郭俐麟　唐冰雯

摘? 要：目的：建立LC/MS/MS法測定大鼠血漿中柚皮苷濃度，并考查其藥代動力學特征。方法：采用Sepax HP-C₁₈色譜柱：（100 mm×2.1 mm，5 μm），以甲醇-2 mmol·L^-1醋酸銨溶液（65：35）為流動相;流速：0.3 ml·min^-1。離子源為ESI源，正離子模式進行檢測。結(jié)果：大鼠靜脈注射給藥柚皮苷后，血漿中可以迅速檢測到大量的柚皮苷與少量的代謝產(chǎn)物柚皮素。柚皮苷的T_max為0.083 h，達峰濃度C_max為56583.33 ng·ml^-1;柚皮素葡萄糖醛酸結(jié)合物的T_max為12 h，達峰濃度C_max為653.68 ng·ml^-1。結(jié)論：該方法選擇性強、靈敏度好，可用于測定大鼠生物樣本中柚皮苷及其代謝產(chǎn)物柚皮素的濃度。

關(guān)鍵詞：柚皮苷;柚皮素;LC/MS/MS;藥代動力學

Abstract Objective：To establish a LC/MS/MS method for the determination and pharmacokinetic study of naringin in rats plasma.Method：A Sepax HP-C_18? column was used，with the mobile phase of methanol-2 mmol·L^-1 ammonium acetate（65：35）.The flow rate：0.3 ml·min^-1.The determination used electrospray ionization mass spectrometry with positive ionization mode.Results：After intravenous administration the naringin，in blood，we can rapidly determine many naringin and a little naringenin in vivo.Tmax of? naringin is 0.083 h，Cmax is 56583.33 ng·ml^-1;Tmax of naringenin glucuronides is 12 h，Cmax is 653.68 ng·ml^-1.Conclution：The method is selective and sensitive and can be used to determine the concentration of naringin and its metabolite（naringenin）.

Key words：naringin;naringenin;LC/MS/MS;pharmacokinetics

柚皮苷屬于二氫黃酮苷，主要存在于柚、葡萄柚和酸橙及其變種的果皮及果實中，研究表明其具有抗氧化^[1][2]、抑菌^[3]、抗癌^[4][5]等作用，柚皮苷作為一類重要的中藥化學成分，由于它的功效顯著，具有良好的開發(fā)前景，對其的研究也愈來愈熱，對它的吸收和代謝等的藥代動力學研究必將愈加深入，藥代動力學方法學研究是藥代動力學研究的基石，然而柚皮苷在藥代動力學及其方法學方面的研究報道較少^[6]，多數(shù)采用高效液相色譜法進行研究，其靈敏度不夠高，分析時間長。采用LC/MS/MS法對其進行定性和定量分析，可提高靈敏度，縮短分析時間，提高了工作效率，這對全面進行柚皮苷藥代動力學研究發(fā)揮了厚積薄發(fā)的作用，進而對于了解柚皮苷的作用機制，指導臨床合理用藥、優(yōu)選用藥方案、指導柚皮苷劑型改革和新藥研究設計都具有重要的意義。

1 儀器、試藥

1.1 儀器

美國應用生物系統(tǒng)公司（AB）API 3000 型號LC/MS/MS 液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子化源（ESI），大氣壓化學離子化源（APCI），島津Shimadzu LC-10 AD_VP 雙高壓梯度洗脫裝置、DGM-12 AM 在線脫氣機，并配有直接進樣用針泵及1 ml進樣器以及AB公司ANALYST 1.3 數(shù)據(jù)處理軟件;Shimadzu ΜV-2501 PC 紫外分光光度計、日本島津Shimadzu LC-Vp series 高效液相儀系統(tǒng);上海安亭科學儀器廠TGL-16G 離心機;組織勻漿器;上海滬西分析儀器廠WH-3 渦旋混合儀;分析天平（Mettler Toledo，AG 135）

1.2 試藥

對照品柚皮苷（批號：110722-200708，中國生物制品檢定所）;對照品柚皮素（批號：09020121，上海同田生物技術(shù)有限公司）;橙皮苷（批號：110721-200512，中國生物制品檢定所）;

甲醇（色譜純，美國Fisher公司）;醋酸銨（色譜純，美國TEDIA公司）;純化水;乙酸乙酯（分析純）

2 動物與給藥方式

SD 大鼠（SPF級，動物合格證號為SCXK（粵）2003-0002，粵監(jiān)證字2006A015）20只，雌雄各半，體重300±20 g。SD 大鼠10只，分為2組，實驗前一天禁食12 h，自由飲水，按45mg/kg劑量給藥，靜脈注射給藥柚皮苷原料，于預定的時間點（0 min，5 min，10 min，15 min，30 min，35 min，45 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h）大鼠眼眶取血。

3 檢測條件

3.1 色譜條件 色譜柱：Sepax HP-C₁₈（100 mm×2.1 mm，5 μm），預柱：菲羅門;流動相：甲醇：2mmol·L^-1醋酸銨（65：35）;流速：0.3 ml·min^-1;柱溫：室溫;進樣體積：20 μl。

3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子化源（ESI）;掃描方式：正離子多反應離子監(jiān)測;鞘氣，碰撞氣，輔助氣均為氮氣;解離電壓：58 V;聚焦電壓：380 V;入口電壓：26 V;碰撞池入口電壓：8 V;電噴霧電壓：5000 V;輔助氣溫度：360 ℃;霧化氣：8;門簾氣：10;碰撞氣：7;多反應離子監(jiān)測：柚皮苷：581.3/273.3，碰撞能8 V，掃描時間200 ms;柚皮素：273.4/153.1，碰撞能6 V，掃描時間200 ms;橙皮苷（內(nèi)標）：611.1/303.3，碰撞能：12 V，掃描時間：200 ms。采用DAS 2.0藥代動力學軟件，用統(tǒng)計距計算藥物代謝動力學參數(shù)。

4 方法和結(jié)果

4.1 儲備液的配制

柚皮苷標準儲備液：稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮苷對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1標準儲備液。

柚皮素標準儲備液：稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮素對照品約10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1的標準儲備液。

內(nèi)標標準儲備液：稱取橙皮苷對照品10 mg，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為200 μg·ml^-1的溶液作標準儲備液。

4.2 生物樣品的制備

4.2.1 血漿樣品的制備

大鼠眼眶取血，置1.5 ml肝素處理的塑料離心管中，6000 rpm離心10 min;分取血漿，置冰箱中-20℃保存;供測定用。

4.3 生物樣品的處理方法

4.3.1 血漿或組織樣品處理方法

取動物血樣100 μl，置1.5 ml離心管中，加入5 μg·ml^-1內(nèi)標橙皮苷對照品溶液10 μl，渦旋混合儀上渦旋30s，加入700 μl乙酸乙酯進行萃取，渦旋2 min，離心機上9000 r/m離心10 min，取上清液，室溫下?lián)]干溶劑。殘渣用流動相（甲醇：2mmol醋酸銨=65：35）100 μl重溶，進樣20 μl。

4.3.2 酶解的處理方法

取血樣100 μl，置1.5 ml離心管中，加入10 μl酶（β-葡萄糖苷酸酶），37 ℃水浴1小時，取出，加入內(nèi)標溶液10 μl，其余操作同4.3.1。

4.4 方法學考察

4.4.1 方法專屬性

按生物樣品預處理方法進行考察，考察6只不同動物個體空白樣本，比較空白血漿、加入內(nèi)標和對照品的血漿以及給藥后的某一時間點血樣的色譜圖，確定方法的專屬性。結(jié)果見圖1，結(jié)果表明：空白血漿不干擾待測物及內(nèi)標的測定。

4.4.2? 靈敏度考察

將濃度為100 ng·ml^-1柚皮苷標準溶液、柚皮素標準溶液進行稀釋，按4.3.1分別制成血漿樣品進行液質(zhì)檢測，當峰高為噪音的3倍（S/N=3），得到柚皮苷檢測限為0.5 ng·ml^-1。柚皮素檢測限為0.5 ng·ml^-1。

4.4.3? 標準曲線與線性范圍

按4.3.1項下操作，制成血漿中柚皮苷和柚皮素濃度分別為：10 ng·ml^-1、50 ng·ml^-1、100 ng·ml^-1、500 ng·ml^-1、1000 ng·ml^-1、2500 ng·ml^-1的血漿樣品。用液質(zhì)聯(lián)用儀正離子MRM方式進行檢測，每個樣品進樣20μl。以柚皮苷與內(nèi)標的峰面積比和血漿樣品中柚皮苷濃度進行線性回歸，即得標準曲線方程和線性范圍，標準曲線方程為：Y=0.0016X+0.00672（r=0.9992），以柚皮素與內(nèi)標的峰面積比和血漿樣品中柚皮素濃度進行線性回歸，即得標準曲線方程和線性范圍，標準曲線方程為：Y=0.0015X+0.0083（r=0.9948），柚皮苷在10 ng·ml^-1～2500 ng·ml^-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，柚皮素在10 ng·ml^-1～2500 ng·ml^-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.4.4? 精密度、準確度試驗

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，用液質(zhì)檢測（n=5），求得測定濃度值與平均值，計算RSD%，為日內(nèi)精密度，每天進樣一次，共三天，計算RSD%，為日間精密度。柚皮苷日內(nèi)精密度RSD為4.76%、8.84%、5.99%，柚皮苷日間精密度RSD為2.88%、0.70%、4.37%;柚皮素日內(nèi)精密度RSD為3.48%、6.80%、2.12%，柚皮素日間精密度RSD為5.23%、3.72%、3.51%。結(jié)果表明，柚皮苷、柚皮素日內(nèi)和日間精密度良好。

4.4.5提取回收率

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，每個濃度5個樣本。量取20 μl，注入LC/MS/MS，記錄質(zhì)譜圖。

另取1.5 ml塑料離心管，分別加入相應的柚皮苷和柚皮素標準溶液用流動相稀釋，制成相應濃度的標準溶液樣品，記錄質(zhì)譜圖。按公式計算，分別求出柚皮苷和柚皮素提取回收率和RSD值。結(jié)果顯示柚皮苷高、中、低3個濃度提取回收率分別為40.2%、43.1%、41.6%，RSD為3.55%、4.62%、6.14%。柚皮素高、中、低3個濃度提取回收率分別為61.6%、64.2%、74.0%，RSD為3.01%、2.20%、7.96%。

4.4.6方法回收率試驗

按4.3.1項下操作，制備柚皮苷（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）和柚皮素（2000 ng·ml^-1，800 ng·ml^-1，20 ng·ml^-1）高、中、低三個濃度生物樣品，每個濃度5個樣本。用液質(zhì)進行檢測，測得信號值代入回歸方程，求得測定值。以測得濃度與加入量比較，計算高、中、低3個濃度的方法回收率，結(jié)果見表1、表2：

4.4.7? 穩(wěn)定性試驗

按4.3.1項下操作，制備濃度分別為20ng·ml^-1、800ng·ml^-1、2000ng·ml^-1的血漿樣品，考察室溫放置4 h，-20℃凍融2次（每次間隔24 h），-20℃放置10 d，20 d，30 d后，樣品處理后的穩(wěn)定性（n=3），柚皮苷生物樣品室溫穩(wěn)定性RSD為7.43%、5.52%、3.38%。柚皮素生物樣品室溫穩(wěn)定性RSD為0.85%、1.15%、1.37。柚皮苷生物樣品凍融穩(wěn)定性RSD為13.45%、8.54%、0.80%。柚皮素生物樣品凍融穩(wěn)定性RSD為1.05%、2.85%、4.55%。柚皮苷在-20℃放置10 d，20 d，30 d的穩(wěn)定性RSD為9.76%、5.68%、9.45%。柚皮素在-20℃放置10 d，20 d，30 d的穩(wěn)定性RSD為9.63%、6.62%、6.77%。結(jié)果表明：含藥生物樣品于室溫放置4 h、于-20℃下反復凍融2次后、于-20℃放置30天穩(wěn)定性良好。

4.4.7 血漿樣品測定

本試驗根據(jù)藥效試驗所用劑量，在安全、有效的劑量范圍內(nèi)，設計了大鼠靜脈注射給藥柚皮苷 45 mg·kg^-1，于給藥后預定時間點取血，按4.3.1項下操作，制備血漿樣品并進行測定，測定結(jié)果用DAS 2.0軟件的統(tǒng)計距進行計算。結(jié)果見表3，表4，圖2。

結(jié)果表明，大鼠靜脈注射柚皮苷原料后，在大鼠體內(nèi)迅速檢測到柚皮苷，其達峰時間T_max為5 min，達峰濃度C_max為56583.33 ng·ml^-1，達峰后血藥濃度迅速下降?？蓹z測到少量的游離和葡萄糖醛酸結(jié)合物形式存在的柚皮苷代謝產(chǎn)物柚皮素，其柚皮素結(jié)合物的達峰時間T_max為12 h，達峰濃度C_max為653.68ng·ml^-1。可見柚皮苷在大鼠體內(nèi)可部分轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物柚皮素，且主要是以葡萄糖醛酸結(jié)合物形式存在。

5 討論

本研究在方法學考察中分別考察了甲醇和水、甲醇和0.1%甲酸、甲醇和醋酸銨的混合溶液等幾種流動相，結(jié)果表明流動相為甲醇：醋酸銨（2 mmol·L^-1）=65：35時，柚皮苷、柚皮素在液質(zhì)上可達到基線分離，且在此條件下離子對較為穩(wěn)定，信號強度較高，峰形較好。

研究表明乙酸乙酯對黃酮類化合物的提取較理想，柚皮苷和柚皮素屬于二氫黃酮苷，本研究根據(jù)二者的理化性質(zhì)，選擇乙酸乙酯作提取溶劑，并對文獻報道的方法進行了改進，將多次提取改為單次大體積提取，此法簡單易行，提取率穩(wěn)定，能滿足體內(nèi)低濃度藥物的測定和藥代動力學研究。

本研究曾使用了甲醇蛋白沉淀法，發(fā)生信號抑制，無離子對信號，基質(zhì)干擾嚴重。還嘗試了乙酸乙酯提取前加入飽和NaCO₃，飽和NH₄Ac，0.1 mol·ml^-1HCl進行鹽析處理，使用乙酸乙酯：正丁醇（1：1），乙酸乙酯：正丁醇（1：2），乙酸乙酯：正丁醇（95：5），乙酸乙酯：異丙醇（95：5）混合溶劑進行提取，均未得到改善提取率的效果，與其它樣品前處理方法（如：蛋白沉淀法等）相比，該液-液提取法給LC/MS/MS分析帶來的基質(zhì)效應（matrix effects）干擾相對較少。

從藥時曲線可以看出，靜脈注射柚皮苷原料后在大鼠體內(nèi)并非大部分轉(zhuǎn)化為柚皮素，大部分仍然以柚皮苷的形式存在。靜脈注射柚皮苷原料后，柚皮苷的血藥濃度5 min達峰，消除很快，而代謝產(chǎn)物柚皮素主要是以葡糖醛酸結(jié)合物形式存在，幾乎測不到游離的柚皮素，柚皮素葡萄糖醛酸結(jié)合物的血藥濃度12 h達峰。

參考文獻

[1]? Nzuza S，Ndwandwe DE，Owira PMO.Naringin protects against HIV-1 protease inhibitors-induced pancreatic β-cell? dysfunction and apoptosis[J].Molecular & Cellular Endocrinology，2016，437：1-10.

[2]? Ren X，Shi Y，Zhao D，et al.Naringin protects ultraviolet B-induced skin damage by regulation p38 MAPK signal pathway[J].Journal of Dermatological Science，2016，82（2）106-14.

[3]? Yi ZB，Yu Y，Lian YZ，et al.In vitro antioxidant and antimicrobial activities of the extract of pericarpium citri reticulatae of a new citrus cultivar and its main flavonoids[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（4）：597-603.

[4]? Yoshinaga A，Kajiya N，Oishi K，et al.NEU3 inhibitory effect of narigin suppresses cancer cell growth by attenuation of EGFR signaling through GM3 ganglioside accumulation[J].Eur J Pharmacol，2016，5（782）：21-29.

[5]? Zeng L，Zhen Y，Chen Y，et al. Narigin inhibits growth and induces apoptosis by a mechanism dependent on reduced activation of NF-kB/COX 2-caspase-1 pathway in HeLa cervical cancer cells[J].International Journal of Oncology，2014，45（5）：1929-36.

[6]? 曾令軍，陳丹，鄭利，等.玳玳黃酮提取物特征活性成分不同生理狀態(tài)的藥動學特性比較[J].中國中藥雜志，2014，39（2）：309-315.

第一作者簡介：郭俐麟，碩士研究生，從事藥物分析研究。