龔明月，段嘯天，余婷婷，王杰，申莉莉，李瑩，劉明宏，李永亮，呂洪坤，章松柏，楊金廣

（1 長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州434025；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島266101；3 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義563000；

4 云南省煙草公司保山市公司，云南保山678000；5 中國煙草總公司海南省公司海南雪茄研究所，?？?71100）

0 引言

【研究意義】煙草馬鈴薯Y 病毒病又稱“煙草脈壞死病”或“煙草脈帶病”，是由馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）侵染煙草引起的一種系統(tǒng)性侵染病害[1-2]。PVY 于1931 年由SMITH 首次發(fā)現(xiàn)[3]，屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus）成員，是危害煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒等茄科作物的一種病毒。馬鈴薯Y 病毒屬病毒為正鏈RNA 病毒，分布廣泛，幾乎在全世界都有發(fā)生，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)更為流行，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[4]。因此，研究PVY 的致病機制對于煙草馬鈴薯Y 病毒病的防治具有重要意義。【前人研究進展】正鏈RNA 病毒通過誘導(dǎo)宿主蛋白來促進其在受感染宿主中的高效復(fù)制。在模型RNA病毒——番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）致病機理的研究中發(fā)現(xiàn)，該病毒的復(fù)制酶復(fù)合物中含有熱激蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70），是TBSV 復(fù)制所必需的一種豐富的細(xì)胞質(zhì)伴侶，這種胞質(zhì)Hsp70 在TBSV 復(fù)制過程中發(fā)揮著多種作用，如影響病毒復(fù)制蛋白的亞細(xì)胞定位和膜插入，以及病毒復(fù)制酶的組裝[5]。并且通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析證明，Hsp70 是TBSV 病毒復(fù)制復(fù)合體（virus replication complex，VRC）的一種組成成分[6]。熱激蛋白（Hsp）是植物細(xì)胞內(nèi)重要的分子伴侶，該蛋白在進化上高度保守，按照分子量大小的不同分為6個家族，即Hsp110s、Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s、小分子sHsps 和泛素[7]，其中研究最多的是Hsp70家族。根據(jù)熱激蛋白70 的表達(dá)類型，可分為組成型Hsc70 和誘導(dǎo)型Hsp70，前者在正常條件下就有本底表達(dá)，以維持細(xì)胞正常生命活動的需要[8-9]；而后者在受環(huán)境因素脅迫時誘導(dǎo)表達(dá)，以應(yīng)付外界惡劣環(huán)境條件的威脅[10]；Hsc70 廣泛分布于原核及真核生物細(xì)胞中，是維持生命活動的重要功能蛋白，具有多項生物學(xué)功能：協(xié)助新生蛋白的折疊，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運，參與免疫復(fù)合物的形成和分解及降解冗余蛋白[11-12]。【本研究切入點】Hsp70 蛋白家族在多種病毒和寄主互作中的作用已有大量研究報道，而Hsc70 對植物病毒尤其是對PVY 侵染復(fù)制的影響并不明確。前期研究發(fā)現(xiàn)本氏煙（Nicotiana benthamiana）在PVY 侵染后NbHsc70-2mRNA 水平顯著上升，推測NbHsc70-2可能參與PVY 的侵染過程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以本氏煙為材料，通過開展生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、組織特異性表達(dá)和基因功能驗證等研究，探索NbHsc70-2 在PVY 侵染復(fù)制中的作用，為煙草抗馬鈴薯Y 病毒病研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2019 年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護研究中心進行。

1.1 植物材料與病毒

供試植物材料為本氏煙，本氏煙種子點播于混合土中（土壤﹕草炭= 1﹕1），于25℃人工氣候室中培養(yǎng)，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗，相對濕度為70%，試驗采用5—6 葉期煙苗。

PVY 毒源為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所保存的N株系。取1 g PVY 野生型毒源植株的葉片，放入提前滅菌消毒的研缽中，加入40 mL PBS 緩沖液，研磨成漿并用紗布過濾除去葉片殘渣獲得懸浮液以備用；浸潤PVY 病毒汁液于本氏煙煙苗（4 周）的第3—4 片真葉，每片葉200 μL。

PVY-GFP 屬于PVY 壞死株系（PVYN）的侵染性克隆，是通過無義突變在PVY 侵染性克隆的P1與HC-pro間插入一個SacⅡ限制性內(nèi)切酶酶切位點，并在該酶切位點中插入表達(dá)了外源綠色熒光蛋白（GFP）的重組病毒，該病毒能系統(tǒng)侵染本氏煙，病毒擴增至植株非接種部位而呈現(xiàn)熒光[13]。

1.2 NbHsc70-2 的克隆與分析

本氏煙RNA 提取按照TaKaRa RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑）試劑盒手冊進行，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA（Vazyme），根據(jù)擬南芥中已報道的Hsc70 核苷酸序列在美國本氏煙草數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/ organism/nicotiana_benthamiana/genome）中比對得到一個描述為Heat shock 70 kD protein 基因（基因號：Niben101Scf00449g06008.1），根據(jù)該基因序列設(shè)計特異性引物NbHsc70-2 F/R（表1），以本氏煙cDNA 為模板PCR 擴增NbHsc70-2；PCR 產(chǎn)物連接pEasy-Blunt Simple 載體并轉(zhuǎn)化E. coil感受態(tài)菌株（TaKaRa），陽性克隆委托派森諾生物科技有限公司測序；利用MEGA 6.0[14]進行核苷酸多序列比對分析后，基于最低的貝葉斯標(biāo)準(zhǔn)（Bayesian information criterion，BIC）確定最適合核苷酸替代模型為木村雙參數(shù)模型（Kimura two-parameter model，K2P），應(yīng)用于最大似然法（maximum-likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。各分支的置信度通過1 000次自舉抽樣（bootstrapping）進行評估。

1.3 NbHsc70-2 蛋白的亞細(xì)胞定位

利用BaCelLo[15]和SignalP 4.0[16]進行NbHsc70-2的亞細(xì)胞定位和信號肽預(yù)測；根據(jù)NbHsc70-2序列設(shè)計不含有終止密碼子的帶XbaI/KpnI 酶切位點的特異性引物NbHsc70-2-XbaI F/KpnI R（表1），并以本氏煙 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，利用In-Fusion 技術(shù)（TaKaRa）將產(chǎn)物與Fu46 載體相連，構(gòu)建NbHsc70-2::RFP 融合基因，再利用LR 同源重組技術(shù)（Invitrogen）將融合基因連接到pEarleyGate100載體，最終得到pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP 載體；將含有pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP 載體和pEarleyGate100::RFP 載體的 LBA4404 農(nóng)桿菌（OD600=0.8）浸潤本氏煙下表皮，培養(yǎng)于25℃人工氣候室中，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗，相對濕度為70%，72 h 后制片置于激光共聚焦顯微鏡（SP8，Leica）下觀察明、暗視野下的表達(dá)情況。

表1 試驗中采用的引物及序列Table 1 Sequence of the primers used in this study

1.4 NbHsc70-2 沉默載體的構(gòu)建

根據(jù)NbHsc70-2基因序列，用Premier 5.0 設(shè)計一對含有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、KpnI 的特異性引物RNAi NbHsc70-2 F/R（表1），PCR 擴增大小為350 bp目的沉默片段，利用In-Fusion 技術(shù)（TaKaRa）將產(chǎn)物與pTRV2 載體相連，構(gòu)建pTRV::NbHsc70-2 重組載體；將含有pTRV::NbHsc70-2 載體、pTRV::PDS 及pTRV00 空載體的LBA4404 農(nóng)桿菌（OD600=0.8）注射本氏煙下表皮，7 d 后檢測沉默效率，進行后續(xù)試驗。

1.5 NbHsc70-2 瞬時過表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NbHsc70-2基因序列設(shè)計含有AhdI酶切位點的特異性引物NbHsc70-2-AhdI F/R（表1），并以本氏煙cDNA 為模板進行PCR 擴增，利用In-Fusion 技術(shù)（TaKaRa）將產(chǎn)物與 GWC 載體相連，構(gòu)建GWC::NbHsc70-2 入門載體，再利用LR 同源重組原理（Invitrogen）將入門載體連接到pEarleyGate100載體，最終得到pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2表達(dá)載體；提前24 h 給本氏煙浸潤PVY 病汁液，將含有pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2 表達(dá)載體和pEarleyGate100::GWC 載體的LBA4404 農(nóng)桿菌（OD600=0.8）浸潤本氏煙下表皮，48 h 后開始采樣檢測PVYCP基因積累量。

1.6 qRT-PCR 與統(tǒng)計分析

根據(jù)不同樣品中特定基因的基因序列設(shè)計各基因 的熒光定量檢測引物（表1），同時設(shè)置Actin作為內(nèi)參。分別提取各取樣時間點的處理組及對照組材料的總RNA（TaKaRa），反轉(zhuǎn)錄成cDNA（Vazyme）。以cDNA 為模板，按照ChamQTMUniversal SYBR? qPCR Master Mix（Vazyme）試劑盒說明書進行操作，在Applied Biosystems 7500 real-time PCR 機型上進行擴增。反應(yīng)體系：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL Primer1（10 μmol·L-1），0.4 μL Primer2（10 μmol·L-1），2 μL cDNA，補蒸餾水至總體積20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；40 循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min，95℃ 15 s。相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算[17-18]，使用7500 Software v2.3 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并使用GraphPad Prism6.0 繪圖。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 NbHsc70-2 克隆與序列分析

根據(jù)擬南芥中已報道的Hsc70 核苷酸序列在美國本氏煙草數(shù)據(jù)庫中比對得到一個描述為Heat shock 70 kD protein 基因（基因號：Niben101Scf00449g06008.1）。為鑒定Niben101Scf00449g06008.1 基因，在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫）中比對發(fā)現(xiàn)Niben101Scf00449g06008.1 與NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2序列相似性最高，分別有69.07%、69.07%、68.25%核苷酸相似性，但NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2的編碼序列（coding sequence，CDS）均有1 953 bp，而Niben101Scf00449g06008.1 基因的CDS 序列中只有1 443 bp，因此推測Niben101Scf00449g06008.1 基因CDS 序列部分缺失，通過比對NCBI 上已發(fā)表的Hsc70序列發(fā)現(xiàn)該基因非常保守，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增得到Niben101Scf00449g06008.1 基因的完整CDS 序列；將該CDS 序列與NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2序列進行比對，發(fā)現(xiàn)分別具有94.49%、94.49%、93.78%核苷酸相似性，對應(yīng)的蛋白質(zhì)間分別具有97.38%、97.38%、97.23%氨基酸相似性。通過獲取與Niben101Scf00449g06008.1 相似度高于96%的基因CDS 序列，并用Clustal W 進行核酸序列比對，利用ML 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果均表明Niben101Scf00449g06008.1 與NaHsc70-2關(guān)系最近（圖1），暗示Niben101Scf00449g06008.1 可能是Hsc70-2在本氏煙中的同源基因。從圖2 中可以看出，Niben101Scf00449g06008.1 與NaHsc70-2 蛋白氨基酸序列相似性最高，表明Niben101Scf00449g06008.1 是Hsc70-2在本氏煙中的同源基因，命名為NbHsc70-2。

圖1 NbHsc70-2 及其同源基因系統(tǒng)發(fā)育分析（ML 算法）Fig. 1 Phylogenetic analyses of NbHsc70-2 and its homologues (ML algorithm)

2.2 NbHsc70-2 組織表達(dá)特異性

以Actin作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR 分別檢測NbHsc70-2在本氏煙根、莖、葉中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示NbHsc70-2在葉中的相對表達(dá)量較高，在根和莖中的表達(dá)量很低，其中葉片相對表達(dá)量是根中的1.91倍（圖3）。因此，后期試驗均采集葉片樣品進行研究。

2.3 PVY 侵染對NbHsc70-2 的影響

采用qRT-PCR 檢測PVY 侵染1、3 d 后NbHsc70-2mRNA 水平的變化，結(jié)果顯示PVY 侵染后NbHsc70-2mRNA 水平明顯上升，與對照相比，處理組1 d 無明顯差異，PVY 處理3 d 后NbHsc70-2mRNA 水平上調(diào)，處理組是對照組的9.24 倍（圖4），表明PVY 侵染會引起NbHsc70-2mRNA 水平上調(diào)，暗示NbHsc70-2可能在PVY 侵染過程中發(fā)揮重要作用。

利用BaCelLo 預(yù)測NbHsc70-2 蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)NbHsc70-2 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)上的可能性高于其他部位。SignalP4.0 Server 信號肽預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白無信號肽，即NbHsc70-2 蛋白不屬于分泌蛋白。為驗證亞細(xì)胞定位的預(yù)測，將NbHsc70-2 蛋白與紅色 熒光蛋白RFP 構(gòu)建融合表達(dá)載體，注射本氏煙表皮瞬時表達(dá)進行亞細(xì)胞定位，激光共聚焦顯微鏡顯示融合蛋白與Cytoplasm-FDA（細(xì)胞質(zhì)Marker）定位重合，表明NbHsc70-2 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中（圖5）。

圖2 NbHsc70-2、NaHsc70-2、NtHsc70-2 及NsHsc70-2 蛋白氨基酸序列比對分析Fig. 2 Amino acid sequences multiple alignment among NbHsc70-2, NaHsc70-2, NtHsc70-2 and NsHsc70-2

圖3 NbHsc70-2 的組織表達(dá)特異性分析Fig. 3 Analysis of tissue expression specificity of NbHsc70-2

圖4 PVY 侵染本氏煙后NbHsc70-2 水平的變化Fig. 4 Gene accumulation of NbHsc70-2 after PVY infection in N. benthamiana

利用PVY-GFP 融合表達(dá)載體與NbHsc70-2-RFP融合表達(dá)載體共浸潤本氏煙葉片 48 h 后，觀察PVY-GFP 侵染對NbHsc70-2 蛋白定位的影響。結(jié)果顯示，PVY-GFP 侵染后，NbHsc70-2-RFP 融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)定位發(fā)生變化，部分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，NbHsc70-2-RFP 融合蛋白與PVY-GFP 共定位在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，推測NbHsc70-2 可能是PVY 病毒復(fù)制復(fù)合體的一種組成成分，參與胞內(nèi)移動過程。

2.4 沉默NbHsc70-2 對PVY 積累量的影響

為了進一步研究NbHsc70-2編碼的Hsc70-2 蛋白在PVY 侵染本氏煙中的功能，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)構(gòu)建VIGS 沉默體系下調(diào)本氏煙中NbHsc70-2的含量，分析寄主中NbHsc70-2的含量降低后對PVY侵染本氏煙的影響。由于NbHsc70-2具有高度的CDS核酸相似性，因此選擇NbHsc70-2相對不保守區(qū)設(shè)計沉默靶標(biāo)。同時，根據(jù)不保守區(qū)設(shè)計qRT-PCR 引物以擴增NbHsc70-2，用于檢測基因沉默效率（表1）。含NbHsc70-2沉默重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤本氏煙7 d 后，對NbHsc70-2沉默效率為（67.50±0.29）%（圖6-B）。從圖6-A 可以看出沉默NbHsc70-2導(dǎo)致心葉皺縮及植株矮化，暗示NbHsc70-2編碼的NbHsc70-2 蛋白可能參與調(diào)節(jié)植株生長發(fā)育。

含不同重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸潤寄主植株7 d 后，將PVY-GFP 接種于TRV 浸潤葉的上面第3 片葉，接種7 d 后，在手提式紫外燈下觀察本氏煙中的綠色熒光情況；在TRV 對照組中PVY-GFP 系統(tǒng)侵染使得非接種葉片呈現(xiàn)熒光現(xiàn)象，而NbHsc70-2沉默組中無明顯綠色熒光出現(xiàn)（圖6-C），熒光點數(shù)約是對照組的28%（圖6-D）。表明本氏煙中NbHsc70-2的mRNA 含量降低，可導(dǎo)致PVY-GFP 系統(tǒng)性侵染受到抑制。

為了進一步明確下調(diào)NbHsc70-2表達(dá)后抑制PVY侵染本氏煙，浸潤接種pTRV::NbHsc70-2 后7 d 接種野生型病毒PVYN，從RNA 水平檢測病毒的相對累積量。從圖7-A 可以看出沉默組與對照組的PVYCP表達(dá)量都呈現(xiàn)上升趨勢，但沉默組的上升趨勢較對照組慢；在沉默組上接種PVY 后 1 d，CP表達(dá)量較對照組已有下降；3 d 沉默組中的表達(dá)量是對照組的14%；5 d 沉默組中的表達(dá)量是對照組的0.004%。表明沉默NbHsc70-2后，顯著延緩植株內(nèi)PVYCP的mRNA 積累。

圖6 沉默NbHsc70-2 表型分析Fig. 6 Phenotype analysis of NbHsc70-2 silencing

圖7 沉默及過表達(dá)NbHsc70-2 對PVY 積累的影響Fig. 7 Effects of NbHsc70-2 silencing and overexpression on PVY accumulation

2.5 過表達(dá)NbHsc70-2 對PVY 積累量的影響

為了進一步確定NbHsc70-2編碼的Hsc70-2 蛋白在PVY 侵染寄主過程中的作用，通過LR 反應(yīng)將構(gòu)建好的pGWC-NbHsc70-2 與pEarleyGate100 重組，構(gòu)建NbHsc70-2 瞬時表達(dá)載體，以表達(dá)載體pEarleyGate100在本氏煙中過量表達(dá)NbHsc70-2，提高寄主中NbHsc70-2含量，分析PVY 侵染植株后RNA 水平上的病毒累積量。

從圖7-B 可以看出經(jīng)過表達(dá)載體處理48 h 后，過表達(dá)組的PVYCP表達(dá)量較對照組已有上升，過表達(dá)組中的表達(dá)量是對照組的2.31 倍；處理72 h 后過表達(dá)組中的PVYCP表達(dá)量是對照組的2.56 倍。表明過表達(dá)寄主中NbHsc70-2的含量能顯著增加植株內(nèi)PVYCP的積累。

3 討論

植物熱激蛋白70 是熱激蛋白家族中保守、普遍表達(dá)的，家族中通常具有兩個主要功能區(qū)：N 端核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide binding domain，NBD）和C 端底物結(jié)合區(qū)（substrate binding domain，SBD）。N 末端核酸結(jié)合區(qū)具有結(jié)合并水解ATP 的活性中心，它與ATP的結(jié)合-水解過程調(diào)控其對多肽的親和力[19]。C 端存在高度保守基序結(jié)構(gòu)（motif），通常用于指示亞細(xì)胞定位信號或與其他伴侶或共同伴侶相互作用[20-21]。例如定位于葉綠體中的Hsp70 其motif 結(jié)構(gòu)的氨基酸序列為 PECDVLDADFTDSK，定位于線粒體中的為PEAEYEEAKK，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的為HDEL，而定位于細(xì)胞質(zhì)中的為EEVD[22]。本試驗中，在美國本氏煙草數(shù)據(jù)庫中篩選到的Niben101Scf00449g06008.1 基因經(jīng)鑒定為NbHsc70-2，編碼649 個氨基酸，與已報道的NaHsc70-2 蛋白的相似性達(dá)到97.38%，系統(tǒng)進化樹也顯示NbHsc70-2與NaHsc70-2基因親緣性最高，并且該蛋白C 端存在EEVD 基序，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白也定位于細(xì)胞質(zhì)中，這說明NbHsc70-2是Hsc70-2在本氏煙中的同源基因。

Hsc70 蛋白是一種結(jié)構(gòu)型Hsp70，在所有的細(xì)胞內(nèi)均可表達(dá)，是一種ATP 結(jié)合蛋白[23]，其在非生物脅迫下無明顯表達(dá)差異，如熱刺激后表達(dá)量不增加或減少增加；在生物脅迫中，如在病毒的侵染過程中，Hsc70 被認(rèn)為影響病毒蛋白的復(fù)制、積累、運動和折疊。許多病毒將Hsc70 招募到膜復(fù)制工廠，如紅花苜蓿壞死花葉病毒（Red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）[24]、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）[25]和中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）[26]。WANG 等[27]研究表明，宿主Hsc70是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）復(fù)制的輔助因子，Hsc70 的表達(dá)水平與HBV 的復(fù)制呈正相關(guān)性；MATHIOUDAKIS 等[28]研究表明，Hsc70-3 mRNA水平及蛋白水平在番茄花葉病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）侵染過程中被誘導(dǎo)增加；有研究表明，Hsp70 家族與VRC 相關(guān)，能增強病毒RNA 的復(fù)制；例如Hsp70 在番茄叢矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）侵染復(fù)制中是TBSV VRC 的一種組成成分[5-6]；在TuMV 中Hsc70-3 是膜結(jié)合復(fù)制復(fù)合體的一部分[25]。此外Hsc70 還與病毒基因組成分相互作用，以增強病毒在宿主植株中的RNA 積累；Hsp72在丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）復(fù)制中與復(fù)制蛋白NS5A、NS5B（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）互作[29]。Hsc70-3 在PepMV 復(fù)制中與PepMV CP 相互作用；并且Hsc70 還參與病毒細(xì)胞間轉(zhuǎn)運，在苘麻花葉病毒（Abutilonmosaic virus，AbMV）中運動蛋白（movement protein，MP）與Hsc70 相互作用[30]，表明Hsc70 可能在病毒轉(zhuǎn)運方面具有一定的功能；在PepMV 中Hsc70-3 與PepMV CP 相互作用復(fù)合物出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表明Hsc70-3 參與PepMV 的細(xì)胞內(nèi)移動[28]；ALAM 等[31]研究表明，Hsc70-2 與純化的黃瓜壞死病毒（Cucumber necrosis virus，CNV）病毒粒子結(jié)合，并在病毒顆粒的解體中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)PVY 侵染的本氏煙中NbHsc70-2mRNA 水平上升，且引起部分NbHsc70-2 蛋白定位轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，NbHsc70-2 蛋白與PVY 共定位在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中；在AbMV 中MP 與Hsc70 相互作用，在PepMV 中也發(fā)現(xiàn)Hsc70-3 參與PepMV 的胞內(nèi)移動；推測NbHsc70-2 可能參與PVY 的胞內(nèi)移動過程。本研究利用VIGS 技術(shù)下調(diào)宿主中NbHsc70-2含量，進一步發(fā)現(xiàn)該基因缺失后，能夠顯著抑制PVYCP的積累量，表明NbHsc70-2的表達(dá)水平與PVY 的復(fù)制呈正相關(guān)，沉默組與對照組相比下降幅度較大可能是由于NbHsc70-2 是PVY 侵染復(fù)制所需要的重要組成部分，NbHsc70-2 是PVY VRC 的一部分，PVY 侵染需要招募宿主NbHsc70-2 蛋白到膜復(fù)制工廠形成PVY病毒復(fù)制復(fù)合體，缺失NbHsc70-2 導(dǎo)致PVY 無法形成VRC 進而導(dǎo)致沉默組與對照組的差異較大；并且病毒的復(fù)制是快速增長的，這也是導(dǎo)致沉默組與對照組差異較大的原因；同時沉默NbHsc70-2后7 d 植株出現(xiàn)皺縮及矮化癥狀，這也暗示了NbHsc70-2 在植物生長發(fā)育中具有重要的作用。但NbHsc70-2 功能的喪失可能造成了植株的一些生理缺陷，因此本研究進一步上調(diào)宿主中NbHsc70-2的含量，結(jié)果表明過表達(dá)NbHsc70-2能夠提高PVYCP的積累量，這與WANG等[27]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

NbHsc70-2 為Hsp70 家族蛋白，PVY 侵染后導(dǎo)致其基因表達(dá)上升。NbHsc70-2是響應(yīng)PVY 侵染的重要基因，正向調(diào)控PVY 病毒的復(fù)制，抑制該基因的表達(dá)可以提高植株對PVY 的抗性，該基因在煙草抗馬鈴薯Y 病毒病方面具有較大的應(yīng)用價值，未來可將該蛋白作為一個抗病毒藥劑靶標(biāo)。