生物鐘的功能滲透機(jī)體的多項(xiàng)生理學(xué)過程，包括：繁殖[8]、睡眠、活動(dòng)[9]、免疫[10]等。光照周期、光照強(qiáng)度和光波長的改變均影響家禽行為和生物鐘基因的表達(dá)：與12L﹕12D 相比，24L白光光照降低了肉雞間腦、肝臟和骨骼肌生物鐘基因Bmal1和Per3的表達(dá)[11]；在鵪鶉上的研究發(fā)現(xiàn)，光照刺激可以誘導(dǎo)松果體Per2水平的提高[12]；也有研究表明，綠光提高肉雞下丘腦生物鐘基因Bmal1、Clock和Cry1表達(dá)，紅光降低生物鐘基因表達(dá)[13]。c-fos是一種原癌基因，又是即早表達(dá)基因，c-fos和其編碼的蛋白在正常情況下參與神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化等過程[14]。c-fos作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的標(biāo)志物，正常情況下表達(dá)水平較低，應(yīng)激時(shí)可快速短暫表達(dá)，具有信號(hào)傳遞的特征。光照刺激也引起c-fos基因的表達(dá)，對(duì)鼴鼠光照刺激后，在視網(wǎng)膜和腦中檢測到有c-fos的表達(dá)[15]，下丘腦中c-fos只有在光刺激引起動(dòng)物行為節(jié)律發(fā)生相移時(shí)表達(dá)才會(huì)增加，說明c-fos在光照引起晝夜節(jié)律的相移中發(fā)揮重要作用[16-17]。【本研究切入點(diǎn)】家禽的生物鐘機(jī)制更加復(fù)雜，鴨對(duì)光信息環(huán)境的反應(yīng)可能較母雞更敏感[18]。由于c-fos在正常情況下，表達(dá)水平較低，只有在受到信號(hào)刺激的情況下才會(huì)迅速短暫表達(dá)[19]；同時(shí)，生物鐘基因在家禽晝夜節(jié)律以及各種光照條件下研究較多，但瞬時(shí)光刺激如何影響其表達(dá)鮮有研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以櫻桃谷肉鴨為研究對(duì)象，采用持續(xù)7 d黑暗條件下短暫光信號(hào)刺激模式，以便更好地使光信號(hào)形成較強(qiáng)刺激，激發(fā)c-fos的瞬時(shí)表達(dá)，從而研究瞬時(shí)光刺激對(duì)下丘腦、垂體、間腦和中腦的c-fos基因及生物鐘基因表達(dá)的影響，探究不同強(qiáng)度的瞬時(shí)光刺激下家禽腦部區(qū)域調(diào)節(jié)基因和生物鐘基因的表達(dá)變化，為進(jìn)一步闡明肉鴨對(duì)光信號(hào)響應(yīng)的變化規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用144 只健康且體重接近的1 日齡櫻桃谷肉鴨在同一飼養(yǎng)管理下飼養(yǎng)至21 日齡，22 日齡時(shí)隨機(jī)分為2 個(gè)處理，每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12 只鴨。光照制度方法參照文獻(xiàn)[20-21]中c-fos研究方法。持續(xù)黑暗（1 Lx）條件下飼養(yǎng)[22]，黑暗時(shí)肉鴨的飼養(yǎng)設(shè)施及料槽水槽的擺放與1—21d 時(shí)一致，黑暗7 d 后，采用10 和80 Lx 白光刺激1.5 h，LED 燈為光源，刺激后暗適應(yīng)1.5 h。

1.2 飼養(yǎng)管理

鴨舍為全封閉、面積一致的2 個(gè)獨(dú)立房間，每個(gè)房間6 欄，網(wǎng)上飼養(yǎng)。舍內(nèi)溫度最后控制在26℃左右，濕度50%—70%。水線統(tǒng)一喂水，人工喂料，試驗(yàn)期間鴨子自由采食和飲水，飼糧組成為玉米59.50%，去皮豆粕28.70%，低筋面粉4.00%，米糠粕2.00%，石粉1.30%，大豆油0.50%，預(yù)混料4.00%，營養(yǎng)水平為代謝能12.14 MJ·kg-1，粗蛋白質(zhì)20.00%。本試驗(yàn)于2017年8 月至2017 年9 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院偉南樓環(huán)控艙進(jìn)行。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測定

1.3.1 樣品采集 肉鴨暗適應(yīng)1.5 h 后，每個(gè)重復(fù)選取1 只接近平均體重的肉鴨：頸靜脈采血，每只肉鴨采血約10 mL，置肝素鈉抗凝管中，斜面靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min 吸取上清分裝，-80℃冰箱保存待測。采集肝臟迅速放入液氮，-80℃冰箱保存，測定激素含量。采集下丘腦、垂體、間腦和中腦迅速放入液氮，-80℃冰箱保存，測定c-fos及生物鐘相關(guān)基因表達(dá)。

1.3.2 肝臟和血漿中褪黑激素測定 剪取適量肝臟組織，4℃生理鹽水中漂洗后，濾紙吸干，稱重，加入9 倍體積的4℃生理鹽水，勻漿，2 500 r/min 離心，取上清分裝。血漿和肝臟勻漿中褪黑激素的含量采用ELISA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）測定，具體方法按照說明書測定。

1.3.3 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 采用 Magen HiPure Universal RNA Mini Kit（美基，廣州）試劑盒提取不同腦組織的總RNA。再用Prime Script RT reagent Kit(takara，日本)制備cDNA 樣品，按照說明書操作，cDNA 樣品置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物合成和熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 公布的綠頭鴨基因的mRNA 序列設(shè)計(jì)引物序列（表1），由上海生工生物合成。采用SYBR Green (TOYOBO，日本)染料法在ABI7500（Applied Bio-systems, Foster City，美國）上進(jìn)行RT-qPCR，PCR 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s ，然后95℃變性5 s ，退火溫度60℃ 34 s 共40 個(gè)循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法對(duì)熒光定量PCR 結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究中涉及光照和性別兩種因素。首先按照雙因素采用SAS 9.2 軟件來統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)性別對(duì)基因表達(dá)無顯著影響，且光照和性別之間無交互作用，因此我們進(jìn)一步采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 結(jié)果

2.1 不同強(qiáng)度光照對(duì)櫻桃谷肉鴨腦組織c-fos mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖1 所示，與80 Lx 組相比，10 Lx 組肉鴨下丘腦中c-fosmRNA 的相對(duì)表達(dá)量極顯著提高（P＜0.01），中腦c-fos表達(dá)量顯著提高（P＜0.05）。而間腦中10 Lx 組c-fos的表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），兩組垂體中c-fosmRNA 相對(duì)表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 不同強(qiáng)度光照對(duì)櫻桃谷肉鴨不同腦組織生物鐘基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響

由表2 所示，不同光照強(qiáng)度處理極顯著影響了下丘腦和間腦中Bmal1mRNA 相對(duì)表達(dá)量，10 Lx 組的Bmal1mRNA 的表達(dá)量極顯著的高于80 Lx 組（P＜0.01）。兩組垂體和中腦中的Bmal1mRNA 表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨c-fos mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 1 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of c-fos mRNA in meat ducks

表2 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨Bmal1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Table 2 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Bmal1 mRNA in meat ducks

不同光照強(qiáng)度對(duì)肉鴨生物鐘基因Bmal2mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響如表3 所示，10 Lx 組下丘腦中Bmal2的 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于80 Lx組（P＜0.01），間腦中10 Lx 組Bmal2的表達(dá)有高于80 Lx 組的趨勢（P=0.08）。垂體和中腦組織中兩組的Bmal2表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨Bmal2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Bmal2 mRNA in meat ducks

不同光照強(qiáng)度對(duì)肉鴨生物鐘基因ClockmRNA 相 對(duì)表達(dá)量的影響如表5 所示，10 Lx 組的肉鴨下丘腦和中腦Clock基因表達(dá)量顯著高于80 Lx 組（P＜0.05）。兩組垂體和間腦中Clock表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

不同光照強(qiáng)度對(duì)肉鴨生物鐘基因Cry1mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響如表5 所示，10 Lx 組下丘腦中Cry1mRNA 相對(duì)表達(dá)量有高于80 Lx 組的趨勢（P=0.06）， 兩組肉鴨間腦、垂體和中腦中Cry1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

不同光照強(qiáng)度對(duì)肉鴨生物鐘基因Per2mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響如表6 所示，10 Lx 組下丘腦中Per2表達(dá)量極顯著高于80 Lx 組（P＜0.01），中腦的Per2表達(dá)顯著高于80 Lx 組（P＜0.05）。垂體和間腦中兩 組的Per2表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同強(qiáng)度光照對(duì)櫻桃谷肉鴨血漿和肝臟褪黑激素含量的影響

由圖2-A 和B 可知，80 Lx 血漿中褪黑激素含量顯著高于10Lx 組（P＜0.05），而肝臟中褪黑激素含量顯著低于10Lx 組（P＜0.05）。

表4 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨Clock mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Table 4 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Clock mRNA in meat ducks

表5 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨Cry1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Table 5 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Cry1 mRNA in meat ducks

表6 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨Per2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Table 6 Effects of different light intensity treatments on the relative expression of Per2 mRNA in meat ducks

圖2 不同光照強(qiáng)度處理對(duì)肉鴨血漿和肝臟褪黑激素含量的影響Fig. 2 Effects of different light intensity treatments on plasma and liver melatonin content in meat ducks

3 討論

光照強(qiáng)度是家禽生產(chǎn)中重要環(huán)境因素之一，c-fos在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化調(diào)控基因表達(dá)方面也發(fā)揮著重要的作用，在哺乳動(dòng)物的中樞生物鐘下丘腦視交叉上核中，光照環(huán)境的變化引起c-fos表達(dá)的改變，同時(shí)也會(huì)引起機(jī)體晝夜節(jié)律的改變。c-fos是腦對(duì)各種刺激包括光照在內(nèi)引起反應(yīng)的標(biāo)志物[23]。研究表明，給予光刺激的火雞，其下丘腦的c-fosmRNA 表達(dá)量顯著高于未受到光刺激時(shí)的表達(dá)[24]。在本研究中，采用持續(xù)7 d 黑暗條件后給予1.5 h 光照，這種模式有助于形成對(duì)肉鴨的強(qiáng)烈光刺激，從而激發(fā)腦部c-fos的迅速表達(dá)。本試驗(yàn)中下丘腦和中腦10 Lx 光照組的c-fosmRNA 的相對(duì)表達(dá)量顯著高于80 Lx 光照組，而間腦10 Lx 光照組的c-fosmRNA 表達(dá)量極顯著低于80 Lx 光照組，說明高光強(qiáng)刺激可抑制下丘腦和中腦c-fos的表達(dá)，而提高間腦c-fos的表達(dá)。對(duì)母雞間腦神經(jīng)核團(tuán)c-fos表達(dá)的研究也表明，間腦中的圓核和外側(cè)膝狀腹側(cè)核c-fos在20 和30 Lx 表達(dá)最強(qiáng)，10 Lx 組最低，但中腦的c-fos表達(dá)與肉鴨不同，隨著光照強(qiáng)度的增加，中腦c-fos表達(dá)也加強(qiáng)[20]。對(duì)大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在下丘腦視交叉上核，隨著光照強(qiáng)度的增加，F(xiàn)os 免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量也增加[25]。這表明光信號(hào)可能通過調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞中c-fos的表達(dá)傳遞光信息，且腦組織不同部位對(duì)于光刺激的感應(yīng)也不相同[26]，不同種類動(dòng)物腦部對(duì)于光信息感應(yīng)的模式并不完全相同。c-fos的表達(dá)還會(huì)影響晝夜節(jié)律的相位，研究發(fā)現(xiàn)，c-fos是哺乳動(dòng)物生物鐘正常夾帶所需要的[27]，光照誘導(dǎo)的大鼠自發(fā)性活動(dòng)的晝夜節(jié)律的改變與c-fos的表達(dá)有關(guān)，c-fos被阻斷后抑制了光照誘導(dǎo)的相移[28]。

晝夜節(jié)律被生物鐘基因所調(diào)控，包括正調(diào)控原件Clock和Bmal1/2，負(fù)調(diào)控原件Per1/2/3和Cry1/2。與哺乳動(dòng)物不同，禽類不表達(dá)Per1，只表達(dá)Per2和Per3[29]。Clock和Bmal在細(xì)胞質(zhì)中以二聚體形式結(jié)合，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合在負(fù)調(diào)控原件啟動(dòng)子的E-box 上，激活Pers和Crys基因的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中的Per 和Cry蛋白形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核會(huì)干擾Clock/Bmal1二聚體的活性，抑制Pers和Crys的表達(dá)。Reverbα和Rorα分別通過激活和抑制Bmal1進(jìn)而調(diào)控生物鐘基因的表達(dá)[9]。本試驗(yàn)中，與10 Lx 組相比，80 Lx 瞬時(shí)光照顯著降低了下丘腦中生物鐘正調(diào)控基因Bmal1、Bmal2、Clock和負(fù)調(diào)控基因Cry1、Per2的表達(dá)量；間腦中Bmal1、Bmal2的表達(dá)在80 Lx 光照刺激下也低于10 Lx組。不同光照強(qiáng)度對(duì)垂體中上述生物鐘基因表達(dá)均無顯著差異。這表明，瞬時(shí)高強(qiáng)度光刺激減弱了肉鴨下丘腦和間腦生物鐘基因表達(dá)的振幅。研究發(fā)現(xiàn)，夜晚時(shí)間采用低光照強(qiáng)度處理的小鼠生物鐘節(jié)律發(fā)生了改變，per1的振幅降低；倉鼠的研究也發(fā)現(xiàn)，急劇的光刺激消除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)生物鐘基因的節(jié)律，且表達(dá)量降低了18%—40%[30-31]。下丘腦是家禽的主鐘之一，本研究結(jié)果也表明瞬時(shí)光刺激對(duì)下丘腦的影響最大。另一方面，生物鐘基因及表達(dá)節(jié)律也受到光照制度的影響：持續(xù)光照下肉雞間腦的生物鐘基因Bmal1、Cry1、Per3與12L:12D 相比發(fā)生了顯著改變，振幅降低[11]。與12L:12D 的光照周期相比，23L:1D 破壞了雞生物鐘基因Clock、Bmal1 和Per2的晝夜節(jié)律[32]。肉雞的松果體細(xì)胞在持續(xù)黑暗下提高了正調(diào)控生物鐘基因Clock和Bmal2的表達(dá)，而12L:12D 提高了負(fù)調(diào)控基因Per2和Per3的表達(dá)[33]。研究表明光照強(qiáng)度會(huì)對(duì)山雀的行為節(jié)律產(chǎn)生影響，與夜間弱光相比，強(qiáng)光下山雀活躍開始時(shí)間提前，活躍結(jié)束時(shí)間推遲[34]。

褪黑激素主要來自松果體合成和釋放，在視網(wǎng)膜和腸道嗜鉻細(xì)胞也可以合成，褪黑激素具有抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等生理功能。AANAT 是褪黑激素合成過程中的限速酶之一[35]，生物鐘基因Bmal1/Clock二聚體可通過結(jié)合在AANAT 的E-box 上來調(diào)控AANAT 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)褪黑激素的表達(dá)[36]。血液中褪黑激素主要來源于松果體，光照可通過“視網(wǎng)膜-下丘腦視交叉上核（SCN）-松果體神經(jīng)傳導(dǎo)途徑”以及“視網(wǎng)膜外光感受體途徑”來調(diào)節(jié)松果體褪黑激素的分泌[37-38]。正常光照條件下，血液中褪黑激素主要受松果體分泌的調(diào)節(jié)，呈光抑制現(xiàn)象。研究表明，5、10和50 Lx 光照強(qiáng)度下北京油雞血清中的褪黑激素含量顯著低于1 Lx 組[39]。但本研究中80 Lx 組血清褪黑激素水平顯著高于10 Lx 組，同時(shí)80 Lx 組間腦c-fos基因的表達(dá)也顯著高于10 Lx 組，說明在持續(xù)黑暗后瞬時(shí)光刺激下，松果體褪黑激素的分泌調(diào)節(jié)模式可能會(huì)發(fā)生改變：一方面，瞬時(shí)光照通過刺激間腦的視交叉神經(jīng)，激活了間腦部位c-fos的高表達(dá)，進(jìn)而提高松果體褪黑激素的分泌；另一方面，持續(xù)黑暗后短暫瞬時(shí)的強(qiáng)光照對(duì)肉鴨也可能是一種應(yīng)激，而應(yīng)激條件會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)褪黑激素的釋放和升高[40]。研究表明，對(duì)大鼠進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激，其血漿褪黑激素的含量顯著升高[41]。同時(shí)，處于應(yīng)激條件下的動(dòng)物機(jī)體腎上腺素的分泌也會(huì)增加[42]，有研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素的提高促進(jìn)了雞松果體細(xì)胞褪黑激素的分泌[43]。因此，兩方面的作用可能會(huì)導(dǎo)致高瞬時(shí)光刺激下血清褪黑激素水平升高。組織中的褪黑激素水平受到血液和自身分泌的影響，而且自身分泌的調(diào)控方式和松果體是有區(qū)別的，肝臟是褪黑激素的主要代謝器官[35,44]，應(yīng)激增強(qiáng)的情況下，肝臟對(duì)褪黑激素分解代謝的增加可能導(dǎo)致其組織褪黑激素水平的降低。以往研究主要集中于常規(guī)條件下光照強(qiáng)度對(duì)機(jī)體的影響，在后續(xù)研究中，不同光照模式，如瞬時(shí)光刺激模式，對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體生長發(fā)育、褪黑激素分泌以及生物鐘節(jié)律的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

持續(xù)黑暗下給予櫻桃谷肉鴨不同強(qiáng)度（10 Lx:80 Lx）的光刺激，對(duì)肉鴨多個(gè)腦部區(qū)域的c-fos、生物鐘基因及血漿和肝臟的褪黑素水平均有顯著影響。瞬時(shí)強(qiáng)光刺激可下調(diào)下丘腦及中腦的c-fos表達(dá)，促進(jìn)間腦c-fos表達(dá)。在4 個(gè)腦部區(qū)域中，光強(qiáng)對(duì)下丘腦的影響最大。同時(shí)，瞬時(shí)強(qiáng)光刺激減弱了肉鴨下丘腦和間腦生物鐘基因表達(dá)的振幅。