PD-L1表達抑制劑的篩選及其抗腫瘤活性

景 磊，趙苗苗，姜 博，李玉銀，刁愛坡

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

腫瘤細胞可以利用免疫檢驗點(immune checkpoint)調節(jié) T淋巴細胞的功能[1]，從而逃逸免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別與殺傷作用．機體免疫細胞的激活與抑制是通過共刺激信號進行調節(jié)，其中程序性死亡蛋白 1(PD-1)與其配體蛋白 PD-L1作為一個主要的免疫檢驗點，是一個負調節(jié)性信號途徑．當 PD-1/PD-L1信號激活后，抑制T淋巴細胞的活化和細胞因子的分泌，使機體免疫應答受到抑制[2–3]．因此，阻斷PD-1/PD-L1信號的傳遞是激活機體抗腫瘤免疫應答的有效途徑[4]．

目前，靶向 PD-1/PD-L1免疫檢驗點的抗體類阻斷劑已經在超過 1000例臨床試驗中被評估并取得了一定的療效[5]，但是，大約 1/3的患者在治療過程中會出現(xiàn)乏力、頭昏、全身肌肉酸痛等現(xiàn)象，部分患者甚至會出現(xiàn)嚴重的免疫相關不良反應[6–8]．與抗體類阻斷劑相比，小分子多肽類藥物則沒有抗體的局限性，如減弱 Fc–免疫效應功能，同時可以避免與免疫相關的不良反應[9]．目前已有許多非抗體類 PD-1/PD-L1信號通路抑制劑被報道，如 PD-1蛋白表面肽段的突變體和 D–型短肽等[10-11]，但是需要進一步的臨床評估．小分子化合物具有高穩(wěn)定性、易穿透性、低成本性和方便口服的特性，具有廣闊的發(fā)展空間，由于 PD-1/PD-L1相互作用結構區(qū)域具有高度疏水的特性，致使靶向于該位點的小分子化合物阻斷劑的發(fā)展遠遠滯后于抗體阻斷劑的發(fā)展．目前只有百時美施貴寶公司設計開發(fā)的一類小分子化合物可以直接作用于PD-1/PD-L1結合位點，如BMS-1、BMS-202等[12-13]．總之，這些阻斷劑主要通過競爭性阻斷PD-1/PD-L1蛋白間的結合，進而解除PD-1/PD-L1介導的免疫抑制信號．

PD-L1蛋白是由 290個氨基酸組成的可被糖基化修飾的 I型跨膜蛋白，在多種惡性實體瘤中高表達，如非小細胞肺癌、三陰性乳腺癌、頭頸癌、黑色素瘤等[14]，其蛋白表達水平因腫瘤類型不同而不同．腫瘤細胞逃逸免疫細胞與PD-L1蛋白表達緊密相連[15–16].盡管 PD-L1在腫瘤免疫中具有重要作用，但是對如何調控 PD-L1蛋白表達，進而促進抗腫瘤免疫活性研究較少，因此，尋找抑制腫瘤細胞PD-L1蛋白表達的小分子化合物具有重要研究意義．本文擬利用熒光素報告基因系統(tǒng)篩選抑制 PD-L1啟動子活性的化合物，通過 RT-PCR、Western blot、細胞共培養(yǎng)體系、ELISA、小鼠成瘤等方法研究其調控 PD-L1蛋白表達和抗腫瘤免疫活性的作用．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細胞、質粒與實驗動物

大腸桿菌(E.coli)Top10購自Invirogen公司；子宮頸癌細胞 HeLa、乳腺癌細胞 MDA-MB-231、小鼠黑色素瘤細胞 B16購自北京協(xié)和醫(yī)學院細胞資源中心；PD-L1啟動子熒光素報告基因質粒 pGL4-hPDL1 本實驗室構建[17]，pCMV-β-Gal購自 Thermo Scientific公司．C57BL/6小鼠(許可證 11400500028097)購自中國食品藥品檢定研究院．

1.1.2 主要試劑

DNA marker、PageRulerTMPrestained Protein Ladder、LipofectamineTM2000，Thermo Scientific 公司；細胞完全培養(yǎng)基 DMEM、RPMI 1640、胰酶，GIBIO 公司；青霉素、鏈霉素、L-Glutamine、熒光素、ONPG溶液，碧云天生物技術有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；小分子化合物庫(L1300 Selleck FDA Approved Drug Library)，Selleck公司；hPD-L1抗體(EPR19759)、mPD-L1(EPR20529)，Abcam 公司；β-actin、Goat anti-rabbit IgG-HRP、Goat anti-mouse IgG-HRP，天津三箭生物技術有限公司；硫酸長春新堿(HY-N0488)，MCE公司；Mouse IL-2 ELISA kit、mouse γ-IFN ELISA kit，科諾迪生物技術有限公司．

1.2 方法

1.2.1 PD-L1表達抑制劑篩選

待HeLa細胞于3cm培養(yǎng)皿中長至70%～80%時，共轉染 5μg pGL4-hPD-L1 和 1μg pCMV-β-Gal質粒，8h后換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 12h，然后以15000個/孔的細胞密度鋪 96孔板，24h后用 3%FBS的 DMEM 培養(yǎng)基稀釋小分子化合物(終濃度1μmol/L)和等量 DMSO(作為對照)處理 HeLa細胞24h．棄培養(yǎng)基，每孔加入 100μL細胞裂解液，冰上裂解30min，每10min振蕩一次．吸取40μL裂解樣品于 96孔白板中，加入熒光素酶底物溶液 105μL，測定熒光素酶活性值；同時吸取 40μL裂解樣品于96孔板，加入48μL Buffer Z(使用前每10mL buffer Z 緩沖液 36μL β–巰基乙醇)，再迅速加入 16μL 6mg/mL的 ONPG溶液，待有一個孔的溶液變黃時，測定 420nm 波長下的吸光度(β–半乳糖苷酶活性值)．

1.2.2 RT-PCR

分別用 DMSO和 10nmol/L硫酸長春新堿(vincristine sulfate，VCR)預處理 MDA-MB-231 細胞24h，Trizol試劑提取 Total RNA，并進行逆轉錄及PCR反應，依照說明書的方法進行操作，其中 RT反應條件：50℃ cDNA 合成 30min，85℃孵育5min．PCR反應條件：94℃預變性5min；變性30s，55℃退火 30s，72℃延伸 1min，29個循環(huán)；72℃延伸 5min．PD-L1和 β-actin引物序列分別為：PD-L1上游 5′-GACCTATATGTGGTAGAGTATGG-3′，下游5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′；β-actin 上 游 5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′，下游 5′-GGCATTGA CTTTCACAG-3′．用 2μg/mL PHA 誘導 Jurkat細胞48h后，按照上述方法提取 Total RNA并 RT-PCR，PD-1引物序列為：PD-1上游 5′-CCAGGATGGT TCTTAGACTCC-3′，下游 5′-GGCTGGCCTGGGTGA GGGGCTG-3′．

1.2.3 MTT法檢測細胞活力

96孔板每孔接種 8000個細胞，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度梯度的 VCR，每個濃度梯度設置3個復孔．VCR 分別處理 24、48、72h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄孔板內液體，每孔加入 200μL DMSO，水平振蕩器上振蕩10min，酶標儀測定490nm處吸光度．

1.2.4 MTT法檢測Jurkat細胞對腫瘤細胞殺傷活性

DMSO和10nmol/L VCR分別處理MDA-MB-231細胞 48h，再分別接種于 96孔板，5000個/孔，設置 4個重復．待細胞貼壁后按照 E﹕T(Jurkat﹕MDA-MB-231)比為 4﹕1和 8﹕1的比例加入活化的 Jurkat細胞[18](2μg/mL PHA 預處理 Jurkat細胞48h)共培養(yǎng) 24h．每孔加入 20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 4h，不吸出培養(yǎng)基直接每孔加入甲瓚裂解液[19-20]100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育 8h，水平振蕩器上振蕩 10min，酶標儀測定 570nm 處吸光度(A)．腫瘤殺傷率按照式(2)計算．

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血清細胞因子含量

用肝素抗凝管收集 C57BL/6小鼠血液，1000r/min離心10min，取上清液．按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清中 IL-2和 γ-IFN的含量．

1.2.6 小鼠成瘤實驗

21只 6～8周齡的雌性 C57BL/6小鼠購自中國食品藥品檢定研究院，取培養(yǎng)至對數生長期的小鼠黑色素瘤細胞 B16用生理鹽水配制成為 1×107mL-1的細胞懸浮液，每只小鼠右前肢腋下接種 100μL細胞懸浮液．當觀察到腫瘤出現(xiàn)后隨機分為 3組，每組 7只，開始給藥．給藥濃度分別為 0.5mg/kg和1.5mg/kg，對照組給予等量生理鹽水，每隔 1d腹腔注射給藥一次，同時用游標卡尺測量腫瘤的長徑(mm)和短徑(mm)，按照式(3)計算腫瘤體積．在第13天處死小鼠，眼球取血，用于檢測小鼠血液細胞因子分泌情況．同時剝離腫瘤，凍存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)免疫印跡實驗．

1.3 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS軟件進行數據的整理分析，采用 t檢驗進行組間比較，檢驗結果P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，*、**和***分別表示與對照組比較 P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001．

2 結果與分析

2.1 PD-L1表達抑制劑篩選

利用實驗室保存的 PD-L1啟動子熒光素報告基因質粒pGL4-hPD-L1和β–半乳糖苷酶報告基因質粒pCMV-β-Gal共轉染 HeLa細胞，設置藥物篩選濃度為 1μmol/L，篩選抑制 PD-L1啟動子活性的小分子化合物，結果如圖1所示．

圖1 抑制PD-L1啟動子活性小分子化合物的篩選Fig. 1 Screening of 311 small molecule compounds downregulating the activity of PD-L1 promoter

篩選了化合物庫中 311種小分子化合物(圖1(a))，其中硫酸長春新堿(VCR)具有濃度梯度依賴性抑制PD-L1啟動子活性效果(圖1(b))，在VCR濃度1μmol/L時抑制率約為60%．

2.2 VCR抑制MDA-MB-231細胞PD-L1蛋白表達

乳腺癌細胞系MDA-MB-231能夠高表達PD-L1蛋白[21]．首先通過 MTT法檢測 VCR對 MDA-MB-231細胞活力的影響，結果如圖 2(a)所示．當藥物處理濃度小于10nmol/L時，VCR對MDA-MB-231細胞活力影響較小．

圖2 VCR抑制MDA-MB-231細胞中PD-L1表達Fig. 2 VCR suppressing PD-L1 expression in MDA-MB-231 cells

用10nmol/L VCR處理MDA-MB-231細胞24h后提取全 RNA，RT-PCR檢測 PD-L1mRNA水平變化，結果如圖2(b)所示，VCR下調MDA-MB-231細胞 PD-L1mRNA表達水平．不同濃度的 VCR處理MDA-MB-231細胞 48h后收集細胞，制備蛋白樣品，免疫印跡實驗(Western blot)檢測 PD-L1蛋白水平變化．結果(圖 2(c))顯示，隨著 VCR藥物濃度增加，PD-L1蛋白水平呈濃度依賴性減少．以上結果表明，VCR通過下調 MDA-MB-231細胞 PD-L1基因的轉錄活性，進而抑制細胞PD-L1蛋白表達．

2.3 VCR增強 JurkatT細胞對 MDA-MB-231細胞的殺傷能力

植物血凝素(phytohemagglutination，PHA)能夠誘導人 T淋巴細胞株 Jurkat細胞表達 PD-1[22]．用2μg/mL PHA誘導Jurkat細胞48h后，RT-PCR方法檢測 Jurkat細胞 PD-1表達變化，結果如圖 3(a)所示．與無 PHA 誘導相比，2μg/mL PHA 處理促進Jurkat細胞PD-1mRNA水平明顯升高．

通過 Jurkat細胞和 MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)，MTT法檢測VCR處理MDA-MB-231后Jurkat細胞對其殺傷能力的影響，結果如圖 3(b)所示．在 E﹕T比為 4﹕1和 8﹕1時，與 DMSO 對照組相比，用10nmol/L VCR處理組均能夠增加 Jurkat細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷率．研究結果顯示，當用VCR抑制 MDA-MB-231細胞 PD-L1蛋白表達后，阻斷了由 PD-1/PD-L1信號介導的免疫抑制，從而增強Jurkat細胞對MDA-MB-231細胞殺傷作用．

圖3VCR增強 Jurkat細胞對 MDA-MB-231細胞的殺傷作用Fig. 3 VCRenhancing the killing activity of Jurkat cells to MDA-MB-231cells

2.4 VCR抑制B16細胞PD-L1蛋白表達

由以上結果可知，VCR通過抑制 PD-L1啟動子活性下調MDA-MB-231細胞PD-L1蛋白表達，然而VCR在體內是否通過抑制PD-L1表達而增強機體的抗腫瘤活性有待深入了解．由于 MDA-MB-231細胞在免疫系統(tǒng)正常的小鼠體內無法成瘤，而 B16細胞C57BL/6小鼠成瘤模型在PD-1/PD-L1抑制劑檢測方面有著廣泛的應用[23-24]，因此選擇小鼠 B16細胞研究VCR對其在小鼠體內成瘤情況以及調控機體的抗腫瘤活性．首先，用不同濃度的 VCR處理 B16細胞48h后，收集蛋白樣，Western blot檢測 PD-L1蛋白表達情況，結果如圖 4所示．VCR化合物濃度大于40nmol/L時，VCR處理 B16細胞中 PD-L1蛋白水平明顯降低．以上結果表明，VCR能夠下調 B16細胞PD-L1蛋白表達水平．

圖4 VCR抑制B16細胞PD-L1蛋白表達Fig. 4 VCR inhibiting the expression of PD-L1 in B16 cells

2.5 VCR抑制B16在C57BL/6小鼠體內成瘤

將 B16細胞接種到 C57BL/6小鼠皮下成瘤，在接種第5天分別用0、0.5、1.5mg/kg VCR腹腔給藥，每隔1d給藥一次，共給藥4次；同時測量腫瘤大小，第 13天處死小鼠前最后一次測量腫瘤大小，結果如圖5所示．

與對照組相比，隨著腫瘤生長時間的延長，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR給藥組的腫瘤生長受到顯著抑制，其中 1.5mg/kg組腫瘤生長抑制更加明顯．第 13天時 0.5mg/kg 和 1.5mg/kg VCR給藥組的腫瘤體積和質量也明顯小于對照組．對照組和0.5mg/kg組小鼠體重無差異，1.5mg/kg組體質量有略微下降，其中一只死亡．以上結果表明，VCR能夠抑制 B16細胞在 C57BL/6小鼠體內成瘤，高劑量VCR會對小鼠產生毒副作用．

2.6 VCR調控C57BL/6小鼠抗腫瘤免疫活性

每組選取上述 5個黑色素瘤腫瘤組織通過研磨裂解制備樣品，Western blot檢測腫瘤組織中 PD-L1蛋白水平，結果如圖 6(a)所示，與對照組相比，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR給藥組腫瘤組織中PDL1蛋白水平呈整體下降趨勢．參與抗腫瘤免疫應答的 T細胞有很多種，其中細胞毒性 T細胞(Tc)和輔助性 T細胞(Th)在增強抗腫瘤免疫應答過程中發(fā)揮著主要作用，而Th細胞可以產生IL-2、γ-IFN等細胞因子增強機體免疫活性[25-26]．通過 ELISA 方法檢測C57BL/6小鼠血清中細胞因子IL-2和γ-IFN含量變化，結果(圖 6(b)和 6(c))顯示，與對照相比，0.5mg/kg和 1.5mg/kg組均能夠上調血清中細胞因子 IL-2和 γ-IFN水平．以上結果表明，VCR通過抑制B16細胞中PD-L1蛋白表達阻斷PD-1/PD-L1信號，增加T細胞分泌IL-2和γ-IFN，從而增加機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷作用．

3 討 論

VCR是從長春花中提取的一種生物堿，其作用于細胞微管蛋白，抑制微管聚合，從而干擾腫瘤細胞分裂[27]．臨床上常作為抗腫瘤藥物，主要應用于治療急性淋巴細胞白血病(ALL)、神經母細胞瘤[28]等，但由于其對神經系統(tǒng)和注射局部正常組織刺激性大，限制其臨床應用[29]．目前臨床上通常采用聯(lián)合用藥的方法降低 VCR的劑量，從而降低 VCR的毒副作用[30]，如無毒劑量的維拉帕米與低濃度 VCR聯(lián)合使用可使其抑制胃癌細胞增殖作用增強 2.7～7.5倍[31]，VCR和甲基潑尼松龍聯(lián)合對 ALL效果比單用 VCR效果顯著[32]．本文研究顯示：10nmol/L的VCR在體外下調乳腺癌 MDA-MB-231細胞 PD-L1mRNA水平和蛋白水平；VCR在體內抑制 B16細胞成瘤和PD-L1蛋白表達，并且上調 C57BL/6小鼠血清中細胞因子 IL-2和 γ-IFN的含量．這些研究結果表明，VCR可以通過抑制腫瘤組織細胞中PD-L1蛋白表達調控PD-1/PD-L1信號，并解除對腫瘤浸潤性T細胞的抑制狀態(tài)，從而增強 T細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷作用．

目前，免疫療法聯(lián)合用藥越來越受到人們的關注，已有多種聯(lián)合用藥方案應用于臨床并取得了令人意外的療效[33]，如 keytruda/pemetrexed/carboplatin三藥聯(lián)合已經成為轉移性非鱗狀 NSCLC的一線治療藥物[34]．三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)發(fā)病率約占乳腺癌的 15%，是乳腺癌的一種獨立臨床病理類型，具有預后差、侵襲能力強等特點[35]．由于其具有獨特的生物學特征，現(xiàn)有的內分泌治療和分子靶向治療等治療方式不能滿足 TNBC患者治療的臨床需求[36]．研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤相關抗原3(melanoma associated antigen 3，MAGEA3)在多達40%的 TNBC患者中特異性表達，可以作為腫瘤疫苗靶點用于 TNBC患者的臨床治療[37]．本文發(fā)現(xiàn)VCR在納摩爾水平就可以抑制乳腺癌細胞 MDAMB-231 PD-L1蛋白表達，同時也發(fā)現(xiàn)高劑量 VCR給藥會對小鼠有毒副作用．因此，適合劑量 VCR與MAGEA3腫瘤疫苗聯(lián)合使用，有望改善單藥治療在臨床應用上的局限性，使患者獲得更大的治療效果．