廣東雷州雜草稻sh4和qSH1基因的功能SNP位點(diǎn)序列分析

夏啟玉 曹揚(yáng) 孔華 李美英 張麗麗 賀萍萍 張雨良 郭安平

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口??571101

摘 ?要：sh4和qSH1基因是水稻的主效落?；颍狙芯恐荚跍y定雷州雜草稻的sh4和qSH1的基因型，為雷州雜草稻的落粒機(jī)制研究提供分子基礎(chǔ)。本研究從雷州10個(gè)雜草稻群體采集了100個(gè)單株及10份栽培稻種子，觀測其穎殼顏色、果皮顏色和芒及落粒率，并對(duì)sh4和qSH1的功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析。結(jié)果表明，57份雜草稻的sh4功能SNP位點(diǎn)為野生落粒型（G），15份為雜合型G/T，28份為突變難落粒型（T）。其中，G型和G/T型的72份雜草稻的落粒率都極高（95%～100%），而28份T型雜草稻中，19份為中度落粒（30%～75%），5份雜草稻的落粒率很高（>95%），4份雜草稻的落粒率小于30%。100份雜草稻和10份栽培稻的qSH1功能SNP位點(diǎn)均為G。結(jié)合落粒表型及基因型，推測sh4是調(diào)控雷州雜草稻落粒性的一個(gè)主要基因。

關(guān)鍵詞：雜草稻;落粒性;sh4;qSH1;序列分析中圖分類號(hào)：S511?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Sequence Analysis of SNP Loci Associated with Seed Shattering at sh4?and qSH1Genes of Weedy Rice in Leizhou， Guangdong Province

XIA Qiyu， CAO Yang， KONG Hua， LI Meiying， ZHANG Lili， HE Pingping， ZHANG Yuliang^*，GUO Anping^*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural?Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： sh4 andqSH1are the main seed shattering genes in rice. The purpose of this study is to determine the genotypes ofsh4 andqSH1of weedy rice in Leizhou and provides molecular basis for the study of seed shattering?mechanism of weedy rice in Leizhou. In this study， 100 individual plants and 10 cultivated rice seeds?were collected from 10 weedy rice population in Leizhou， and their hull color， pericarp color， awn and seed shattering?rate were observed. The SNP loci ofsh4andqSH1were amplified by PCR and sequenced. The results showed that the SNP locus atsh4in 57 weedy rice were wild seed shattering?genotype （G）， 15 weedy rice were heterozygous G/T and 28 weedy rice were mutant hard seed shattering?genotype （T）. Among them， 72 weedy rice of G genotype and G/T genotype had high seed shattering?rate （95%–100%）， 19 of 28 weedy rice of T genotype were moderate seed shattering?rate （30%–75%）， 5 weedy rice had high seed-?shattering?rate （>95%） and 4 weedy rice had low seed shattering?rate （<30%）. The SNP locus atqSH1 in 100 weedy rice and 10 cultivated rice were G. Combining with the seed shattering?phenotype and genotype， it is inferred thatsh4is one of the main genes regulating the seed shattering?of weedy rice in Leizhou.

Keywords： weedy rice; seed shattering;sh4;qSH1; sequence analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.01.015

雜草稻（Oryza sativaf.spontanea）是廣泛分布在世界各地稻田中的一種不斷自生的惡性雜草，最早于1846年在美國發(fā)現(xiàn)。雜草稻早熟、易落粒、多數(shù)具有紅色果皮，在田間與栽培稻相伴而生，與栽培稻競爭光、水分和營養(yǎng)，外形上與栽培稻極難區(qū)分，難以防治。我國有25個(gè)省均有不同程度的雜草稻發(fā)生。近年來，隨著直播稻等水稻簡化栽培技術(shù)的推廣，我國江蘇、湖南、廣東、遼寧等省的雜草稻發(fā)生越來越重，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量。雷州市是廣東西部地區(qū)的重要水稻生產(chǎn)基地，但自20世紀(jì)90年代初起，雜草稻逐漸成為雷州市直播稻區(qū)的主要草害，嚴(yán)重危害雷州地區(qū)水稻的生產(chǎn)^[1]。

雜草稻種子的落粒性是其能在稻田中不斷自我繁衍從而導(dǎo)致水稻減產(chǎn)的主要原因。谷粒從小穗軸上的脫落是由離層控制的，離層區(qū)是木本雙子葉植物及裸子植物落葉前，葉柄或葉基部所形成離區(qū)的部分細(xì)胞層?；ü?、果枝上也常有離層發(fā)生，造成落花、落果。研究表明，水稻的落粒性是由少數(shù)主效基因和多個(gè)微效基因共同控制的數(shù)量性狀。近年來報(bào)道的落粒相關(guān)基因有很多，如sh4^[2]、qSH1^[3]、sh5^[4]、SHAT1^[5]、CPL1^[6]、SNB^[7]、sh1^[8]等。目前認(rèn)為，sh4和qSH1是控制水稻落粒性狀的主效基因。2006年，Li等^[2]在水稻第4染色體發(fā)現(xiàn)了1個(gè)貢獻(xiàn)率為69%的主效QTL位點(diǎn)，命名為sh4，該基因編碼與Myb3同源的轉(zhuǎn)錄因子，其第1個(gè)外顯子中的第237個(gè)核苷酸的替換（G→T）導(dǎo)致了1個(gè)氨基酸的替換（賴氨酸→天冬酰氨），使表型從易落粒變成了難落粒。該基因的功效十分明顯：具有野生稻等位基因（G）的水稻，谷粒成熟后自然脫落，或者輕打就能脫落，而栽培稻等位基因（T）的水稻，則需要外力才能使谷粒脫落。同年，Konishi等^[3]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)對(duì)Nipponbare × Kasalath的雜交F₂代的落粒性貢獻(xiàn)率為68.6%的主效基因qSH1，其編碼BEL1型同源基因，qSH1基因上游12 kb的調(diào)控區(qū)有一個(gè)核苷酸的替換（G→T），引起該基因功能的改變，導(dǎo)致落粒性的降低。

雷州主要水稻產(chǎn)區(qū)多為直播和機(jī)械收割，且雷州雜草稻的落粒性極高，種子擴(kuò)散速度快、范圍廣，難以防治。本研究以雷州市10個(gè)雜草稻危害嚴(yán)重區(qū)域?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)雜草稻的sh4和qSH1基因的功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及測序分析，確定了雷州市這10個(gè)雜草稻群體的sh4和qSH1的落?；蛐?，為研究雷州市雜草稻的落粒機(jī)制及起源方式提供分子依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1??材料采集??2018年11月從廣東湛江雷州市雜草稻發(fā)生嚴(yán)重的10塊稻田中采集雜草稻種子，采集時(shí)主要通過落粒性、穎殼顏色及果皮顏色或三者結(jié)合來判斷是否為雜草稻。每個(gè)稻田采集10個(gè)單株，每株取單穗，共100份雜草稻種子，同時(shí)采集了對(duì)應(yīng)稻田的栽培稻（秈稻）1個(gè)單穗，共10份栽培稻種子。雜草稻及對(duì)應(yīng)栽培稻的采樣地點(diǎn)信息見表1。

1.1.2??試劑??PrimeSTAR^? Max DNA Polymerase購自TaKaRa公司，植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，引物合成及測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1??雜草稻種子性狀觀測??觀測100份雜草稻單穗的主要性狀，包括穎殼顏色、果皮顏色、芒和落粒率。落粒率的測定方法為：將穗于2 m高處自由落下，統(tǒng)計(jì)脫落粒數(shù)和未脫落粒數(shù)，空殼不計(jì)數(shù)，落粒率=（即落粒數(shù)/總粒數(shù)）×100%。

1.2.2??DNA提取??由于雜草稻有一定的異交率，種子的基因型可能與母本的基因型不一致，因此，本研究中，每份雜草稻及對(duì)應(yīng)的栽培稻都取穎殼用于DNA提取。將6～10粒種子剝下穎殼，用液氮研磨后，采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，獲得的DNA于?20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3??PCR擴(kuò)增及序列分析??根據(jù)RGAP水稻基因組注釋計(jì)劃數(shù)據(jù)庫（Rice Genome Annotation Project， RGAP）中日本晴的sh4（LOC_Os04g 57530）序列，選取功能SNP位點(diǎn)的兩側(cè)400～600?bp范圍內(nèi)的序列設(shè)計(jì)引物，篩選得到1對(duì)特異性高的引物;qSH1上游調(diào)控區(qū)落粒SNP位點(diǎn)的引物參照Nunes等^[9]報(bào)道的引物。引物的名稱、序列及預(yù)期片段大小見表2。

PCR擴(kuò)增使用PrimeSTAR^?Max DNA Polymerase，25?μL的反應(yīng)體系包括：滅菌雙蒸水9.5?μL，PrimeSTAR Max Premix 12.5 μL，引物（10?μmol/L）各1 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件為：95?℃預(yù)變性5 min;98?℃?10 s，55?℃?15 s，72?℃?30 s，共35 cycle;72?℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測后，送公司測序。將測序結(jié)果與日本晴的sh4和qSH1上游調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)分析，使用的DNA序列比對(duì)軟件為DNAMAN。

2??結(jié)果與分析

2.1種子主要性狀觀測

對(duì)雷州的這10個(gè)群體的100份雜草稻種子的主要性狀進(jìn)行了觀測，發(fā)現(xiàn)這些雜草稻種子的穎殼顏色有黑褐色、黃色和黃色帶褐斑，果皮顏色有紅色、淺紅色和白色，有些有芒，有些無芒，落粒率也有高有低（圖1）。雖然雷州的雜草稻和栽培稻相比均具有較高的落粒性，但落粒率有較大差異。本研究根據(jù)落粒率的大小將雷州雜草稻的落粒性分為3個(gè)等級(jí)：低（落粒率<30%）、中（30%≤落粒率≤75%）、高（落粒率>75%）。其中，落粒性高的有77份，落粒性中等的有19份，落粒性低的有4份。雷州的雜草稻中有黑殼紅皮、黑殼白皮、黃殼紅皮、黃殼白皮等各種不同的表型，落粒性差異也較大，可能因?yàn)殡s草稻有一定的異交率，伴生于栽培稻，與栽培稻有廣泛的基因交流，使得雷州的雜草稻表型豐富多樣。對(duì)應(yīng)的10份栽培稻種子的穎殼顏色均為黃色，果皮顏色均為白色，落粒性中等的有2份，落粒性低的有8份。雜草稻種子的種子落粒性狀見表3。

A：高落粒性的雜草稻;B：中落粒性的雜草稻;C：低落粒性的雜草稻;D：栽培稻。

A： Weedy rice with high seed shattering; B： Weedy rice with moderate seed shattering; C： Weedy rice with low seed shattering;D： Cultivated rice.

2.2sh4功能SNP位點(diǎn)的序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后送公司測序，得到500 bp左右的核苷酸堿基片段序列。將100份雜草稻和10份栽培稻的sh4序列與日本晴的sh4序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，57份雜草稻在功能SNP位點(diǎn)處為G（野生落粒型），28份雜草稻為T（突變難落粒型），還有15份雜草稻為雜合型G/T;10份栽培稻的sh4的SNP位點(diǎn)均為T（圖2，表3）。對(duì)照這100份雜草稻的sh4基因型與其落粒率發(fā)現(xiàn)，基因型為G的57份雜草稻和基因型為G/T的15份雜草稻的落粒性都非常高（>95%）;而基因型為T的雜草稻的落粒性則有高有低，從16%～?100%，其中有5份雜草稻的落粒率很高（>95%），有19份雜草稻的落粒率介于30%～75%，有4份雜草稻的落粒率較低，小于30%。

2.3qSH1上游調(diào)控區(qū)功能SNP位點(diǎn)的序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后送公司測序，得到500 bp左右的核苷酸堿基片段序列。將100份雜草稻和10份栽培稻的qSH1上游調(diào)控序列與日本晴的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100份雜草稻和10份栽培稻的qSH1上游調(diào)控序列的SNP位點(diǎn)均為G（表3），與秈稻的基因型一致，為易落粒型，說明這100份雜草稻之間及其與對(duì)應(yīng)栽培稻的落粒性差異與qSH1上游調(diào)控序列的SNP位點(diǎn)無關(guān)，這些雜草稻的極高落粒性可能不是qSH1基因的作用。另外，有15份雜草稻和3份栽培稻在此SNP位點(diǎn)下游147 bp處還有一個(gè)突變（G），而日本晴中為A，這15份中又有13份雜草稻在此SNP位點(diǎn)下游151 bp處還有另一個(gè)突變（T），而日本晴中為G。

3??討論

3.1雷州雜草稻落粒性與qSH1基因型的關(guān)系

近幾年，有研究人員對(duì)我國雜草稻危害嚴(yán)重地區(qū)的雜草稻的qSH1基因功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行了測序分析，如王黎明等^[10]發(fā)現(xiàn)雷州地區(qū)的6份雜草稻的qSH1基因上游調(diào)控序列的功能SNP位點(diǎn)均為G，其中有2份雜草稻在該SNP位點(diǎn)下游147?bp處存在1個(gè)突變位點(diǎn)（G），而日本晴中為A。王軍等^[11]研究發(fā)現(xiàn)江蘇省和東北三省的33份雜草稻的qSH1基因的功能SNP位點(diǎn)也均為G，有3份雜草稻在該SNP位點(diǎn)下游147 bp處存在1個(gè)突變位點(diǎn)（G）。本研究中，雷州的100份雜草稻的qSH1功能SNP位點(diǎn)也均為G，與王黎明等在雷州雜草稻和王軍等在江蘇省和東北三省雜草稻中鑒定的結(jié)果一致。同時(shí)，雷州這100份雜草稻與對(duì)應(yīng)稻田的10份栽培稻的qSH1基因的功能SNP位點(diǎn)也一致，然而，雜草稻之間及雜草稻與栽培稻之間的落粒性差異很大，說明雷州雜草稻極高的落粒性不是qSH1基因起主要作用。此外，本研究中，15份雜草稻和3份栽培稻中也有王黎明等和王軍等發(fā)現(xiàn)的功能SNP位點(diǎn)下游147 bp處的另一個(gè)堿基突變，但是，其中有13份雜草稻還在功能SNP位點(diǎn)下游151 bp處存在一個(gè)堿基突變。18份在功能SNP位點(diǎn)下游有1或2個(gè)突變位點(diǎn)的雜草稻和栽培稻與其落粒性并無規(guī)律，無法判斷這2個(gè)突變位點(diǎn)是否與雜草稻的落粒性相關(guān)。

3.2雷州雜草稻落粒性與sh4基因型的關(guān)系

目前，國內(nèi)外都有對(duì)雜草稻sh4基因型的研究。如，Thurber等^[12]發(fā)現(xiàn)，美國雜草稻sh4基因的功能SNP位點(diǎn)處均為T，為難落粒基因型。Zhu等^[13]分析發(fā)現(xiàn)，亞洲雜草稻在sh4基因的功能SNP位點(diǎn)處均為T，說明sh4在亞洲水稻的馴化過程中所起的作用并不大。王軍等^[11]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇省和東北三省的33份雜草稻在sh4基因功能SNP位點(diǎn)處均為T，說明33份雜草稻的落粒性與sh4基因無關(guān)。以上研究中，采集的雜草稻的sh4基因的功能SNP位點(diǎn)均為T，為突變難落?；蛐停砻鬟@些雜草稻的落粒性與sh4基因無關(guān)。但本研究中，雷州的100份雜草稻中，sh4基因的功能SNP位點(diǎn)存在3種類型（G、T和G/T），其中大部分都是G或G/T型，只有小部分是T型。雜合型G/T的雜草稻可能為雜草稻之間或雜草稻與栽培稻之間的雜交后代。這與前人的研究結(jié)果不同，說明不同地區(qū)的雜草稻存在不同的落粒機(jī)制。對(duì)照這100份雜草稻的落粒表型和sh4的SNP基因型，發(fā)現(xiàn)57份G型和15份G/T型的雜草稻的落粒性都很高（>95%），推測sh4可能對(duì)這些雜草稻的落粒表型起到重要的作用，同時(shí)sh4（G）引起的落粒表型為顯性，這與Li等^[2]的研究結(jié)論一致。而28份T型雜草稻中，也有高、中等落粒和低落粒的差異，與同為T型的栽培稻的落粒性差異也很大，說明可能有其他基因?qū)β淞Ｐ砸灿兄匾呢暙I(xiàn)，或者，落粒性高的雜草稻的sh4基因可能有其他位點(diǎn)的突變，具體原因還需進(jìn)一步的研究。

3.3雷州雜草稻的起源分析

目前，有關(guān)雜草稻的起源還沒有定論，推測可能有以下幾個(gè)途徑^[14]：（1）野生稻入侵稻田并適應(yīng)稻田環(huán)境逐漸形成了雜草稻;（2）野生稻和栽培稻之間漸滲雜交逐漸形成雜草稻;（3）栽培稻品種之間雜交后代分離或回復(fù)突變產(chǎn)生落粒性等野生性狀，逐漸適應(yīng)并進(jìn)化形成雜草稻。簡化來說，雜草稻的起源可分為兩類，一類是野生稻起源，包括上述的第一種和第二種假說;另一類是栽培稻起源，包括上述的第三種假說。

我國多個(gè)省份都有野生稻的自然分布，因此，我國雜草稻的起源方式可能較為復(fù)雜。不同地區(qū)的雜草稻很可能是分散起源的，是多樣起源而非單一的。近些年，我國學(xué)者對(duì)雜草稻的起源進(jìn)行了一些研究。邵菁等^[15]利用SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，江蘇省雜草稻可能主要來自栽培稻的基因重組或回復(fù)突變即返祖遺傳。馬殿榮等^[16]利用SSR標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，吉林省雜草稻與當(dāng)?shù)鼐驮耘嗟居H緣關(guān)系較近，很可能起源于當(dāng)?shù)鼐驮耘嗟?。Qiu等^[17]通過對(duì)江蘇的3個(gè)雜草稻進(jìn)行全基因組重測序認(rèn)為，江蘇的雜草稻起源于秈梗雜交。Qiu等^[18]對(duì)155份雜草稻材料和76份當(dāng)?shù)貧v年栽培稻品進(jìn)行了全基因組重測序群體分析發(fā)現(xiàn)，我國雜草稻均起源于栽培稻。以上研究都相對(duì)支持我國一些地區(qū)的雜草稻起源于栽培稻的假說。而Sun等^[19]應(yīng)用生物大數(shù)據(jù)分析方法，發(fā)現(xiàn)亞洲高緯度地區(qū)的雜草稻起源于栽培稻的遺傳改良階段，即處于半馴化狀態(tài)。

雷州雜草稻的表型豐富多樣，是研究雜草稻起源的寶貴材料。本研究中，雷州10個(gè)群體的雜草稻的sh4基因的功能SNP位點(diǎn)有3種類型：野生落粒型（G）、突變不落粒型（T）和雜合型G/T。這是首次發(fā)現(xiàn)雜草稻的sh4基因型為野生型和雜合型。廣東有多個(gè)市縣均有野生稻分布，雷州也有5個(gè)野生稻分布點(diǎn)^[20]。因此，雷州雜草稻的G/T型sh4基因可能有幾個(gè)來源：（1）野生稻和栽培稻的異交，后代再分離又出現(xiàn)G型和T型雜草稻;（2）G型和T型雜草稻的異交;（3）G型雜草稻與栽培稻間的異交。野生型的sh4基因有可能來源于當(dāng)?shù)氐囊吧荆蛔冃偷?em>sh4基因可能來源于當(dāng)?shù)氐脑耘嗟?，同時(shí)也都可能來源于G/T型雜草稻后代的分離。因此，根據(jù)sh4基因型，推測雷州雜草稻可能有2種起源方式：野生型和雜合型sh4基因的雜草稻可能起源于野生稻，可能是野生稻入侵農(nóng)田，或野生稻與栽培稻的雜交后代，或者野生稻的基因漸滲;而突變型的sh4基因的雜草稻可能起源于栽培稻的去馴化或雜交后代的分離。雷州雜草稻的起源方式還有待進(jìn)一步進(jìn)行基因組水平的序列分析研究。

4??結(jié)論

本研究對(duì)雷州10個(gè)雜草稻群體100個(gè)單株的雜草稻種子和對(duì)應(yīng)的10份栽培稻種子的主要性狀（穎殼顏色、果皮顏色、芒及落粒率）進(jìn)行了觀測，并對(duì)水稻落粒主效基因sh4和qSH1的功能SNP位點(diǎn)進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明，雷州雜草稻種子的表型豐富多樣，大部分雜草稻的落粒率極高。sh4基因的功能SNP位點(diǎn)的序列分析發(fā)現(xiàn)，100份雜草稻中，有57份雜草稻的sh4功能SNP位點(diǎn)為野生落粒型（G），15份為雜合型G/T，28份為突變難落粒型（T）。其中，G和G/T型的雜草稻的落粒率都極高，接近100%，而T型雜草稻大都為中度及低度落粒，少數(shù)幾個(gè)也表現(xiàn)為極高的落粒率。qSH1基因的功能SNP位點(diǎn)的序列分析發(fā)現(xiàn)，全部100份雜草稻和10份栽培稻的功能SNP位點(diǎn)均為G。以上結(jié)果表明，sh4可能是調(diào)控雷州雜草稻落粒性的一個(gè)主要基因，本研究為雷州雜草稻的落粒機(jī)制和起源方式提供分子基礎(chǔ)。

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