雷帕霉素在神經(jīng)修復(fù)方面作用機(jī)制的研究進(jìn)展

殷悅涵 孫麗穎 田文

雷帕霉素是由放線菌產(chǎn)生的31元大環(huán)產(chǎn)物[1]，最初是在抗真菌藥物的篩選中于復(fù)活島采集的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)[2]。研究表明，雷帕霉素具有免疫抑制[3]、抗腫瘤[4]、神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)再生和延長壽命的作用[5-6]。雷帕霉素通過與其細(xì)胞內(nèi)受體FK506結(jié)合蛋白12(FKBP12)結(jié)合，抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin，mTOR)。結(jié)合形成的FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物直接與mTOR上的FKBP12-雷帕霉素-結(jié)合域(FKBP12-rapamycin-binding，F(xiàn)RB)相互作用；該FRB結(jié)構(gòu)域?qū)儆诹姿峒〈技っ赶嚓P(guān)激酶家族[7]。一旦FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物結(jié)合至FRB結(jié)構(gòu)域，將會(huì)抑制mTOR的活性，而mTOR與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種蛋白質(zhì)結(jié)合，在細(xì)胞生命中起著重要作用。自首次分離雷帕霉素以來，許多研究人員都對(duì)雷帕霉素的生物合成途徑進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)劑(4R,5R)-4,5-二羥基環(huán)己酮-1-烯羧酸(DHCHC)啟動(dòng)了雷帕霉素的生物合成，雷帕霉素聚酮合酶(PKS)利用擴(kuò)展基(2S)-丙二酰輔酶a或(2S)-甲基丙二酰輔酶a進(jìn)行縮合反應(yīng)，形成一個(gè)新生的聚酮鏈。當(dāng)聚酮鏈的延伸終止后，一個(gè)來源于賴氨酸的哌啶酸基，在RapL編碼的賴氨酸環(huán)化脫氨酶的作用下，合成至該聚酮鏈上。之后，在RapP肽合成酶催化的環(huán)化作用下，形成前雷帕霉素[8-9]。最終，PKS后修飾酶催化合成雷帕霉素?，F(xiàn)對(duì)雷帕霉素的發(fā)現(xiàn)及其多種生物學(xué)作用、人類mTORC1受體結(jié)合至FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物的最新研究進(jìn)展、雷帕霉素的生物合成及調(diào)控、雷帕霉素類似物的生成及生物學(xué)效應(yīng)、雷帕霉素的藥代動(dòng)力學(xué)以及其在神經(jīng)修復(fù)中的作用和該藥物的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1.雷帕霉素及其類似物的發(fā)現(xiàn)及生物活性:雷帕霉素是在阿耶斯特實(shí)驗(yàn)室，從在復(fù)活節(jié)島采集的植物和土壤標(biāo)本中分離得出，為鏈霉菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物[2]。該化合物對(duì)包括白色念珠菌在內(nèi)的人類致病性酵母菌表現(xiàn)出強(qiáng)大的活性。雷帕霉素作為抗真菌藥物發(fā)現(xiàn)于1975年[2]，并于同年獲得美國專利(US392999A)[10]。此后研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素及其類似物對(duì)幾種真菌的生長具有抑制作用，包括新型隱球菌、假絲酵母菌和青霉菌屬[11]。另有研究表明，雷帕霉素在體外抑制了機(jī)會(huì)獲得性真菌病原體--毛霉菌的生長，該菌導(dǎo)致的感染病死率高達(dá)65%～90%[12]。還有研究表明，雷帕霉素的抗真菌活性受到依賴于FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物的酵母Tor激酶的負(fù)性調(diào)節(jié)[13]。

盡管雷帕霉素最初被認(rèn)為是一種抗真菌藥物，阿耶斯特實(shí)驗(yàn)室的研究人員發(fā)現(xiàn)它有強(qiáng)大的免疫抑制活性[3]。在最初的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，雷帕霉素抑制了大鼠的免疫反應(yīng)，阻止了實(shí)驗(yàn)預(yù)期的免疫性疾病(變應(yīng)性腦脊髓炎和非特異性關(guān)節(jié)炎)的發(fā)生和類IgE抗體的形成[3]。在器官移植動(dòng)物模型中，它還抑制了細(xì)胞免疫反應(yīng)和同種異體移植排斥反應(yīng)[14]。上述發(fā)現(xiàn)使雷帕霉素應(yīng)用于器官移植的免疫治療。此外，雷帕霉素作為免疫抑制劑，相比于環(huán)孢素A，它效用更高(高達(dá)100倍)且毒性更小[15]。雷帕霉素不僅抑制急性器官排斥反應(yīng)，還抑制了慢性器官排斥反應(yīng)，而他克莫司和環(huán)孢素A則不具備后述功能[16]。雷帕霉素對(duì)心臟移植患者的治療也同樣有效，并顯著減少了死亡、發(fā)生心肌梗死和因心臟問題住院的患者數(shù)[17]。雷帕霉素也可與其他免疫制劑聯(lián)用，它與環(huán)孢素聯(lián)用能顯著降低腎毒性和急性腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率[16]。雷帕霉素作為一種免疫制劑分別在美國和歐洲被批準(zhǔn)使用。

除了抗真菌和免疫抑制活性以外，研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素及其類似物還有抗惡性腫瘤的功能[18]。早期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了雷帕霉素有抗腦腫瘤及結(jié)腸腫瘤的效果，而在后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，雷帕霉素與其他藥物聯(lián)用發(fā)揮了強(qiáng)有效的抗癌作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，雷帕霉素與順鉑聯(lián)用抑制了多種癌細(xì)胞的生長，包括Ishikawa細(xì)胞、ECC-1細(xì)胞[19]、宮頸癌Hela細(xì)胞[20]。雷帕霉素與紫杉醇聯(lián)用抑制了Ishikawa細(xì)胞和ECC-1細(xì)胞增殖，相比單用紫杉醇，二者聯(lián)用增加了促進(jìn)其細(xì)胞凋亡的作用，而單獨(dú)應(yīng)用雷帕霉素并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。此外，第二代半合成雷帕霉素衍生物：替西羅莫司、伊維莫司、地磷莫司，相比于雷帕霉素，有更強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，并已被FDA批準(zhǔn)或用于臨床試驗(yàn)。

還有研究表明雷帕霉素具有其他的生物活性，包括神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)再生和延長壽命。雷帕霉素在神經(jīng)退行性疾病的治療模型中，均被報(bào)道可減弱泛素化蛋白聚集、減緩神經(jīng)元丟失[22]，為預(yù)防帕金森病等與錯(cuò)誤折疊/聚集蛋白相關(guān)的疾病提供了一種思路[5]。此外，半合成的雷帕霉素類似物也顯示出促進(jìn)神經(jīng)元存活和刺激神經(jīng)突生長的作用，并提出雷帕霉素的神經(jīng)保護(hù)活性可能與FKBP52介導(dǎo)有關(guān)[23]。

2.雷帕霉素的作用機(jī)制：雷帕霉素通過與FKBP12結(jié)合，抑制mTOR的功能，從而實(shí)現(xiàn)其免疫抑制作用[24]。最初的分子遺傳研究學(xué)認(rèn)為，F(xiàn)KBP12-雷帕霉素復(fù)合物為細(xì)胞內(nèi)分子，作用于某一靶位以抑制細(xì)胞生長。隨后的研究則觀察到，無論是TOR1突變、或是TOR2突變，F(xiàn)KBP12-雷帕霉素復(fù)合物均不能結(jié)合至TOR，說明TOR本身即是雷帕霉素的靶點(diǎn)[25]。

研究人員發(fā)現(xiàn)了與S.釀酒酵母TOR同源的哺乳動(dòng)物TOR(mTOR)[26]，并且具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。mTOR內(nèi)含HEAT結(jié)構(gòu)域(亨廷頓蛋白、延伸因子3、PR65/A、TOR)，HEAT結(jié)構(gòu)域于其氮端重復(fù)，之后是FAT結(jié)構(gòu)域(FRAP、ATM、TRRAP)、FRB結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、FATC端(FAT-碳-羧基端)、碳端[27]。mTOR存在于兩個(gè)結(jié)構(gòu)和功能不同的復(fù)合物中，mTOR復(fù)合物1 (mTORC1)和mTOR復(fù)合物2 (mTORC2)。mTORC1對(duì)雷帕霉素敏感，由哺乳動(dòng)物同族蛋白mLST8[28]、PRAS40[29]、Deptor[30]、Raptor[31]，以及mTOR組成。與之相反，mTORC2由生長因子介導(dǎo)的PI3K激活，包括mTOR、mLST8、Deptor、mSIN、Rictor、Protor[32]。最初的研究認(rèn)為mTORC2對(duì)雷帕霉素不敏感，因其暴露于雷帕霉素時(shí)，不會(huì)立刻受到調(diào)節(jié)作用[33]。然而，后續(xù)研究證實(shí)，雷帕霉素的慢性治療可以破壞一些癌細(xì)胞和正常肝臟、肌肉、脂肪組織中的mTORC2[34]。

mTOR與Raptor、mLST8、Deptor、PRAS40均為mTORC1的催化亞基。Raptor為多區(qū)域蛋白，由Raptor氮端保守域、中間部分的HEAT重復(fù)區(qū)域、WD40重復(fù)域組成[31]。Raptor是一種結(jié)構(gòu)蛋白，它控制著mTORC1復(fù)合物的組裝并確保其對(duì)底物的專一性。Deptor和PRAS40是mTORC1的負(fù)調(diào)控因子[30]，mLST8可以激活mTOR的激酶活性、并穩(wěn)定其活性位點(diǎn)[35]。低溫電子顯微鏡首次揭露了mTORC1的組織結(jié)構(gòu)。mTORC1是一種專性二聚體，呈空心菱形。隨著高分辨率低溫電子顯微鏡的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)，mTOR的氮端HEAT結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)α螺旋[36]。HEAT結(jié)構(gòu)域互相包裹，第一個(gè)HEAT結(jié)構(gòu)域鎖定于相鄰的FAT結(jié)構(gòu)域，形成二聚體。低溫電鏡結(jié)構(gòu)表明，Raptor限制了活性位點(diǎn)，而FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步減少了該活性位點(diǎn)的縫隙，說明mTOR的調(diào)節(jié)機(jī)制是控制底物通路發(fā)揮作用[35]。此外，還有研究結(jié)果表明Raptor直接參與了mTORC1底物的選擇和傳遞。

雖然有著類似的免疫抑制活性，雷帕霉素和他克莫司、環(huán)孢素A的作用機(jī)制并不相同。他克莫司和環(huán)孢素通過阻斷鈣調(diào)神經(jīng)素，阻斷T細(xì)胞中白介素-2基因轉(zhuǎn)錄激活的信號(hào)通路，從而阻斷T細(xì)胞受體的信號(hào)通路，抑制了IL-2的產(chǎn)生及T細(xì)胞的增殖[18]。而雷帕霉素通過與FKBP12結(jié)合，中斷了T細(xì)胞活化的第二階段[37]。FKBP12 -雷帕霉素復(fù)合物與mTOR相互作用，產(chǎn)生的FKBP12-雷帕霉素-mTOR復(fù)合物干擾了IL-2受體與其他細(xì)胞因子、生長因子受體的通路。因此，它抑制T細(xì)胞細(xì)胞周期中G1期到S期的進(jìn)展，從而抑制T-細(xì)胞增殖[38]。

3.生物合成及調(diào)控：啟動(dòng)單元DHCHC結(jié)合至雷帕霉素PKS雷帕霉素域，啟動(dòng)了雷帕霉素的生物合成。研究證實(shí)DHCHC是由分支酸在RapK的作用下水解形成。最近的一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)用純化的RapK及其類似物FkbO證實(shí)，分支酸形成DHCHC的第一步是雷帕霉素基因簇在RapK的作用下活化[39]。一旦啟動(dòng)單元DHCHC結(jié)合至RapA，其中的烯酰還原酶會(huì)將其分解[40]；之后，在PKS酶RapA、RapB、RapC等亞基的催化作用下，DHCHC復(fù)合物與2S-丙二酰輔酶A或2S-甲基丙二酰輔酶A結(jié)合，形成具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的聚酮化合物[8]。隨后，賴氨酸在RapL的作用下合成的甲基哌啶，插入至該聚酮鏈中，在RapP的作用下進(jìn)行環(huán)化[41]。

通過基因和生物轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)，明確了在雷帕霉素生物合成的PKS后修飾中所發(fā)揮作用的其他基因[9]。PKS后剪切酶在前雷帕霉素形成雷帕霉素的過程中，催化了其氧化和甲基化。研究推測(cè)，甲基轉(zhuǎn)移酶RapM、RapQ、RapI分別催化C16、C27、C39位點(diǎn)上羥基的甲基化；RapJ、RapN分別催化雷帕霉素中間體C9、C27位點(diǎn)的特異性氧化，最終在鐵氧還原蛋白R(shí)apO的催化作用下形成雷帕霉素[8-9]。

對(duì)雷帕霉素基因簇的分析發(fā)現(xiàn)了雷帕霉素PKS酶以外的5種調(diào)節(jié)蛋白。據(jù)報(bào)道，RapG和RapH具有DNA結(jié)合位點(diǎn)，與轉(zhuǎn)錄激活因子有相似的序列[42]。而在野生菌株中引入額外的RapG或RapH序列，雷帕霉素的產(chǎn)量顯著增加?；蚯贸驮傺a(bǔ)充實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RapG在雷帕霉素的生物合成中起著關(guān)鍵作用，RapH起著支持作用[42]。而RapR和RapS共同作用于蛋白翻譯，被認(rèn)為是負(fù)調(diào)控基因。最近，RapR、RapS和RapY在雷帕霉素生產(chǎn)中的負(fù)調(diào)控作用通過對(duì)其進(jìn)行過表達(dá)、敲除和敲除后再添加實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)[43]。野生型和突變株的轉(zhuǎn)錄分析表明，RapS和RapY對(duì)雷帕霉素大部分生物合成基因的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。此外，RapS被發(fā)現(xiàn)能夠抑制RapY的表達(dá)，進(jìn)而抑制RapX編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，說明RapS和RapY在雷帕霉素的生物合成中起著關(guān)鍵作用[43]。

4.雷帕霉素的藥代動(dòng)力學(xué)：雷帕霉素的絕對(duì)生物利用度尚不明確。有小樣本研究顯示，血液透析患者通過靜脈注射藥物，與口服類似劑量的穩(wěn)定腎移植患者的吸收濃度相比，口服藥物的生物利用度約為15%[44]。在人體全血中，雷帕霉素主要分布于紅細(xì)胞(94.5%)、血漿(3.1%)、淋巴細(xì)胞(1.01%)和粒細(xì)胞(1.0%)，其分布與溫度和濃度無關(guān)[45]。36例接受單次口服雷帕霉素的穩(wěn)定腎移植患者的平均血液-血漿濃度比為34.5:1，具有顯著的個(gè)體間變異性(CV 52.3%，范圍為10-70)[46]。雷帕霉素在脂蛋白中的分布尚不明確，但已知雷帕霉素的代謝作用增加了高、低、極低密度脂蛋白的含量。在60%的游離成分中，只有一小部分(約4%)與可溶性血漿蛋白結(jié)合[45]。因此，全血細(xì)胞監(jiān)測(cè)可作為雷帕霉素的治療性用藥監(jiān)測(cè)。由于其疏水性，雷帕霉素廣泛分布于人體組織的脂膜和紅細(xì)胞中，具有較大的表觀分布體積(5.6～16.7L/kg)[45]。經(jīng)靜脈或口服給藥14 d后，脾、腎、肝、腸和心臟中均有較高分配系數(shù)。

雷帕霉素在P-糖蛋白和CYP3A4細(xì)胞色素P450家族中A亞家族的第4位的作用下代謝消除。一項(xiàng)16例的腎移植患者的臨床研究表明，在接受單次雷帕霉素和環(huán)孢素、強(qiáng)的松治療時(shí)，表觀清除率有8倍的差異(0.042～0.339 L·h-1·kg-1)，終末半衰期為43.8～86.5 h。另一項(xiàng)40例穩(wěn)定腎移植患者的臨床研究中，受試者接受了療程為14 d的雷帕霉素、環(huán)孢素和強(qiáng)的松 的聯(lián)合使用，表觀清除率有4.5倍的差異[平均為(0.210(0.090～0.416)L·h-1·kg-1]，終末半衰期為(62±12)h[46]。根據(jù)放射性物質(zhì)研究方法推測(cè)，雷帕霉素代謝產(chǎn)物的主要清除途徑為膽道(91%)，而在尿液中則有2.2%。肝功能異常導(dǎo)致雷帕霉素及其代謝物濃度升高。

影響P-糖蛋白和CYP3A4的濃度或活性的藥物，會(huì)影響雷帕霉素的藥代動(dòng)力學(xué)。地爾硫卓和酮康唑分別使雷帕霉素的AUC升高了60%和90% ，而利福霉素使其AUC降低了82%[47]。該方面的藥物相互作用仍有待進(jìn)一步研究。

5.雷帕霉素在神經(jīng)修復(fù)中的作用:雷帕霉素的神經(jīng)保護(hù)/神經(jīng)再生作用早已有研究證明，但其具體機(jī)制尚不明確。在脊髓缺血模型中，應(yīng)用雷帕霉素治療減少了病變部位的反應(yīng)性膠質(zhì)增生[48]。Akira等[49]的研究表明，在小鼠脊髓損傷急性期，雷帕霉素對(duì)mTOR的抑制作用顯著降低了神經(jīng)組織的損傷和運(yùn)動(dòng)障礙，減少并發(fā)癥的發(fā)生，該研究為脊髓損傷的治療提供新的策略。

近年來，越來越多的動(dòng)物研究證實(shí)雷帕霉素及mTOR在中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是脊髓損傷的相關(guān)研究中發(fā)揮著重要作用。Soraya等[50]的研究表明，雷帕霉素通過抑制mTOR，減少了神經(jīng)的退行性變，并使IL-1β、IL-6、TNF-α的生成減少；低劑量的雷帕霉素也能使IL-10增加，阻止喹啉酸誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的減少，從而預(yù)防喹啉酸引起的運(yùn)動(dòng)障礙。曹富江等[51]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-99b-5p信號(hào)通路，可以減弱小鼠脊髓損傷引起的脊髓神經(jīng)元的有害改變，而miRNA-99b-5p的靶點(diǎn)可能為mTOR，這一研究也為雷帕霉素在該領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。

mTOR是細(xì)胞增殖、分化、成熟的重要調(diào)節(jié)因子，雷帕霉素通過與FKBP12結(jié)合，抑制mTOR的功能，從而抑制該通路下游的一系列生理功能，從而發(fā)揮藥理作用。目前對(duì)mTOR通路的研究較為成熟，雷帕霉素的作用靶點(diǎn)也已明確。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多的疾病和mTOR通路的重要聯(lián)系浮出水面；而隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的mTOR通路異常所致的疾病能夠被精確檢測(cè)。目前，雷帕霉素作為腎移植的免疫抑制劑，是一種成熟、安全的治療措施，但這只是雷帕霉素應(yīng)用的冰山一角，其更廣泛的應(yīng)用仍需更多的研究進(jìn)行挖掘。