張東偉 藍(lán)冰 鐘家將

柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科545000

通信作者：藍(lán)冰,Email:277191282@qq.com

肺癌是一種對(duì)人生命健康威脅最大的肺癌,其病死率和發(fā)病率逐年升高[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),全球肺癌發(fā)病率高于其他肺癌,男性肺癌病死率和發(fā)病率高居肺癌第一位,女性高居第二位[2]。截至目前,肺癌的發(fā)病原因仍未十分明晰,但大量研究表明,肺癌的發(fā)生與吸煙密切相關(guān),研究人員提出,長期大量吸煙人群肺癌患病率是不吸煙人群的20倍[3]。目前臨床上缺乏有效的肺癌診斷和篩查生物學(xué)標(biāo)志物,所以大量患者一旦確診即為肺癌晚期。研究人員曾利用痰細(xì)胞學(xué)以及影像學(xué)來診斷肺癌,但是患者5年生存率依舊低于14%[4]。microRNA 是一種單鏈RNA 分子,其主要由人體內(nèi)源基因編碼,長度約為20～24個(gè)核苷酸。microRNA 在人體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,可以對(duì)靶m RNA 進(jìn)行特異性識(shí)別,同時(shí)調(diào)控編碼基因的表達(dá);可以抑制基因轉(zhuǎn)錄和促進(jìn)mRNA 降解,從而影響mRNA 水平。近年來研究發(fā)現(xiàn),microRNA 能夠調(diào)節(jié)人體細(xì)胞分化、代謝、增殖、耐藥和死亡等生物學(xué)過程,microRNA 的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、診斷及預(yù)后有密切的關(guān)系[5]。可以通過比較人體癌變組織和正常組織microRNA 表達(dá)情況,對(duì)癌癥的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)、診斷,通過調(diào)節(jié)部分具有致癌或者抑癌的特異性microRNA 可以達(dá)到治療的目的,這與患者預(yù)后也有重要關(guān)系,為肺癌的診斷、治療和預(yù)后提供了新的思路。

1 肺癌與microRNA作用機(jī)制

1.1 肺癌患者microRNA 的產(chǎn)生和作用原理 人體可編碼m RNA 的DNA 主要存在于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子和非編碼區(qū)2個(gè)位置。位于非編碼區(qū)的DNA 被人體內(nèi)的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為長度1～3 kb的前體,另外位置的DNA 轉(zhuǎn)錄生成的前體是通過剪切形成的。形成的前體經(jīng)過2種特定的核糖核酸酶處理,形成100 nt左右的前體。此時(shí)的前體在輸出蛋白5 的作用下侵入到人體胞漿,在特定的RNA酶作用下形成成熟的雙聯(lián)microRNA。micro RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的主要部分是AGO 蛋白,AGO 蛋白可以和人體mRNA 非編碼區(qū)發(fā)生作用,從而達(dá)到抑制蛋白質(zhì)合成的作用。這種抑制作用主要通過2 種途徑實(shí)現(xiàn)：一種是促進(jìn)m RNA 的降解和脫腺苷化,另一種是在翻譯的開始階段發(fā)揮抑制作用[6]。正常情況下,雙鏈micro RNA 中只有引導(dǎo)鏈能夠進(jìn)入microRNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體,另一條鏈則被降解。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7],雙鏈microRNA 中的過客鏈在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中比較保守,在某些情況下還具有調(diào)節(jié)活性。通常情況下,microRNA 發(fā)揮作用的主要位置是胞漿,同時(shí)細(xì)胞核中檢測(cè)出成熟microRNA,但是其作用機(jī)制仍不明晰。

能與microRNA 結(jié)合的靶基因序列為處于5'端的核酸“種子”序列,一般這樣的種子序列有6～8 個(gè),與這種“種子”序列互補(bǔ)的區(qū)域存在于mRNA 任意位置,大多數(shù)情況下位于3'區(qū)[8]。大量研究表明,micro RNA 可以與mRNA 其他區(qū)域進(jìn)行結(jié)合。同時(shí),microRNA 與mRNA 結(jié)合后,micro RNA 則會(huì)發(fā)揮其抑制作用或者迫使m RNA 降解,達(dá)到調(diào)控的目的[9]。之所以microRNA 能夠調(diào)控多種基因,是因?yàn)閙icroRNA 能夠同時(shí)與多種mRNA 結(jié)合。反之,一種基因也可以同時(shí)受到眾多microRNA 的調(diào)控。

最近研究發(fā)現(xiàn),microRNA 還有眾多非常規(guī)作用機(jī)制[10]。部分研究人員提出,microRNA 可以通過調(diào)節(jié)核糖體生物合成或者直接跳過細(xì)胞停滯周期來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),通過使m RNA 結(jié)合具有抑制酶翻譯的抑制性蛋白或者蛋白復(fù)合體,microRNA 可以通過不同形式調(diào)節(jié)m RNA 水平[11-12]。1.2 microRNA 進(jìn)入肺癌患者內(nèi)循環(huán)機(jī)制 研究發(fā)現(xiàn),人類血清和血漿中均發(fā)現(xiàn) microRNA 存在,同時(shí)這些microRNA 即便在室溫條件下長時(shí)間存放仍可以保持其穩(wěn)定性。近年來研究證實(shí),前列腺癌患者血清中microRNA-141較正常人穩(wěn)定表達(dá),其區(qū)分正常人和前列腺癌患者的特異度為100%,敏感度為62%[13]。同時(shí)研究證實(shí),microRNA 可以在人體血液樣本中穩(wěn)定存在,學(xué)者們利用特定技術(shù)發(fā)現(xiàn)糖尿病、大腸癌、肺癌患者血清中存在特異性microRNA,這充分證明患者血清中存在腫瘤特異性microRNA 標(biāo)志物[14]。

因?yàn)檠h(huán)中microRNA 具有顯著的特點(diǎn)：可以反復(fù)凍融、承受極端p H、耐受外源性RNA 等,人工合成的microRNA 注入人體內(nèi)則會(huì)被迅速溶解,所以microRNA不會(huì)來源于死亡的腫瘤細(xì)胞作為裸露的RNA 釋放。研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)體系中的microRNA 通常是被裝進(jìn)凋亡小體、微泡、外泌體等載體中,也有部分存在于高密度脂蛋白復(fù)合體或者蛋白質(zhì)中。截至目前,多數(shù)研究人員認(rèn)為人體血漿中microRNA 具有較強(qiáng)穩(wěn)定性,由于在循環(huán)體系中,microRNA 主要是以膜包被的囊泡釋放的[15]。部分研究人員使用過濾層析法定量分析了人血漿的microRNA,發(fā)現(xiàn)核糖核蛋白復(fù)合體中存在絕大部分人體循環(huán)中的microRNA,僅有一小部分的micro RNA 和囊泡發(fā)生關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),一部分特定的micro RNA (約為16%)僅存在于囊泡中;一部分僅存在于核糖核蛋白復(fù)合體,該部分在人體血清和血漿中分別占70%、69%;其余則在核糖核蛋白復(fù)合體和囊泡中均有存在[16]。

2 肺癌臨床診斷及預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物

2.1 肺癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物 部分研究人員利用特定技術(shù)對(duì)人體血清microRNA 表達(dá)譜進(jìn)行探討研究,分別采集11名健康男性、10 名健康女性及11 例非小細(xì)胞肺癌 (nonsmall cell lung cancer,NSCLC)患者血清,通過對(duì)比發(fā)現(xiàn),在NSCLC患者血清中檢測(cè)到130種microRNA,但是其中62種在健康人群血清中并未發(fā)現(xiàn),同時(shí)26種僅在健康人群血清中發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),NSCLC 患者血清中75 種microRNA 在血細(xì)胞中并未發(fā)現(xiàn),表明該部分microRNA 可能來源于腫瘤微環(huán)境或者腫瘤細(xì)胞[17]。另一項(xiàng)研究在80例肺癌患者和80名健康體檢人群中進(jìn)行,使用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 確定 micro RNA-223 和microRNA-225特異性的存在于肺癌患者體內(nèi)[18]。盡管這兩種micro RNA 水平較正常人群高,但仍需對(duì)其診斷價(jià)值進(jìn)行進(jìn)一步分析研究。

隨后,研究人員重點(diǎn)關(guān)注體液中具有診斷價(jià)值的microRNA。有研究報(bào)道了腫瘤組織以及與其配對(duì)的血漿來源的外泌體中10 種 microRNA 水平,發(fā)現(xiàn)二者中microRNA 水平呈現(xiàn)高度的相關(guān)性[19],提示腫瘤本身狀況可以通過腫瘤來源外泌體的microRNA 表達(dá)譜來反映,這為腫瘤來源外泌體的microRNA 表達(dá)譜在腫瘤發(fā)展、治療及預(yù)后方面的價(jià)值提供了有力證據(jù)。有研究表明,血漿microRNA-21可以作為NSCLC 的診斷標(biāo)志物,同時(shí)發(fā)現(xiàn)NSCLC患者分期與microRNA-21表達(dá)水平關(guān)系密切,T3、T4期患者較T1、T2 期患者血漿microRNA-21 表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)在使用以鉑類藥物為主進(jìn)行化療的患者中,進(jìn)展期和穩(wěn)定期患者血漿micro RNA-21表達(dá)水平顯著高于緩解期患者[20]。

同時(shí)還可以通過定時(shí)定量PCR 陣列、微陣列、測(cè)序等方法測(cè)定患者microRNA 表達(dá)譜,然后通過獨(dú)立的隊(duì)列確定目標(biāo)microRNA。研究人員通過研究發(fā)現(xiàn),NSCLC 患者血清中90種micro RNA 特異性表達(dá),同時(shí)又對(duì)300例健康人群和400例肺癌患者組成的研究對(duì)象進(jìn)行研究,提出一種聯(lián)合11種micro RNA 的診斷方法,并繪制其受試者工作特征曲線,其特異度為90.1%,敏感度為92.6%,曲線下面積為0.975[21]。部分研究提出,microRNA-1254 可以用來診斷早期NSCLC,研究人員使用芯片技術(shù)對(duì)10例健康人群和10例肺癌患者血清microRNA 進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示5種microRNA 表達(dá)水平差異倍數(shù)高達(dá)1.69倍[22]。另有研究 提 出, microRNA-574-5p 和 micro RNA-1254 診 斷NSCLC特異度為72%,敏感度為75%,聯(lián)合診斷NSCLC疾病具有較高價(jià)值[23]。

microRNA 表達(dá)譜隨著時(shí)間推移會(huì)不會(huì)發(fā)生變化也應(yīng)引起高度重視。研究人員采集了肺癌確診前3～30年患者血液樣本、7份健康人群血液樣本和10份確診肺癌后患者血液樣本,對(duì)樣本中的905種microRNA 表達(dá)情況進(jìn)行測(cè)定和分析,發(fā)現(xiàn),microRNA 譜總體是穩(wěn)定的,但是在肺癌確診前后會(huì)發(fā)生明顯變化[24]。但是本次研究難以將腫瘤發(fā)生發(fā)展與microRNA 表達(dá)水平變化之間的關(guān)系研究明晰。部分研究提出,使用聯(lián)合35種microRNA 的診斷方法可以在沒有肺癌癥狀的人群中檢測(cè)出早期肺癌,準(zhǔn)確率高達(dá)85%[25]。以上研究均表明micro RNA 可能在肺癌患者的癥狀表現(xiàn)出來之前已經(jīng)進(jìn)入患者血液。

2.2 microRNA 對(duì)肺癌治療作用 近幾年,人們將microRNA 合成為拮抗劑或者模擬物用來治療肺癌成為一種新的治療癌癥方法。microRNA 作為治療手段,其主要優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的多個(gè)階段。理論上來說,只需要幾個(gè)micro RNA 即可使大量的腫瘤細(xì)胞沉默。病毒傳遞的最大特點(diǎn)是傳遞速度快、傳遞效率高。研究發(fā)現(xiàn)將腺病毒作為載體,將microRNA-122 傳導(dǎo)至NSCLC患者細(xì)胞內(nèi),可以明顯提高microRNA-122表達(dá)水平,甚至表達(dá)水平提高2 000倍以上,同時(shí)使內(nèi)源性凋亡通路被激活[26]。

研究人員使用包含二甲基芐聯(lián)氮的固體脂質(zhì)納米顆粒來濃縮microRNA,從而來提高細(xì)胞對(duì)microRNA 的攝取率。研究表明,人體肺組織可以在2 h內(nèi)吸收通過靜脈注射的含有microRNA-34的包含二甲基芐聯(lián)氮的固體脂質(zhì)納米顆粒[27]。與脂質(zhì)體顆粒相比,包含二甲基芐聯(lián)氮的固體脂質(zhì)納米顆粒可以有效被人體肺毛細(xì)血管截留,還可以避免被肝臟清除,提高被肺部吸收的效率。同時(shí)外泌體microRNA 可以有效調(diào)控腫瘤,所以目前將外泌體作為一種傳遞治療分子的方法成為新的治療手段。目前,該種方法已被部分研究人員應(yīng)用在臨床上,并且取得一定的成果。通過外泌體向目標(biāo)細(xì)胞中傳導(dǎo)microRNA,能有效提高或者恢復(fù)目標(biāo)細(xì)胞中microRNA 水平,即通過腫瘤抑制因子來發(fā)揮抑制作用。

目前,micro RNA 作為治療腫瘤疾病的主要困難是安全性、脫靶效應(yīng)和傳遞的組織特異性,最有效的途徑是系統(tǒng)性地傳遞microRNA 抑制劑或者模擬物。但是目前最大的難題是肺癌患者microRNA 的提取。同時(shí)在整個(gè)過程中要避免穿透血管內(nèi)皮、核酸酶的降解、人體腎臟的清除作用、人體的免疫反應(yīng)和靶細(xì)胞的內(nèi)吞等。因?yàn)閙icroRNA可以同時(shí)影響數(shù)百種基因,所以microRNA 在部分細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮有益作用,但是在另外一些細(xì)胞則可以發(fā)揮有害作用,這也是研究人員需要進(jìn)一步研究的課題[28]。

2.3 肺癌患者預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物 研究已經(jīng)證明microRNA 與人體許多信號(hào)通路關(guān)系密切,這些通路可以調(diào)控腫瘤侵襲等相關(guān)過程,比如干細(xì)胞特性、DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、死亡等[29-30]。這啟示人們可以將microRNA 表達(dá)譜作為疾病預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。在實(shí)際操作中,已有大量研究表明microRNA 在肺癌患者預(yù)后中有重要作用。研究人員針對(duì)150例肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn),眾多microRNA 中有6種可以較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后狀況[31]。針對(duì)NSCLC 患者研究發(fā)現(xiàn),microRNA-182表達(dá)水平與2 期患者以及鱗癌患者預(yù)后有密切關(guān)系。microRNA-200 家 族 中 有 2 種 micro RNA, 分 別 為microRNA-141和microRNA-200c表達(dá)情況與NSCLC患者預(yù)后關(guān)系密切,二者高水平表達(dá)則患者總生存期更短,同時(shí)二者表達(dá)差異在鱗癌患者中無明顯差異,主要是在腺癌患者中差異表達(dá)[32]。

患者進(jìn)行手術(shù)治療后腫瘤組織樣本無法獲得或者腫瘤組織樣本在肺癌確診后才能確立,所以在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的多樣性和疾病進(jìn)展過程中分子變化方面作用弱化。研究人員采集了30例短期生存和30例長期生存的NSCLC患者血清樣本,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有5種microRNA 在2組患者體內(nèi)表達(dá)有明顯差異。研究人員把這幾種microRNA 組合在一起,疾病嚴(yán)重患者血鉀竟高達(dá)9.36 mmol/L。同時(shí),研究人員還發(fā)現(xiàn),患者體內(nèi)microRNA-21高水平表達(dá)與患者不良預(yù)后、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)[33]。

3 結(jié)語

從與腫瘤密切相關(guān)的microRNA 被發(fā)現(xiàn)以來,尋找可以作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的microRNA 成為近年來的一個(gè)熱門話題,也掀起了一股針對(duì)micro RNA 的研究熱潮。大量的研究人員和研究機(jī)構(gòu)投入大量的精力來研究該項(xiàng)課題,這將為該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在臨床奠定了良好的基礎(chǔ)。近年來,microRNA 在肺癌疾病方面的診斷、治療、預(yù)后價(jià)值不斷被發(fā)現(xiàn),甚至大量研究直接表明microRNA 可以用來診斷篩查肺癌,對(duì)肺癌病理分型、治療、藥物敏感性測(cè)試等方面有重要作用,但是距離廣泛推廣應(yīng)用還有差距,我們還有大量的工作要做。大量的研究均是小樣本研究,定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)法內(nèi)參基因的選擇仍未達(dá)成一致意見,研究人員報(bào)到的研究結(jié)果尚未統(tǒng)一,這也為下一步研究人員研究提出了新問題。同時(shí)大部分研究結(jié)果缺乏長期跟蹤研究。找到一種可以有效預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)治療療效的無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物顯得尤為迫切,但是研究結(jié)果差距較大。目前較為清晰的是microRNA 與鉑類化療的敏感性高度相關(guān),但是其作為獨(dú)立的生物學(xué)標(biāo)志物價(jià)值不足。同時(shí),能夠分泌microRNA 的細(xì)胞種類、分泌機(jī)制及micro RNA 的作用仍未完全明晰,如果這些問題全部得到有效的徹底地解決,microRNA 在肺癌乃至各種肺癌診斷、治療和預(yù)后方面生物學(xué)標(biāo)志物的作用將得到充分發(fā)揮,這將為人們攻克肺癌提供有力幫助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突