羰基化蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)展

周家華，秦洪強(qiáng)，葉明亮*

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 國(guó)家色譜研發(fā)中心，中國(guó)科學(xué)院分析化學(xué)分離科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

1 氧化應(yīng)激與蛋白質(zhì)羰基化

絕大多數(shù)真核生物的生命活動(dòng)都離不開(kāi)氧氣，氧氣與高等生物體的能量代謝等過(guò)程密切相關(guān)[1-2]。氧氣分子在代謝中間體、酶和輻射作用下產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，其在正常生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)控發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。然而，當(dāng)產(chǎn)生的ROS超過(guò)生命體內(nèi)源性抗氧化防御的緩沖能力，即氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡被打破時(shí)，將導(dǎo)致氧化還原信號(hào)與控制機(jī)制的破壞和/或分子損傷[4]，產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)(Oxidative stress,OS)，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)、DNA/RNA和蛋白質(zhì)等重要生命體活動(dòng)承擔(dān)者的功能受損。當(dāng)持續(xù)氧化應(yīng)激產(chǎn)生時(shí)，將對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和RNA等生物分子造成不可逆損傷，并造成蛋白酶體和溶酶體降解氧化損傷蛋白質(zhì)的能力降低，使細(xì)胞活力降低，甚至造成細(xì)胞死亡[5-6]。氧化應(yīng)激異常與衰老過(guò)程以及多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤、阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病[7]。

蛋白質(zhì)羰基化(Protein carbonylation,PCO)是指蛋白質(zhì)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生醛、酮或內(nèi)酰胺等活性羰基官能團(tuán)[8]。PCO是危害性最大的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，可造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定和功能的不可逆損傷[9]。有關(guān)蛋白質(zhì)羰基化的研究始于20世紀(jì)80年代初，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)的Stadtman實(shí)驗(yàn)室開(kāi)創(chuàng)[10]。蛋白質(zhì)羰基化被視為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，在細(xì)胞、組織和器官衰老中的作用受到特別關(guān)注[11]。Levine和Stadtman提出蛋白質(zhì)羰基化水平隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，以此支持細(xì)胞或生物體水平上衰老的自由基(氧化應(yīng)激)理論[12-15]，故蛋白質(zhì)羰基化是與衰老相關(guān)的重要候選生物標(biāo)志物。同時(shí)，蛋白質(zhì)羰基化會(huì)調(diào)控蛋白功能，進(jìn)而影響相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，造成疾病相關(guān)蛋白質(zhì)功能的不可逆損傷[16]。因此，羰基化對(duì)于蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)羰基化的表征，可以提供氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的作用網(wǎng)絡(luò)，為相關(guān)疾病的分子機(jī)制研究提供重要信息[17]。

2 蛋白質(zhì)羰基化途徑

蛋白質(zhì)羰基化存在超過(guò)35種形式[18]，按照其產(chǎn)生方式主要分為以下4類[10](圖1)。

圖1 蛋白質(zhì)羰基化的主要途徑

2.1 蛋白質(zhì)、多肽主鏈骨架的裂解

蛋白質(zhì)的多肽骨架中氨基酸的α-碳原子可被ROS攻擊，形成烷氧基自由基，隨后以α-酰胺化或二酰胺途徑裂解。前者的鍵斷裂發(fā)生在自由基起始位點(diǎn)的N-末端一側(cè)，使來(lái)自蛋白質(zhì)N-末端部分的多肽片段帶有C-末端酰胺，而來(lái)自蛋白質(zhì)C-末端部分的多肽N-末端具有N-α-酮?；缓笳叩墓羌芰呀庥搔?碳起始位點(diǎn)的C-末端側(cè)的鍵斷裂引起，使來(lái)自蛋白質(zhì)N-末端部分的新多肽的C-末端形成二酰胺，而來(lái)自蛋白質(zhì)的C-末端部分的多肽N-末端產(chǎn)生異氰酸酯基團(tuán)。

2.2 蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化

ROS可通過(guò)直接攻擊蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸的側(cè)鏈，引入活性羰基。以賴氨酸為例，羥基自由基在賴氨酸側(cè)鏈的C6位置奪取氫，形成以碳為中心的自由基。過(guò)渡金屬離子接受碳自由基的孤電子對(duì)后，產(chǎn)生賴氨酸亞胺，隨后通過(guò)釋放銨離子自發(fā)水解成氨基己二酸半醛(AAS)。類似地，精氨酸氧化成谷氨酸半醛(GGS)，蘇氨酸氧化成2-氨基-3-酮丁酸，脯氨酸氧化得到GGS和2-吡咯烷酮。

2.3 脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)蛋白活性位點(diǎn)的加成

ROS對(duì)脂質(zhì)的進(jìn)攻引起脂質(zhì)過(guò)氧化(Lipid peroxidation)，產(chǎn)生α,β-不飽和醛、二醛和酮醛等被稱為活性羰基物質(zhì)(Reactive carbonyl spices,RCS)的代謝產(chǎn)物(又稱Lipid-derived electrophiles,LDEs，即脂質(zhì)衍生親電試劑)，如丙烯醛(Acrolein,ACR)、丙二醛(MDA)、4-羥基-2-壬烯醛(4-Hydroxy-2-nonenal,HNE)等。這些活性羰基物質(zhì)可以通過(guò)邁克爾加成或生成席夫堿的形式加合到親核氨基酸(即半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸)上引入活性羰基。研究這類共價(jià)修飾作用不僅能夠發(fā)現(xiàn)親電性化學(xué)信號(hào)的調(diào)控機(jī)制，而且對(duì)目前藥物化學(xué)領(lǐng)域熱門(mén)的靶向共價(jià)抑制劑開(kāi)發(fā)有著重要參考價(jià)值。

2.4 糖化的氧化產(chǎn)物

氨基酸和還原糖之間發(fā)生被稱為美拉德反應(yīng)的非酶促反應(yīng)，在一系列化學(xué)重排之后，可以在蛋白質(zhì)側(cè)鏈引入活性羰基。除此之外，糖酵解中間體降解產(chǎn)生的小分子醛類，如乙二醛(MG)、甲基乙二醛(MGO)和3-脫氧葡糖醛酮(3-DG)也可以加合在蛋白質(zhì)上從而引入活性羰基。

3 蛋白質(zhì)羰基化的富集檢測(cè)方法

目前，蛋白質(zhì)羰基化的鑒定和定量技術(shù)主要分為以下3類：(1)分光光度法和色譜法測(cè)定總蛋白質(zhì)羰基含量;(2)生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，如免疫印跡和ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay ，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)，提供有關(guān)修飾蛋白和羰基化水平的全局性信息;(3)基于質(zhì)譜(MS)的羰基化檢測(cè)技術(shù)，用于鑒定蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)以及蛋白質(zhì)結(jié)合的羰基化合物的相對(duì)定量[19]。質(zhì)譜以外的其他方法雖然能夠高靈敏度檢測(cè)氧化修飾蛋白質(zhì)，卻不能提供修飾蛋白質(zhì)特性以及修飾本身的化學(xué)性質(zhì)和位點(diǎn)等信息?；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步，使蛋白質(zhì)羰基化的規(guī)?；芯砍蔀榭赡埽M(jìn)而為蛋白質(zhì)羰基化的相關(guān)調(diào)控通路研究提供了數(shù)據(jù)支撐[19]。目前采用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法主要分為凝膠電泳與非凝膠電泳兩大體系(圖2)。

圖2 蛋白質(zhì)羰基化蛋白組學(xué)分析方法

3.1 凝膠電泳體系

二維(2D)凝膠電泳已被廣泛用于復(fù)雜樣品中羰基化蛋白質(zhì)的鑒定。由于相對(duì)豐度低、化學(xué)穩(wěn)定性差、缺乏特定的物理化學(xué)性質(zhì)(如吸收或熒光)，羰基化蛋白質(zhì)通常無(wú)法直接檢測(cè)，其檢測(cè)和定量需要使用特定的化學(xué)探針進(jìn)行衍生化[15]。

2,4-二硝基苯肼(2,4-Dintrophenylhydrazide,DNPH)可與活性羰基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的2,4-二硝基苯腙，其吸收光譜在365～375 nm處具有特征吸收峰。Levine等[20]首先使用DNPH，通過(guò)DNP(2,4-二硝基苯基)基團(tuán)在360 nm處的吸光度來(lái)測(cè)定羰基化程度。這一思路被發(fā)展為“oxyblot”技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)印跡法，即先用DNP衍生羰基化樣品，再使用抗DNP抗體進(jìn)行檢測(cè)[21-22]，還可以通過(guò)質(zhì)譜法進(jìn)行凝膠內(nèi)消化后對(duì)羰基化修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

酰肼基團(tuán)可以與活性羰基反應(yīng)形成腙加合物，其含有的不穩(wěn)定亞胺鍵，可被氰基硼氫化物特異性還原。此外，酰肼還可以引入多種官能團(tuán)(如生物素、洋地黃毒苷和與酰肼偶聯(lián)的各種熒光化合物等)后再與羰基反應(yīng)，如可以用洋地黃毒苷-酰肼衍生化羰基并以抗洋地黃毒苷抗體進(jìn)行檢測(cè)，或用生物素-酰肼衍生化并用熒光素標(biāo)記的親和素檢測(cè)。熒光素縮氨基硫脲和熒光素酰肼首先由Stadtman等[23]用于在一維凝膠中檢測(cè)羰基；Regnier等[24]采用生物素化和親和素-異硫氰酸熒光素(Biotinylation and avidin-fluorescein isothiocyanate,FITC)親和染色法，建立了二維電泳中羰基化蛋白的檢測(cè)方法，在用過(guò)氧化氫刺激后的酵母蛋白質(zhì)組中鑒定出20種羰基化蛋白質(zhì)。2D凝膠電泳可以在各種生物條件下用于差分氧化蛋白質(zhì)的鑒定，但其靈敏度較低，不易檢測(cè)低豐度的蛋白質(zhì)，操作費(fèi)力且不允許高通量檢測(cè)[25]。

3.2 非凝膠電泳體系

質(zhì)譜法是蛋白質(zhì)組學(xué)中用于鑒定蛋白質(zhì)，尤其是PTM(Post-translational modification，翻譯后修飾)表征的最通用技術(shù)。使用質(zhì)譜法的無(wú)凝膠方法已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)羰基化的最有力技術(shù)。蛋白質(zhì)羰基化的各項(xiàng)研究受制于其低豐度、低電離效率、可能產(chǎn)物的異質(zhì)性以及與分析期間存在的其他化合物的反應(yīng)性。因此在質(zhì)譜分析之前，分離羰基化肽和蛋白質(zhì)的富集策略通常是必需的[26]。

3.2.1 基于競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)策略對(duì)半胱氨酸羰基化修飾的間接鑒定脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物會(huì)特異性修飾蛋白質(zhì)的半胱氨酸等活性位點(diǎn)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。可以通過(guò)硫醇反應(yīng)性化學(xué)探針標(biāo)記未被修飾的半胱氨酸活性位點(diǎn)，結(jié)合蛋白質(zhì)定量組學(xué)方法，間接實(shí)現(xiàn)相關(guān)羰基化蛋白質(zhì)底物及作用位點(diǎn)的鑒定。Cravatt等[27]基于競(jìng)爭(zhēng)性isoTOP-ABPP(Isotopic tandem orthogonal proteolysis-activity-based protein profiling,同位素串聯(lián)正交蛋白水解-基于活性的蛋白譜分析)策略，使用LDE(引入活性羰基基團(tuán))或DMSO(Dimethylsulfoxide,二甲基亞砜)處理蛋白質(zhì)組，再用硫醇反應(yīng)性碘乙酰胺(Iodoacetamide,IAM)-炔探針標(biāo)記，通過(guò)CuI催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)(點(diǎn)擊化學(xué))綴合上可切割的、同位素標(biāo)記的生物素標(biāo)簽，以鏈霉親和素珠富集，珠上酶解得到探針標(biāo)記肽段，并用LC-MS/MS鑒定和定量。該策略能夠通過(guò)半胱氨酸反應(yīng)性碘乙酰胺-炔(IA)探針定量蛋白質(zhì)組中LDE修飾的1000多個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)。由于對(duì)半胱氨酸的LDE修飾可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷其IA-炔烴標(biāo)記，DMSO處理的(輕)與LDE處理的(重)信號(hào)之間的定量比率準(zhǔn)確地反映了對(duì)半胱氨酸LDE修飾的程度。該方法基于LDE和碘代乙酰胺探針對(duì)半胱氨酸活性位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)作用，有效實(shí)現(xiàn)了LDE相關(guān)底物的篩選，并獲取了相應(yīng)的底物位點(diǎn)信息。然而，該方法只能間接獲取LDE對(duì)蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基的修飾位點(diǎn)信息，無(wú)法獲取LDE與組氨酸和賴氨酸修飾位點(diǎn)信息。

3.2.2 通過(guò)生物正交LDE-類似物探針對(duì)特定羰基化類型進(jìn)行檢測(cè)鑒定與基于競(jìng)爭(zhēng)作用的間接羰基化檢測(cè)方法相比，實(shí)現(xiàn)修飾位點(diǎn)的直接鑒定具有更高的靈敏度，并能有效減少假陽(yáng)性干擾。Marnett等[28]設(shè)計(jì)合成了帶有疊氮或炔基的4-羥基-2-壬烯醛(HNE)類似物，并將其加入到RKO細(xì)胞(Human colon adenocarcinomacells,人結(jié)腸腺癌細(xì)胞)中，使RKO細(xì)胞中靶蛋白產(chǎn)生羰基化修飾，再加入相對(duì)應(yīng)的接入炔基或疊氮基團(tuán)的生物素，利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)獲得生物素化靶蛋白，最后用鏈霉親和素珠親和純化。針對(duì)鏈霉親和素結(jié)合非特異性蛋白質(zhì)以及生物素標(biāo)簽影響質(zhì)譜檢測(cè)等問(wèn)題，Porter等[29]提出了親和純化-光致分離策略，開(kāi)發(fā)了一種可由光裂解的疊氮-生物素標(biāo)簽，可以實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素捕集的HNE-炔烴探針加合蛋白質(zhì)或肽段的特異性釋放，并用脂質(zhì)衍生親電試劑HNE和4-氧代-2-壬烯醛(4-oxo-2-Nonenal,ONE)的炔基類似物進(jìn)行了一系列定量加合物分析實(shí)驗(yàn)[30]。在此基礎(chǔ)上，Liebler等[31]開(kāi)發(fā)了一種以位點(diǎn)為中心的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，其核心在于在光可切割疊氮基生物素試劑中接入輕重同位素標(biāo)記，有效提高了鑒定位點(diǎn)的可信度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)約400個(gè)HNE修飾位點(diǎn)的大規(guī)模、原位、位點(diǎn)特異性鑒定和定量。

生物正交法局限于只能鑒定特定類型的羰基化修飾，不能捕獲蛋白質(zhì)組中所有類型的羰基化修飾蛋白。合成特定LDE類似物探針成本較高、工作量大，此外，在LDE上接入炔基或疊氮化物可能會(huì)改變它們的物理和化學(xué)性質(zhì)，反過(guò)來(lái)又會(huì)影響其與一些天然靶蛋白的相互作用。

3.2.3 靶向活性羰基的化學(xué)捕集策略

(1)“一體化”生物素探針

利用某些化學(xué)基團(tuán)可以快速動(dòng)力學(xué)和高特異性結(jié)合活性羰基形成穩(wěn)定的共價(jià)加合物的性質(zhì)，將其與生物素連接為探針，再使用親和素進(jìn)行捕獲，可以實(shí)現(xiàn)衍生化羰基化蛋白/肽段的高效富集。其中使用最廣泛的是生物素酰肼(Biotin hydrazide,BHZ)探針[32]。

Yang等[33]將BHZ與樣品中羰基化蛋白反應(yīng)生成亞胺，并用氰基硼氫化鈉特異性還原亞胺穩(wěn)定產(chǎn)物，用鏈霉親和素珠捕集生物素化蛋白，珠上洗滌、還原、烷基化封閉、酶解后，取酶解上清液進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。該研究在單次LC-MS/MS實(shí)驗(yàn)中能夠鑒定老年小鼠中的至少100種羰基化蛋白質(zhì)。

親和素可在廣泛的pH值范圍內(nèi)以非常高的親和力結(jié)合生物素化多肽，使攜帶位點(diǎn)信息的肽段難以從珠上釋放，因而無(wú)法得到所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)中羰基化修飾的具體位點(diǎn)。無(wú)論是為了更深入地理解氧化應(yīng)激導(dǎo)致活組織損傷和功能喪失的原因和機(jī)制，還是為了提高鑒定結(jié)果置信度，鑒定蛋白質(zhì)序列中的氧化位點(diǎn)都是必要的。鑒于此，Regnier等[34]采用親和能力較弱的固定化單體親和素構(gòu)建層析柱，柱上捕獲的生物素化蛋白質(zhì)使用2 mmol/L生物素或0.1 mol/L甘氨酸[18]洗脫下來(lái)，從而獲得含有羰基化位點(diǎn)的肽段。Regnier等[35]在親和富集后通過(guò)反相液相色譜(Reversed-phase liquid chromatography,RPLC)在C8柱上進(jìn)一步分離分析羰基化蛋白質(zhì)，并首次報(bào)道了基于蛋白質(zhì)組學(xué)的人血漿中氧化蛋白的鑒定和表征[36]。

內(nèi)源生物素化蛋白質(zhì)，以及通過(guò)疏水和(或)靜電相互作用與親和素非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和肽段，是生物素探針?lè)ㄨb定羰基化蛋白的主要干擾源[19]。為了有效鑒定特異性純化的蛋白質(zhì)組分并過(guò)濾掉非特異性背景蛋白質(zhì)，Griffin等[37]對(duì)親和純化后的蛋白進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記。該方法結(jié)合了蛋白質(zhì)羰基的生物素酰肼標(biāo)記、親和素親和層析、多重iTRAQ(Isobaric tag for relative absolute quantitation,同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量)試劑穩(wěn)定同位素標(biāo)記等方法，并嘗試在線性離子阱質(zhì)譜儀上使用脈沖碰撞解離(PQD)操作，定量富集得到200多種羰基化蛋白。與之類似的同位素標(biāo)記方法已被廣泛應(yīng)用于人體血漿[38]、鼠血漿[39]、RCS修飾蛋白質(zhì)[40-42]中羰基化的鑒定。

由于羥胺與活性羰基生成產(chǎn)物的肟鍵(Keq>108M-1)比與酰肼反應(yīng)生成產(chǎn)物的腙鍵(Keq約為104～106M-1)穩(wěn)定得多[43]，ARP(Aldehyde-reactive probe，醛反應(yīng)性探針)作為最開(kāi)始被用于DNA修飾檢測(cè)的生物素化羥胺衍生物，因不需要額外的還原步驟，而成為廣泛應(yīng)用的一種酰肼生物素替代品[44-47]。

基于酰肼或羥胺生物素化探針的富集方法，能夠?qū)崿F(xiàn)多種內(nèi)源性羰基化蛋白質(zhì)的高效捕獲，并通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)多種類型內(nèi)源性羰基化的直接鑒定。然而，由于缺乏有效的脫除手段，龐大的生物素基團(tuán)限制了MS分析過(guò)程中羰基化肽序列的碎裂和鑒定效率，并且冗長(zhǎng)的生物素側(cè)鏈的片段化使質(zhì)譜解析變得更加復(fù)雜。針對(duì)以上“一體式”探針面臨修飾位點(diǎn)鑒定效率低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)羰基化修飾肽段可控釋放成為研究的熱點(diǎn)。

(2)“分體式”可控釋放探針

Griffin等[48]提出一種基于固相酰肼(SPH)試劑開(kāi)發(fā)的無(wú)標(biāo)記策略，通過(guò)形成共價(jià)可逆的腙鍵，可在酰肼包被的玻璃珠上捕獲HNE修飾肽，并在較高溫度(60 ℃)和低pH值(10%三氟乙酸或甲酸)下洗脫釋放。類似地，基于Affi-gel酰肼珠的共價(jià)色譜法在自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)方法中得到很好的應(yīng)用，譬如該酰肼珠富集法也被應(yīng)用于糖基化修飾的研究[49]。Maier等[42]將用于相對(duì)定量的d0/d4-琥珀酸酐-肽胺標(biāo)記方法和用于捕獲脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物-肽綴合物的Affi-gel酰肼珠富集方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了羰基化蛋白/肽段的富集和定量分析。Prokai等[40]通過(guò)還原烷基化對(duì)HNE-修飾的肽進(jìn)行二甲基標(biāo)記，使用固相酰肼化學(xué)捕集羰基化肽段，再由酸催化釋放回收。這種以修飾為重點(diǎn)的定量有助于表征蛋白質(zhì)功能的伴隨變化，并且可提供有關(guān)分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的重要信息，加深對(duì)與氧化應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞過(guò)程的理解，但是該方法酸釋放的條件比較苛刻，且仍然面臨釋放不完全的問(wèn)題。

GPR(Girard preagent:1-(2-hydrazino-2-oxoethyl) pyridinium chloride,1-(2-肼基-2-氧代乙基)吡啶鎓氯化物)是最初開(kāi)發(fā)用于衍生和溶解類固醇的系列試劑的一部分[50]，其酰肼基團(tuán)易與羰基反應(yīng)，而季銨基團(tuán)則可向氧化蛋白質(zhì)和肽添加正電荷。Regnier等[51]將GRP與羰基化蛋白質(zhì)反應(yīng)，還原、酶解后用SCX(Strong cation exchange，強(qiáng)陽(yáng)離子交換)色譜法富集。接著，兩種同位素形式的GPR試劑被用于量化和表征酵母提取物中蛋白質(zhì)羰基化位點(diǎn)[52]。與此有異曲同工之妙的是，Lu等[53]開(kāi)發(fā)了基于氟衍生化和FSPE(Fluorous solidphase extraction,氟固相萃取)的新方法，將標(biāo)記的肽與固相氟特異性結(jié)合用于HNE修飾肽富集。該方法的優(yōu)點(diǎn)是氟標(biāo)簽可以在MS分析期間增強(qiáng)HNE修飾肽的強(qiáng)度，從而有助于鑒定HNE-修飾的肽，并促進(jìn)氟衍生化肽段的MS/MS片段化。

AminoxyTMT(Aminoxy tandem mass tag,羥胺串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽)是串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(Tandem mass tag,TMT)同量異位標(biāo)記試劑的衍生物，Griffin等[54]利用其羥胺基官能團(tuán)共價(jià)標(biāo)記蛋白質(zhì)中的活性羰基并實(shí)現(xiàn)了富集。Lu等[55]提出了六重同量異位標(biāo)記親和純化(SiLAP)策略，使用aminoxyTMT標(biāo)記試劑和抗TMT抗體樹(shù)脂同時(shí)實(shí)現(xiàn)HNE修飾蛋白的選擇性富集和特異性位點(diǎn)的準(zhǔn)確定量，量化了2 257種獨(dú)特的HNE修飾肽和1 121種HNE修飾蛋白。

Wang等[56]合成了生物正交的含炔基酰肼探針(HZyne)和羥胺衍生探針(Ayyne)，評(píng)估了它們捕獲HNE修飾的蛋白質(zhì)和殘留位點(diǎn)以進(jìn)行MS鑒定的能力，通過(guò)基于二甲基標(biāo)記的RD-ABPP(Reductive dimethylation-ABPP,還原型二甲基標(biāo)記-ABPP)策略，定量了4 000多個(gè)HNE修飾蛋白細(xì)胞裂解物；通過(guò)TOP-ABPP(Tandem orthogonal proteolysis-ABPP,串聯(lián)正交蛋白水解-ABPP)策略鑒定了約400個(gè)高可信度的HNE加合位點(diǎn)。Yang等[57]使用前述HZyne探針，富集并分析了肽骨架碎裂形成的全局和位點(diǎn)特異性的親電子蛋白質(zhì)降解物，并鑒定到N-甲酰基多肽這一新的羰基化產(chǎn)物。值得注意的是，Yang提及了將定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)與開(kāi)放式搜索工具相結(jié)合的潛在應(yīng)用前景。Wang等[58]開(kāi)發(fā)了一種苯胺衍生的探針，并結(jié)合ABPP策略分析鐵死亡(ferroptosis)中的羰基化蛋白，鑒定到400多種內(nèi)源性羰基化修飾蛋白質(zhì)和20余個(gè)殘基位點(diǎn)。Wang等[59]將苯胺探針用于鑒定丙烯醛(ACR)修飾位點(diǎn)，鑒定了2 300余種蛋白質(zhì)和500余個(gè)由丙烯醛靶向的半胱氨酸位點(diǎn)。

這些基于可控釋放思路開(kāi)發(fā)的新型探針，極大地提高了羰基化蛋白及其位點(diǎn)的鑒定數(shù)量和質(zhì)量，推動(dòng)了蛋白質(zhì)羰基化的研究進(jìn)程，但此類方法操作步驟較為繁瑣，肽段攜帶標(biāo)簽依然較大，因此尚需開(kāi)發(fā)新的更好的方法解決此類問(wèn)題。近來(lái),Aye等在T-REX[60](Targetable reactive electrophiles and oxidants,靶向活性親電物質(zhì)和活性氧)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出G-REX[61]技術(shù)，即在細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)HaloTag蛋白，該蛋白可特異性結(jié)合光籠裝RES(Reactive electrophilic specie,活性親電物質(zhì)，即上文所述RCS)前體。在低能量光照射下，體內(nèi)可控釋放RES，如5 min內(nèi)細(xì)胞最多可釋放出5 μmol/L HNE-炔烴，大大減輕了此前研究體外大劑量暴露相關(guān)的毒性/脫靶效應(yīng)，進(jìn)而提高了所鑒定到羰基化位點(diǎn)的可靠性。可以預(yù)見(jiàn)G-REX在研究氧化應(yīng)激，特別是RES相關(guān)的蛋白質(zhì)羰基化方面的巨大潛力。目前G-REX誘導(dǎo)得到的HNE修飾蛋白依然使用鏈霉親和素點(diǎn)擊/生物素親和富集的方法。如前文所述，這無(wú)疑限制了該技術(shù)的更有效應(yīng)用。我們認(rèn)為應(yīng)該利用新的化學(xué)反應(yīng)，開(kāi)發(fā)新型可逆生物正交探針，其應(yīng)滿足：①高效特異地與羰基化蛋白結(jié)合，最好與活性羰基結(jié)合；②能夠被有效地富集出來(lái)；③與羰基化蛋白的結(jié)合應(yīng)該是可逆的，以方便地釋放富集蛋白/肽段，獲取羰基化位點(diǎn)信息；④如果可能，該探針應(yīng)該與G-REX技術(shù)兼容。G-ERX技術(shù)與新型探針富集技術(shù)的配套使用，必將有力推動(dòng)蛋白質(zhì)羰基化研究的進(jìn)程。

4 結(jié) 語(yǔ)

化學(xué)生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為蛋白質(zhì)羰基化的富集提供了更多的有力工具，而質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展則為蛋白質(zhì)羰基化提供了檢測(cè)手段，兩者的結(jié)合極大地推動(dòng)了蛋白質(zhì)羰基化的研究進(jìn)展。然而，蛋白質(zhì)羰基化具有高度動(dòng)態(tài)性，并且存在數(shù)目繁多的修飾形式，實(shí)現(xiàn)不同類型羰基化的同時(shí)檢測(cè)尚需要富集、檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步完善，并且需要借助相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展。隨著相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，蛋白質(zhì)羰基化的研究必將大為加速，進(jìn)而為闡明氧化應(yīng)激的機(jī)制提供技術(shù)支撐。