四川牡丹花粉生活力測定方法的比較

摘 ?要：本研究以四川牡丹花粉為材料，利用離體萌發(fā)法、亞歷山大染色法、TTC染色法及I₂-KI染色法，測定四川牡丹花粉的活力。結(jié)果表明：開花后第1天花粉即具有活力，第4天花粉活力最高，隨著開花時間的推移，花粉活力逐漸下降。開花后1～7 d，用4種測定方法測得的花粉活力變化趨勢基本一致。亞歷山大染色法與離體萌發(fā)法的結(jié)果差異極其顯著（P<0.01）。TTC染色法和I₂-KI染色法，與離體萌發(fā)法的結(jié)果差異不顯著。其中I₂-KI測定結(jié)果最接近離體萌發(fā)法。綜合考慮實驗條件、實驗周期、實驗過程和藥品保存方法等因素，I₂-KI染色法適合四川牡丹野外人工傳粉之前快速準(zhǔn)確地測定花粉活力。這為探討四川牡丹瀕危的原因、保護種質(zhì)資源、開展引種馴化和雜交育種提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：四川牡丹;花粉;生活力;測定方法中圖分類號：S685.11??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Comparative Study on Determination Methods of Pollen Viability in Paeonia decomposita

WANG Shiquan

Ministry of Education Key Laboratory for Ecology of Tropical Islands / College of Life Sciences， Hainan Normal University， Haikou， Hainan 571158， China

Abstract： In this paper， the pollen viability ofPaeonia decompositawas studied using?in vitrogermination， Alexander staining， TTC staining and I₂-KI staining methods. The results showed that the pollen had viability on the first day after flowering， and the highest viability was on the fourth day. As the flowering time lapsed， the pollen viability gradually decreased. The change tendency of pollen viability in 1–7 d after flowering determinated by four methods were basically the same. The results of Alexander staining and?in vitrogermination were extremely significantly different （P<0.01）， while the differences between TTC staining， I₂-KI staining and?in vitro germination were not significant. The determination results of I₂-KI were closer to that of thein vitro germination?method. Taking into account factors such as experimental conditions， experimental periods， experimental processes and drug preservation methods， I₂-KI staining method was suitable for the rapid and accurate determination of the pollen viability before artificial pollination of?P. decompositain the field. This would provide a theoretical basis for exploring the endangered causes， protecting germplasm resources， introducing domestication and cross breeding ofP. decomposita.

Keywords： Paeonia decomposita; pollen; viability; determination methods

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.008

四川牡丹（Paeonia decompositaHand.-Mazz.）是芍藥科芍藥屬落葉灌木，被列為瀕危植物^[1-2]。野外僅分布于四川省西北部，分布范圍狹窄，數(shù)量較少，自然更新能力相對較差，是野生牡丹中受威脅度高的種類^[3]。國內(nèi)學(xué)者從分類修訂^[4-6]、核型^[7]、遺傳進化^[8-9]、生態(tài)位^[10]、種子特性^[11-12]、種間關(guān)系^[13-17]等方面進行了深入研究。四川牡丹具有較高的觀賞價值，根皮可入藥（俗稱丹皮），是寶貴的花卉種質(zhì)資源和藥用植物資源，也是新品種選育的重要遺傳材料。

花粉是植物有性繁殖重要的遺傳物質(zhì)載體，其活力直接影響到種子結(jié)實，在雜交育種中扮演著重要角色，也是研究細(xì)胞極性生長、分化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要體系^[18-19]。目前缺乏對四川牡丹雜交育種方面的研究，缺乏對花粉活力的系統(tǒng)研究。而花粉活力的高低對雜交育種影響很大，因此，有必要對其花粉生活力進行檢測。本研究以四川牡丹花粉為實驗材料，以離體萌發(fā)測定法的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較亞歷山大染色法、TTC染色法和I₂-KI染色法的測定結(jié)果，確定四川牡丹花粉活力快速有效的測定方法，為探討四川牡丹瀕危的原因、保護種質(zhì)資源、開展引種馴化和雜交育種提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

四川牡丹一般3月中旬開始長出嫩葉，4月中旬開始開花，9—10月落葉，不同年份略有差異。2017年5月，在四川馬爾康選擇生長健壯、無病蟲害的植株，按個體采集了開花后1～7?d的花粉。采集時用鑷子將花藥取下，放入紙袋中，置于4?℃冰箱中貯存，用于后續(xù)實驗。

1.2方法

1.2.1??離體萌發(fā)法測定花粉活力 ?參考律春燕等^[20]的方法，將花粉散落到雙凹面載玻片上，滴1～2滴預(yù)先篩選好的培養(yǎng)液（150 g/L蔗糖+30 mg/L硼酸+20 mg/L?CaCl₂，pH 5.8～6.5），攪拌均勻后，置于25?℃恒溫箱中，培養(yǎng)后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。每個個體的不同開花天數(shù)，鏡檢花粉粒數(shù)都超過500個，并計算花粉萌發(fā)率。

1.2.2??亞歷山大法測定花粉活力??參考Alexan der^[21]的方法，將花粉置于載玻片上，用亞歷山大染色液進行染色，可育花粉壁呈綠色，原生質(zhì)呈紅色，敗育花粉呈綠色。壓片后置于顯微鏡下分別統(tǒng)計各個視野中可育、敗育的花粉數(shù)。每個個體的不同開花天數(shù)，鏡檢花粉粒數(shù)都超過400個。

1.2.3 ?TTC染色法測定花粉活力 ?參考張志良^[22]的方法，用鑷子取少量花粉置于干凈載玻片上，加入1～2滴0.5%的TTC溶液，攪拌均勻，使花粉散開，蓋上蓋玻片，放于裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于37?℃恒溫水浴鍋中溫浴后鏡檢，被染成紅色的花粉表示生活力強，淡紅色次之，沒有活力的花粉或不育花粉無法著色。分別統(tǒng)計有活力和無活力的花粉粒數(shù)。每個個體的不同開花天數(shù)，鏡檢花粉粒數(shù)都超過400個。

1.2.4 ?I₂-KI染色法測定花粉活力 ?參考李合生^[23]的方法，用鑷子取少量花粉置于干凈載玻片上，滴1～2滴2%的I₂-KI溶液，攪拌均勻，使花粉散開，蓋上蓋玻片，室溫下靜置后在顯微鏡下觀察并分別統(tǒng)計有活力和無活力的花粉數(shù)。凡被染成藍(lán)色的為含有淀粉的花粉，即活力較強的花粉;呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉，無色為無活力的花粉。每個個體的不同開花天數(shù)，鏡檢花粉粒數(shù)都超過500個。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個個體不同開花天數(shù)，同種染色方法均統(tǒng)計花粉粒400個以上。采用Excel?2007和SPSS 19.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2??結(jié)果與分析

2.1離體萌發(fā)法測定花粉萌發(fā)率

在雜交育種研究中，常涉及花粉活力的測定，而萌發(fā)法能直接反應(yīng)父本的可育性。正?；ǚ鄢墒鞎r有較強的活力，在適宜的培養(yǎng)條件下萌發(fā)出花粉管。依花粉管的長度≥花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，對其萌發(fā)情況進行統(tǒng)計，計算萌發(fā)率。培養(yǎng)2 h后，花粉的萌發(fā)溝處開始出現(xiàn)花粉管，8 h后花粉管開始生長變長（圖1A）。

開花后1～7 d，離體培養(yǎng)萌發(fā)法測得的9個個體的萌發(fā)率為69.61%～94.15%，平均萌發(fā)率為72.00%～89.40%，所有個體的花粉活力都比較高。開花后第4天萌發(fā)率最高，達(dá)89.40%（表1）。隨著開花時間的推移，花粉活力逐漸下降。

2.2亞歷山大染色法測定花粉活力

亞歷山大染色液可進行植物花粉活力鑒定，常用于細(xì)胞核染色，主要由孔雀綠、酸性品紅、苯酚等組成，是較好的花粉粒染色劑?？捎ǚ鄣幕ǚ郾诒蝗境删G色，原生質(zhì)被染成紅色;而敗育花粉不呈紅色，被染成綠色（圖1B）。通過統(tǒng)計花粉著色情況，計算其花粉活力。

開花后1～7 d，亞歷山大染色法測得的9個個體的活力為57.44%～97.68%，平均活力為76.50%～86.58%，所有個體的花粉活力都較高。開花后第4天活力最強，高達(dá)86.58%（表2）。隨著開花時間的推移，花粉活力逐漸下降。

2.3TTC染色法測定花粉活力

TTC是一種氧化還原染料，水溶液無色。當(dāng)TTC滲入細(xì)胞后，遇到活細(xì)胞中的脫氫酶接受氫離子，由無色的氧化型變成紅色的還原型不溶于水的化合物，以此來判斷花粉的生活力。利用0.5%的TTC染液對花粉進行染色后，具有活力的花粉都被染成紅色，而沒有活力的花粉，無法著為紅色（圖1C）。

開花后1～7 d，TTC染色法測得的9個個體的活力在63.86%～90.64%之間， 平均活力為70.46%～88.50%，所有個體的花粉活力都較高。開花后第4天活力最強，高達(dá)88.50%（表3）。隨著開花時間的推移，花粉活力逐漸下降。

2.4I₂-KI染色法測定花粉活力

利用I₂-KI溶液對花粉粒進行染色，有活力的花粉積累淀粉較多，被染成藍(lán)色，無活力的花粉不含淀粉或積累的淀粉極少，呈黃褐色（圖1D）。開花后1～7 d，I₂-KI染色法測得的9個個體的活力為61.46%～91.33%， 平均活力為74.54%～?87.00%，所有個體的花粉活力都較高。開花后第4天活力最強，高達(dá)87.00%（表4）。隨著開花時間的推移，花粉活力逐漸下降。

2.5不同測定方法花粉活力的比較

開花后1～7?d，4種方法測定的花粉活力變化趨勢基本一致（圖2）。以離體萌發(fā)法為標(biāo)準(zhǔn)進行比較，發(fā)現(xiàn)亞歷山大染色法的結(jié)果普遍高于離體萌發(fā)法（第4天除外），TTC染色法的結(jié)果低于離體萌發(fā)法，I₂-KI染色法的結(jié)果略高于離體萌發(fā)法（第4天除外）。

亞歷山大染色法與離體萌發(fā)法的結(jié)果差異極其顯著（P<0.01）。TTC染色法和I₂-KI染色法，與離體萌發(fā)法的結(jié)果差異不顯著（P>0.01）（表5）。

說明：同列不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

Note： Different uppercase?letters in the same column indicate significant differences（P<0.01）.

3??討論

花粉活力的高低直接影響授粉實驗的結(jié)果，因此在進行人工授粉前測定花粉活力是不可或缺的一步。有很多方法可以用于檢測植物花粉的活力，不同方法有各自的適用范圍，不同植物需要根據(jù)實際情況選擇合適的花粉活力測定方法^[24-29]。生物染色劑因為操作簡單、耗時短、無需特別的外界輔助條件，能在短時間內(nèi)測定花粉活力，因此挑選適合測定某種植物花粉活性的染料在雜交育種上具有非常重大的意義。

本研究表明，利用液體培養(yǎng)基，通過離體萌發(fā)法測定四川牡丹的花粉活力，需要為花粉萌發(fā)提供適宜的環(huán)境條件，如溫度、pH、營養(yǎng)物質(zhì)和礦質(zhì)元素等，培養(yǎng)時間較長，步驟繁瑣，實驗過程復(fù)雜，不適合大量樣本快速測定，不適合快速準(zhǔn)確地測定花粉活力。TTC染色法需要將花粉和染色液在恒溫條件下混合并保溫一段時間，操作要求較高、TTC染液需要避光保存，1～7 d內(nèi)TTC染色法獲得的花粉活力都低于用離體培養(yǎng)法獲得的萌發(fā)率，所以TTC染色法不適合快速準(zhǔn)確地測定花粉活力。亞歷山大染色法的染色效果好，染色時間短，容易辨別，但是除第四天外，其他時間的結(jié)果均高于離體萌發(fā)法的結(jié)果。而I₂-KI染色法只需將花粉和染色液混合后置于室溫條件下放置一段時間即可檢測出花粉活力，是一種靈敏度高、經(jīng)濟、快速的花粉活力檢測方法，尤其適合野外條件下花粉活力的檢測，測定結(jié)果也最接近離體萌發(fā)法?？赡苁且驗槟档せǚ壑械牡矸酆枯^高，I₂-KI較易滲透進花粉壁而使花粉粒染色。因此，綜合考慮實驗條件、實驗周期、實驗過程、實驗結(jié)果和藥品保存方法等因素，I₂-KI染色法適合快速準(zhǔn)確地測定四川牡丹的花粉活力。這為探討四川牡丹瀕危的原因、保護種質(zhì)資源、開展引種馴化和雜交育種提供了理論依據(jù)。

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