太行菊組織培養(yǎng)技術(shù)初探

白鳳麟

摘? ? 要：針對太行菊，對其根、莖和葉采用組織培養(yǎng)技術(shù)使其快速生長繁殖，獲得預(yù)期產(chǎn)量。本試驗包括選取太行菊種子、種子消毒、無菌苗培育、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽增殖、生根壯苗和煉苗移栽等過程。經(jīng)試驗結(jié)果分析可得：無菌苗在 1/2 MS 培養(yǎng)基生長最好;組織（根、莖和葉）愈傷誘導(dǎo)的最適濃度為 MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4-D;叢生芽增殖的最適濃度為 MS+30 g 蔗糖 +8 g 瓊脂粉+0.2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：太行菊;組織培養(yǎng);愈傷組織誘導(dǎo);叢生芽增殖

文章編號： 1005-2690（2020）24-0001-03? ? ? ?中圖分類號： S567.239? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗材料為長治市老頂山太行菊。

1.2? ?試驗儀器及藥品

1.2.1? ?試驗儀器

高壓滅菌鍋（TOMY 全自動高壓滅菌鍋），超凈工作臺（DL–CJ–1N型），烘箱，培養(yǎng)皿，錐形瓶，組培瓶，pH 試紙等。

1.2.2? ?試驗藥品

MS 培養(yǎng)基，蔗糖，瓊脂，NAA（萘乙酸），6–BA（6–芐基氨基嘌呤），2，4–D（2，4–二氯苯氧乙酸），1/2 MS 培養(yǎng)基等。

2? ?試驗方法

2.1? ?太行菊種子選取

挑選太行菊長勢均一的種子，首先用自來水浸泡 4? h，在超凈工作臺用 75%的酒精消毒 30 s，再用 0.1%升汞消毒 8 min，最后用無菌水清洗 3～4次。

2.2? ?無菌苗生長

將上述消毒的無菌種子在超凈工作臺中接種在 1/2 MS 培養(yǎng)基上，放在組培實驗室中培養(yǎng)。

試驗共有 10 個組培瓶，每個組培瓶放10顆種子[1]（溫度 25 ℃，光照 14 h）。每天觀察并記錄數(shù)據(jù)，30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.3? ?誘導(dǎo)愈傷組織

選取長勢較好且均一的無菌苗，取其根和莖在 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行組織愈傷誘導(dǎo)。其中根、莖和葉切成1 cm 左右。每個濃度有 30 小段的根、莖和葉。每天觀察并記錄相關(guān)現(xiàn)象，30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)[2]。

2.4? ?叢生芽增殖培養(yǎng)

選取愈傷組織誘導(dǎo)出的叢生芽，并去掉枯葉和基部的愈傷組織，接種于 MS 培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)[3]，每個梯度培養(yǎng)基接種15瓶。每天觀察并記錄試驗現(xiàn)象，20? d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.5? ?生根壯苗

繼代培養(yǎng)上述不定芽生長到合適時的再生芽，從基部切下接種在生根培養(yǎng)基上，每個梯度培養(yǎng)基分別接種15瓶[4]。每天觀察并記錄試驗現(xiàn)象，培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.6? ?煉苗移栽

將生長狀態(tài)良好、長勢較為均一的太行菊組培苗移栽與營養(yǎng)土基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔5 d進(jìn)行此觀察，觀察期間要對其進(jìn)行合理澆水管理[5]。

2.7? ?結(jié)果統(tǒng)計

太行菊愈傷組織再生體系建立見圖1。

誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)愈傷組織的外植體數(shù)/總外植體數(shù)）×100%

增殖倍數(shù)=增殖的叢生芽數(shù)/接種數(shù)

生根率=（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%

3? ?結(jié)果與分析

3.1? ?無菌苗生長

30 d后，太行菊形態(tài)及其生長情況如下。

（1）本試驗過程中沒有出現(xiàn)染菌的情況，即染菌率為 0%。

（2）不同的發(fā)芽率：組培瓶 1、3、4、5 的發(fā)芽率均為 80%;組培瓶 2、6、9、10 的發(fā)芽率均為 60%;組培瓶 7 的發(fā)芽率為 30%;組培瓶 8 的發(fā)芽率為 40%。

（3）組培瓶 1、2、8 的株較高;組培瓶 3、5、7、10 的株高;組培瓶 4、6、9的株較矮。

（4）所有根系都幾乎發(fā)達(dá)[6]。

（5）組培瓶 1 葉片繁盛但基部有少量枯葉;組培瓶 2 基部幾乎沒有黃色葉子;組培瓶 3 葉片小還少;組培瓶 4 葉片繁盛;組培瓶 5 葉片多且較小;組培瓶6 基部有少量枯葉;組培瓶 7 葉片較大;組培瓶 8 葉片少;組培瓶 9 葉片多;組培瓶 10 基部比頂端繁茂。

綜合以上情況，組培瓶 1、2、7 苗長得好，組培瓶 6、9 苗長得較好。做愈傷誘導(dǎo)時選取組培瓶 1、2、7、6、9 為材料。

3.2? ?誘導(dǎo)愈傷組織

30 d后，太行菊組織愈傷誘導(dǎo)情況如下。

3.2.1? ?根的誘導(dǎo)

從濃度 1 到濃度 9，濃度 3、濃度 6 和濃度 9 的誘導(dǎo)率差別不大，且誘導(dǎo)率最高分別為93.3%、93.3%和 96.7%，都可以作為根的愈傷誘導(dǎo)的方案。

濃度 3 的誘導(dǎo)情況：愈傷沒有褐化，體積大;濃度 6 的誘導(dǎo)情況：愈傷帶有少量褐化，體積大;濃度 9 的誘導(dǎo)情況：愈傷沒有褐化，體積較大。綜合誘導(dǎo)率和愈傷是否褐化、大小的情況，此次愈傷誘導(dǎo)試驗的適宜濃度為 9，其配方為：MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA +1.0 mg/L 2，4–D（適宜培養(yǎng)基配方）[7]。

3.2.2? ?莖的誘導(dǎo)

從濃度 1 到濃度 9，濃度 4、6、8 的誘導(dǎo)率差別不大，且誘導(dǎo)率最大分別為76.7%、80.0%和 83.3%，均可作為莖的愈傷誘導(dǎo)方案[8]。濃度 4的誘導(dǎo)情況為愈傷帶有少量褐化，體積大;濃度 6 的誘導(dǎo)情況為愈傷沒有褐化，體積較小;濃度 8 的誘導(dǎo)情況為愈傷沒有褐化，體積較大[9]。綜合誘導(dǎo)率和愈傷是否褐化、大小的情況，此次誘導(dǎo)試驗的適宜濃度是 8，其配方為：MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6–BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4–D（適宜培養(yǎng)基配方）[10]。

3.2.3? ?葉的誘導(dǎo)

從濃度 1 到濃度 9，濃度 3、4、9 的誘導(dǎo)率差別不大，且誘導(dǎo)率最大分別為80.5%、80.0%和 89.5%，均可作為葉的愈傷誘導(dǎo)方案。濃度 3 的誘導(dǎo)情況為愈傷沒有褐化，體積大;濃度 4 的誘導(dǎo)情況為愈傷沒有褐化，體積較小;濃度 9 的誘導(dǎo)情況為愈傷沒有褐化變色，體積較大。綜合誘導(dǎo)率和愈傷是否褐化、大小的情況，此次誘導(dǎo)試驗的適宜濃度為 9，配方為：MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4–D（適宜培養(yǎng)基配方）[11]。

3.2.4? ?綜合根、莖和葉的誘導(dǎo)情況

此次試驗誘導(dǎo)的適宜配方為濃度 9 即MS+8 g瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4–D。根、莖和葉的愈傷均有褐變現(xiàn)象，且根的褐變出現(xiàn)的概率較多，但是褐變的量較少。

3.3? ?叢生芽的增殖培養(yǎng)

不定芽增殖生成叢生芽，叢生芽的增殖情況如下：濃度 1 和濃度 5 增殖較慢，且體積不大，說明增殖情況不好;濃度 2 和濃度 4 雖然增殖較好，但是其體積和濃度 3 相較而言，濃度 3的增殖情況更有優(yōu)勢，綜合所知濃度 3 的增殖情況最好。濃度 3 的培養(yǎng)基配方為：MS+30 g 蔗糖+8 g 瓊脂粉+0.2 mg/L 6–BA+2.0 mg/L NAA[12]。

4? ?討論與結(jié)論

4.1? ?無菌苗生長

通過數(shù)據(jù)可知，染菌率為 0%，說明此消毒方法具有可操作性，具體操作步驟：酒精（75%）消毒 30 s→升汞（0.1%）消毒 8 min→無菌水清洗 3～5 次[13]。

出現(xiàn)不同的發(fā)芽率，且有的發(fā)芽率差距較大如組培瓶 1、2、3、4、5 和組培瓶 7;根系發(fā)達(dá)情況，葉子生長情況都不同，可能的原因包括以下5方面。

（1）有的種子可能經(jīng)過消毒后在外暴露的時間較長。

（2）可能經(jīng)過氯化汞時由于不能一次性把種子取出來，導(dǎo)致停留時間較長。

（3）可能種子本身存在問題。

（4）可能由于使用 pH 試紙調(diào)節(jié) pH值，肉眼觀察會出現(xiàn)誤差，導(dǎo)致培養(yǎng)基的 pH值與理論值存在一定的誤差。

（5）可能是培養(yǎng)瓶沒有洗干凈，有雜物殘留。

以上原因都可能導(dǎo)致試驗結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果有差距[14]。

4.2? ?太行菊組織愈傷誘導(dǎo)

從數(shù)據(jù)可以明顯看出：濃度 3、濃度 6 和濃度 9 誘導(dǎo)愈傷的情況最好，綜合誘導(dǎo)率和愈傷顏色、大小的來看，誘導(dǎo)愈傷的最合適培養(yǎng)基配方為：濃度 9（MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+2.0 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4–D）[15]。

若是大量誘導(dǎo)愈傷，也可以用濃度 3 和濃度 6 的配方：濃度 3（MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+1.0 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4–D）;濃度 6（MS+8 g 瓊脂粉+30 g 蔗糖+1.5 mg/L 6–BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2，4–D）。

本試驗出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象：植物組織本身釋放的褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基變成褐色，從而使愈傷組織也變成褐色，最終導(dǎo)致植物組織死亡。發(fā)生褐化的原因錯綜復(fù)雜，主要由于植物本身的生理特性和培養(yǎng)基的環(huán)境變化[16]。另外，植物的年齡也會影響植物愈傷組織的褐化。植物的莖和段被切割后，切割口細(xì)胞中的酚類化合物是一種保護(hù)性物質(zhì)，使切口不容易被其他物質(zhì)侵染，但是有利有弊，這種酚類物質(zhì)不穩(wěn)定，會引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)：酚類化合物→醌類物（褐色）+水→其他酶失活→代謝紊亂→生長停滯→組織死亡[17]。

褐化現(xiàn)象是試驗中不愿意出現(xiàn)的，所以要解決此問題，可以根據(jù)褐化的因素來制定方案：如果是繼代保存時間過長，也會發(fā)生此類現(xiàn)象;如果是由于植物組織本身中的物質(zhì)酚類化由于環(huán)境因素如培養(yǎng)基或者培養(yǎng)基中的某些物質(zhì)使愈傷組織發(fā)生褐化，對于這種褐變采取適當(dāng)?shù)拇胧┗蛘哂鷤M織適應(yīng)了環(huán)境的變化，褐化的情況會減輕或者褐化的情況不會發(fā)生[18]。徐振彪等將正在生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有NaCl 的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)組織周圍尤其是接觸培養(yǎng)基部分發(fā)生褐變，但培養(yǎng)基中沒有看到擴(kuò)散的褐變物質(zhì)。當(dāng)溫度升高時會使酶失活從而使愈傷組織發(fā)生褐化，酚類物質(zhì)引發(fā)的一系列反應(yīng)需要氧的參與，可以在培養(yǎng)基中加一些活性炭（抗環(huán)血酸）、抗氧化性等物質(zhì)[19]。

4.3? ?叢生芽增殖

增殖快慢、芽高低不一樣的原因如下。

（1）可能是觀察 pH 試紙時肉眼看到的 pH 值與實際值存在誤差。

（2）培養(yǎng)皿可能沒有洗干凈，有雜物殘留。

（3）可能此次的培養(yǎng)基配方中激素加的量較少。