吳殿輝，李曉敏，蔡國林，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸健*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4(浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310015)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)，又名尿烷(urethane)，廣泛存在于發(fā)酵食品(腐乳、醬油等)、釀造酒(黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等)和蒸餾酒(威士忌、白蘭地等)中[1-7]。我國黃酒中EC含量普遍高于清酒和葡萄酒，最高達1 210 μg/L[2, 8-9]。黃酒中EC含量偏高的問題由來已久，不僅帶來了嚴峻的食品安全問題，同時也使黃酒的出口受到嚴重限制，是我國黃酒產(chǎn)業(yè)的一個重要安全隱患。因此，探索適合我國黃酒企業(yè)控制EC含量的措施，降低黃酒中EC的含量，對于我國黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

研究表明，發(fā)酵食品和酒精飲品中的EC主要由尿素和瓜氨酸等氨甲酰化合物與乙醇反應生成。在相同的反應條件下，黃酒中的尿素與乙醇反應形成EC的速率約為相同濃度的瓜氨酸與乙醇反應形成EC速率的3倍[10]。因此，尿素是黃酒中形成EC的主要前體物質(zhì)，而黃酒中的尿素主要由釀酒酵母Saccharomycescerevisiae在發(fā)酵過程中代謝精氨酸產(chǎn)生[11]。釀酒酵母在精氨酸酶(由CAR1編碼)的作用下降解精氨酸生成尿素和鳥氨酸。尿素會在脲基酰胺酶(由DUR1,2編碼)的作用下降解為NH3和CO2。因此，通過代謝工程改造敲除CAR1基因或高效表達DUR1,2基因，可以阻斷酵母的尿素生成途徑或強化其尿素的降解途徑，從而從根源上減少黃酒發(fā)酵過程中尿素的積累和EC的形成。

本研究室在前期工作中，以黃酒工廠生產(chǎn)用酵母N85為出發(fā)菌株，通過食品級代謝工程改造構建了既可敲除CAR1又可高效表達DUR1,2的酵母工程菌N85DUR1,2-c。黃酒發(fā)酵實驗表明，與出發(fā)菌株相比，工程菌N85DUR1,2-c所釀黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的含量分別降低了89.1%和55.3%，且理化指標無明顯差異[12]。本文研究了黃酒發(fā)酵工藝參數(shù)對工程菌N85DUR1,2-c發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響，并通過50 kL的生產(chǎn)試驗考察其發(fā)酵性能和降低黃酒中尿素和EC含量的能力，以期為工業(yè)化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母S.cerevisiaeN85，由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供的黃酒廠生產(chǎn)用菌株。本實驗室以N85為親本菌株，通過敲除其CAR1基因，并在DUR1,2基因起始密碼子前插入釀酒酵母強啟動子PGK1p，構建了低產(chǎn)尿素的釀酒酵母工程菌N85DUR1,2-c[12]，以上菌株均儲存于本實驗室。

1.1.2 釀造原料

糯米、麥曲(生麥曲和熟麥曲)均由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。其中，熟麥曲為接種米曲霉(Aspergillusoryzae)蘇-16的純種麥曲。

1.1.3 主要試劑

9-羥基占噸醇(≥99.0%)、氨基甲酸正丁酯(nBC，≥98.0%)、氨基甲酸乙酯(≥99.0%)以及尿素標準品(99.0%)均購于Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

SW-CJ-IF超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；OPTIKA-B350生物顯微鏡，意大利MAD公司；LS-B50L自動高壓蒸汽滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；GZX-9246 MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SKY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實業(yè)有限公司；SHP-2500低溫生化培養(yǎng)箱，上海精密實驗設備有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)色譜柱，美國Agilent公司；QP2010Ultra GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒發(fā)酵工藝對酵母工程菌低產(chǎn)尿素和EC能力的影響

實驗室黃酒發(fā)酵工藝流程：浸米→蒸飯→冷卻→拌曲→接種→前酵→后酵→過濾澄清。按照參考文獻[13]的方法，將工程菌N85DUR1,2-c與親本菌株N85分別進行黃酒發(fā)酵，并通過單因素實驗，考察酵母接種量、主酵溫度和麥曲添加量對發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響。

初始發(fā)酵工藝：酵母種子液濃度為2×107個/mL，主酵溫度為30 ℃，麥曲添加量為17%(質(zhì)量分數(shù))。

1.2.1.1 不同酵母接種量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

將親本菌株N85和工程菌N85DUR1,2-c的種子液濃度分別稀釋成0.5×107、1×107、2×107、3×107、4×107個/mL，100 g糯米的黃酒發(fā)酵體系中分別添加5種不同濃度的酵母種子液5 mL，其他發(fā)酵工藝參數(shù)不變，考察經(jīng)不同酵母接種量進行黃酒發(fā)酵后發(fā)酵液中尿素和EC的含量。

1.2.1.2 不同主酵溫度對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

其他發(fā)酵工藝參數(shù)不變，考察主酵溫度分別為24、27、30、33、36 ℃時黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的含量。

1.2.1.3 不同麥曲添加量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

其他發(fā)酵工藝參數(shù)不變，考察麥曲添加量分別為11%、14%、17%、20%、23%時黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的含量。

1.2.2 黃酒大生產(chǎn)試驗

參考某紹興黃酒廠的實際生產(chǎn)工藝，將工程菌N85DUR1,2-c在酒廠進行50 kL發(fā)酵罐的生產(chǎn)試驗，考察工程菌的生長和發(fā)酵性能以及黃酒發(fā)酵液的各項理化指標。

1.2.3 黃酒發(fā)酵液常規(guī)理化指標的測定

黃酒發(fā)酵液中酒精、總糖、pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮等含量的測定參考黃酒國標GB/T 13662—2008的測定方法[14]。

1.2.4 黃酒中尿素含量的檢測

采用高效液相色譜法，結合熒光檢測器測定黃酒中尿素的含量[15]。

1.2.5 黃酒中EC含量的檢測

以nBC為內(nèi)標，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS)測定黃酒中EC的含量[5]。

1.2.6 黃酒發(fā)酵液貯存過程中EC含量變化的預測

參照黃酒中EC生成動力學方程W=2.950×1019×e-14551/T×S0×t，預測黃酒發(fā)酵液在貯存過程中EC含量的變化。其中EC的生成量(W)與黃酒中尿素初始濃度(S0)、貯存時間(t)和熱力學溫度(T)成正比[16]。

三是有利于開辟教學新模式。借助“兩微”能以更直接的方式了解學生心聲，聽取企事業(yè)單位意見，接受群眾、家長和社會評判，有利于以開放、平等、包容的心態(tài)與學生平等交流、友好溝通，增強互動、拉近距離，讓更多的人來關注會計教學工作，實現(xiàn)學生由被動、消極地學習向主動參與、積極融入轉變，教師由呆板、枯燥的說教向積極引導、因材施教轉變。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)進行3次測定，運用SPSS 19.0軟件進行方差計算和差異性分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝對酵母工程菌低產(chǎn)尿素和EC能力的影響

2.1.1 酵母接種量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

傳統(tǒng)紹興黃酒發(fā)酵時，酵母的數(shù)量和質(zhì)量會影響黃酒的出酒率和風味。此外，黃酒釀造是淀粉糖化和酵母發(fā)酵同時進行的過程，因此，控制合適的酵母接種量尤為重要。既要保證發(fā)酵醪液中的糖分足夠釀酒酵母生長和發(fā)酵所需，又要保證有足夠數(shù)量的釀酒酵母可以及時利用糖化形成的營養(yǎng)物質(zhì)，從而避免糖分的積累和高滲透壓的出現(xiàn)，影響釀酒酵母的生長和發(fā)酵性能。由圖1可知，酵母接種量不同時，工程菌N85DUR1,2-c和親本菌株N85發(fā)酵液中尿素和EC的含量均沒有變化，說明酵母接種量在(0.5～4)×107個/mL時對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的含量基本無影響。

A- 尿素；B- EC圖1 酵母接種量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響Fig.1 Effect of yeast inoculation amount on urea and EC content in fermented Huangjiu sample

2.1.2 主酵溫度對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

由圖2可知，主酵溫度不同時，工程菌N85DUR1,2-c發(fā)酵液中尿素和EC的含量沒有變化，說明主酵溫度對工程菌降低發(fā)酵液中尿素含量的能力無影響。而親本菌株N85在較低溫度(24 ℃)和較高溫度(33 ℃和36 ℃)時，發(fā)酵液中尿素和EC的含量較低，主酵溫度為27 ℃和30 ℃時發(fā)酵液中尿素和EC的含量較高。這是因為，釀酒酵母在24 ℃時生長代謝緩慢，發(fā)酵以較慢的速度進行，因而代謝精氨酸產(chǎn)生的尿素含量也低。而在27 ℃和30 ℃時，釀酒酵母生長速度加快，糖化與發(fā)酵保持良好的平衡，釀酒酵母在代謝精氨酸的同時會產(chǎn)生尿素，使發(fā)酵液中尿素的含量增加。當主酵溫度在33 ℃以上時，發(fā)酵醪液中存在的霉菌和細菌基本處于最適生長溫度，大量分泌蛋白酶和淀粉酶等水解酶系，在發(fā)酵初期即將大分子物質(zhì)迅速降解為可供釀酒酵母生長和發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)。大量偏好型氮源(絲氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等)[17]的存在使得釀酒酵母對精氨酸的利用減少(圖3)，從而減少了發(fā)酵液中尿素的含量以及EC的形成。

A- 尿素；B- EC圖2 主酵溫度對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the concentr-ations of urea and EC in the fermented Huangjiu sample

圖3 不同發(fā)酵溫度下黃酒發(fā)酵液中氨基酸含量的檢測Fig.3 Detection of amino acids contents in Huangjiusample fermented at different fermentation temperature

2.1.3 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

A- 尿素；B- EC圖4 麥曲添加量對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響Fig.4 Effect of wheat Qu amount on the concentrationsof urea and EC in the fermented Huangjiu sample

圖5 不同麥曲添加量黃酒發(fā)酵液中氨基酸的含量Fig.5 Detection of amino acids contents in Huangjiusample fermented with different amounts of wheat Qu

以上單因素實驗結果表明，黃酒發(fā)酵過程中主酵溫度、接種量和麥曲添加量等主要工藝參數(shù)對工程菌N85DUR1,2-c低產(chǎn)尿素和EC的能力均無影響，且含量低于親本菌株，說明工程菌N85DUR1,2-c在不同的發(fā)酵工藝條件下都可以有效地降低發(fā)酵液中尿素和EC的含量。這是因為CAR1基因的敲除阻斷了工程菌代謝精氨酸生成尿素的途徑，DUR1,2基因的高效表達強化了尿素的降解途徑，因此，工程菌在黃酒發(fā)酵過程中不僅不產(chǎn)生尿素還能高效地降解原料中帶入的尿素，最終減少黃酒發(fā)酵液中尿素和EC的積累。

2.2 酵母工程菌在黃酒工廠生產(chǎn)試驗中的釀造特性

2.2.1 酵母工程菌對黃酒發(fā)酵液理化指標的影響

將二倍體黃酒酵母工程菌N85DUR1,2-c與親本菌株N85在黃酒廠分別進行50 kL的黃酒生產(chǎn)試驗，考察工程菌在工廠實際生產(chǎn)條件下的發(fā)酵性能。由發(fā)酵液中理化指標檢測結果(表1)可知，工程菌與親本菌株發(fā)酵液中酒精含量基本相同，說明其發(fā)酵能力與親本菌株基本沒有差異。另外，發(fā)酵結束后酒液中總糖、總酸和氨基酸態(tài)氮含量以及pH值基本相同，符合黃酒國標標準。

表1 黃酒發(fā)酵液理化指標的測定Table 1 Measurement of metabolites contents in Huangjiusample fermented by different strains

注：同一行中，均與N85的數(shù)據(jù)相比，*，表示對應P<0.05差異的顯著性，不標注者表示差異不顯著(P<0.05)(下同)

由表2和表3可知，生產(chǎn)試驗發(fā)酵液中氨基酸和主要風味物質(zhì)含量的檢測結果與先前實驗室三角瓶發(fā)酵實驗結果基本一致[12]。由于DUR1,2的高效表達促進了工程菌N85DUR1,2-c對尿素的利用，對天冬氨酸、谷氨酰胺等偏好型氮源的利用相對減少，所以，工程菌發(fā)酵液中天冬氨酸和谷氨酰胺的含量稍高于N85。同時，由于CAR1的敲除，使得N85DUR1,2-c對精氨酸的利用能力降低，所以其發(fā)酵液中精氨酸含量高于N85，而由精氨酸降解生成的鳥氨酸的含量也隨之減少。此外，精氨酸利用率的降低會促使黃酒發(fā)酵液中高級醇含量的下降[18]。因此，與親本菌株N85相比，N85DUR1,2-c發(fā)酵液中異戊醇和異丁醇的含量略低。而高級醇，尤其是異戊醇是黃酒中引起“上頭”的主要物質(zhì)，高級醇含量的降低使得黃酒中風味物質(zhì)更加協(xié)調(diào)、柔和[19]。另外，2個菌株發(fā)酵液中其他醇類、醛類、酸類和酯類等揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量沒有明顯差異。

表2 黃酒發(fā)酵液中氨基酸含量的比較單位：mg/L

表3 黃酒發(fā)酵液中風味物質(zhì)含量的比較單位：mg/L

2.2.2 酵母工程菌對黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的影響

將2個酵母菌株黃酒生產(chǎn)試驗的發(fā)酵液進行尿素和EC含量的檢測，結果如表4所示，工程菌N85DUR1,2-c發(fā)酵液中尿素含量僅為(2.4±0.2) mg/L，與親本菌株相比，尿素降低了90.7%。同時，N85DUR1,2-c發(fā)酵液中EC含量降低了54.6%，僅為(14.9±0.6) μg/L，而且發(fā)酵液經(jīng)過90 d室溫貯存后EC含量僅增加34.9%，為(20.1±0.4) μg/L，而N85發(fā)酵液經(jīng)過90 d貯存后EC含量達到(70.3±1.6) μg/L，增幅達114.3%。這是因為CAR1基因的敲除和DUR1,2基因的高效表達，不僅阻斷了工程菌N85DUR1,2-c代謝精氨酸生成尿素的途徑，而且增強了其對發(fā)酵醪液中尿素的利用能力，從而大大降低了黃酒發(fā)酵液中尿素的含量，前體物含量的降低也就使得發(fā)酵液在貯存過程中形成EC的數(shù)量減少，增幅緩慢。

表4 黃酒發(fā)酵液中尿素和EC含量的比較Table 4 Comparison of urea and EC contents in Huangjiusample fermented by different strains

注：同一列中，所有數(shù)據(jù)均與N85的數(shù)值相比；*，表示對應P<0.001差異的顯著性

2.3 黃酒發(fā)酵液貯存過程中EC含量變化的預測

在黃酒生產(chǎn)過程中，大部分EC主要在煎酒、滅菌等高溫工段以及長時間儲酒過程中形成，發(fā)酵過程中形成的EC是很有限的[20-21]。尿素是黃酒中形成EC的主要前體物質(zhì)，尿素含量的高低以及與酒精發(fā)生反應時間的長短與黃酒中EC的含量呈正相關[16]。因此，本論文構建的酵母工程菌N85DUR1,2-c可以大幅度地降低發(fā)酵液中尿素的含量，不僅能夠減少黃酒發(fā)酵過程中EC的形成也可以減少長時間儲酒過程中EC的增加量。以50 kL黃酒生產(chǎn)試驗的發(fā)酵液為研究對象，通過黃酒中EC形成的動力學方程預測發(fā)酵液在25℃貯存過程中EC含量的變化。由表5結果所示，利用EC動力學方程預測的N85和N85DUR1,2-c發(fā)酵液貯存90 d后EC含量分別為76.3 μg/L和19.0 μg/L，與上文直接測定結果的趨勢基本一致，說明該動力學方程可用。由預測結果可知，貯存1 年后，N85和N85DUR1,2-c發(fā)酵液中EC含量分別為209.2 μg/L和31.2 μg/L，增幅為537.9%和110.6%，工程菌發(fā)酵液在貯存過程中EC含量增加幅度遠小于親本菌株N85。而且貯存3 年、5 年、10 年和30 年后，N85DUR1,2-c發(fā)酵液中EC的含量僅為N85發(fā)酵液中EC含量的10%左右。此外，尿素在長時間儲存過程中也會逐漸降解，濃度會有所降低，實際生成的EC量要低于預測值。因此，尿素濃度的降低大大減少了長時間儲酒過程中EC的形成，提高了黃酒的飲用安全性。

表5 黃酒發(fā)酵液貯存過程中EC含量的預測Table 5 Prediction of EC contents in Huangjiu sample during storage

注：yr，年同一列中，所有數(shù)據(jù)均與N85的數(shù)值相比；*，表示對應P<0.001差異的顯著性

3 結論

本研究室在前期研究中利用食品級代謝工程改造并構建了低產(chǎn)尿素的酵母工程菌N85DUR1,2-c，(1)黃酒發(fā)酵工藝參數(shù)的改變對工程菌N85DUR1,2-c發(fā)酵液中尿素和EC的含量基本沒有影響，而不同主酵溫度和麥曲添加量會顯著影響親本菌株N85發(fā)酵液中尿素和EC的含量。說明工程菌N85DUR1,2-c在不同的發(fā)酵工藝條件下均可以有效地降低發(fā)酵液中尿素和EC的含量。(2)50 kL黃酒生產(chǎn)試驗表明，工程菌N85DUR1,2-c發(fā)酵性能與親本菌株N85基本沒有差異。與親本菌株N85相比，N85DUR1,2-c發(fā)酵液中尿素和EC的含量分別降低了90.7%和54.6%，而且在長時間貯存過程中EC的含量增加緩慢，提高了黃酒的飲用安全性。