刺梨GL2同源基因的克隆、系譜樹(shù)和表達(dá)分析

黃小龍 陳婷婷 張琴琴 莫佳佳 龔盼琴 閆慧清

摘 要：為了觀察刺梨果實(shí)的果刺細(xì)胞學(xué)發(fā)育過(guò)程，該研究以刺梨‘貴農(nóng)5號(hào)的cDNA為模板，通過(guò)RACE克隆獲得刺梨中與擬南芥表皮毛形成GL2的同源基因RrGL2，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析。結(jié)果表明：（1）刺結(jié)構(gòu)在花芽形成早期基部?jī)?nèi)的細(xì)胞首先不斷分裂，向外繼續(xù)發(fā)育，中部的細(xì)胞變細(xì)、變長(zhǎng)形成“針”狀結(jié)構(gòu)，頂部的細(xì)胞逐漸木質(zhì)化使刺變硬，形成果刺。（2）通過(guò)RACE擴(kuò)增得到RrGL2的cDNA全長(zhǎng)2 292 bp，編碼763 aa氨基酸。（3）RrGL2具有Homeodomain同源結(jié)構(gòu)域和StAR磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白的結(jié)構(gòu)域，RrGL2與其他物種編碼的GL2氨基酸同源性高度相似，并且系譜樹(shù)分析揭示刺梨RrGL2和野草莓的GL2密切相關(guān)。（4）qRT-PCR分析表明，RrGL2在莖和果實(shí)中的表達(dá)水平高于其他組織，在花后7周果刺中的表達(dá)最高，是3周和5周果刺中的7.87倍和2.10倍。綜上結(jié)果發(fā)現(xiàn)RrGL2的功能與果刺的形成發(fā)育密切相關(guān)，該研究為刺梨中刺形成的分子機(jī)制和育種提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺梨，表皮毛，果刺，RrGL2，基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q949.45文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：In order to observe cytological development of prickles in fruits of Rosa roxburghii， R. roxburghii GLABROUS 2 （RrGL2），a prickle-development related AtGL2 homology gene，was isolated from ‘Guinong 5 and relative biological information and expression were analyzed in this paper. The cytological development of fruit thorn of Rosa roxburghii was observed by paraffin section. Leaves of Rosa roxburghii was used to synthesize cDNA based on the manufacturers instructions of RACE. Subsequently RrGL2 was made relative informatics analysis and the gene expression level was eva-luated. The results were as follows：（1） The base cells continuously divided at the early stage of flower bud，then outward developed. The middle cells continued to become thinner and longer to form a “needle” structure. In the early stage of flower bud formation，the cells in the base of the thorn structure first divided continuously and continued to develop outwards. The cells in the middle became thinner and longer，forming a “needle” structure. The lignification gradually was observed at the top cells to make the prickles hard. （2） The full lengths of RrGL2 was 2 292 bp by RACE，encoding 763 amino acids. （3） The RrGL2 had a structure of Homeodomain and StAR phosphatidylcholine transfer protein，which is likely to regulate the development of Rosa roxburghii prickles. Then，a search for homologous species in the NCBI databases revealed a high similarity of amino acid homology encoded by the RrGL2 with other Rosa species，and phylogenic analysis revealed a close relationship of structure domains between Rosa roxburghii and Fragaria vesca. （4） Finally，real-time PCR analysis showed that the relative expression value of RrGL2 in fruit prickles after seven weeks after flowering was the highest，almost respectively 7.87 times and 2.10 times than that during three weeks and during five weeks after flowering. RrGL2，a prickles-forming gene acted to regulate the morphology and development of prickles. Therefore，the function of RrGL2 is closely related to thorn formation. These results could provide theoretical basis for thorn formation and development.

Key words：Rosa roxburghii，trichomes，prickles，RrGL2，gene expression

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，因具有良好的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受消費(fèi)者喜愛(ài)，在中國(guó)西南地區(qū)尤其是貴州省大規(guī)模種植。果實(shí)中因含有一些酚類化合物、抗氧化物等（Van et al.，2008），可作為放射性保護(hù)劑和腫瘤抑制劑（Liu et al.，2012;Xu et al.，2014）;同時(shí)也是果汁和干果的重要原料。然而，刺梨果實(shí)密披果刺，果刺對(duì)水果采摘、食品加工、田間和果園管理造成不便。近年來(lái)隨著園藝業(yè)的發(fā)展，植物果刺已經(jīng)引起越來(lái)越多的關(guān)注。

刺是廣泛存在于許多植物中由表皮組織生長(zhǎng)所形成的漸尖突起（Kellogg et al.，2011），可存在于葉、莖、果實(shí)和其他器官（Feng et al.，2015）。刺的存在增加植物表皮厚度，減少熱量和水分的散失，防止昆蟲(chóng)和病原體的侵襲或機(jī)械損傷（Gomes et al.，2012）。覆盆子和玫瑰的刺來(lái)源于修飾的腺毛，它們繼續(xù)生長(zhǎng)并最終硬化成最終的刺狀形態(tài)，作為表皮組織的外生物。因此，刺是表皮毛與少數(shù)皮層細(xì)胞的變形所形成的;表皮毛是植物器官表面一種特殊的單細(xì)胞結(jié)構(gòu);表皮毛發(fā)育所需基因的時(shí)空表達(dá)受一種三元激活復(fù)合物協(xié)調(diào)（An et al.，2011）。植物表皮毛發(fā)育的調(diào)節(jié)特別是在擬南芥中的研究取得了很大的進(jìn)展。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子MYB[GLABRA 1（GL1）、WEREWOLF、CAPRICE、TRIPTYCHON];WD-40型[（TRANSPARENT TESTA GLABRA 1（TTG1];bHLH[GLABRA 3（GL3）];ENHANCER of GLABRA 3（EGL3）;HD-zip[GLABRA2（GL2）]和WRKYl類轉(zhuǎn)錄因子[TRANSPARENT TESTA GLABRA2（TTG2）]（Zhao et al.，2008; Gan et al.，2011）。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)得到GL1和TTG1可以結(jié)合到GL3和EGL3的不同區(qū)域，表明MYB-bHLH-WD40復(fù)合物可形成三聚體轉(zhuǎn)錄激活成分，并調(diào)控表皮毛發(fā)育的下游基因和形態(tài)發(fā)生（Pesch et al.，2015; Ramsay & Glover，2015）。GL2可通過(guò)反饋機(jī)制激活參與表皮毛成熟的TTG1復(fù)合體來(lái)切換MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的功能。在表皮毛和根毛的形成過(guò)程中，兩個(gè)相鄰的細(xì)胞能夠相互競(jìng)爭(zhēng)GL2/TTG1等表達(dá)調(diào)控因子（Pu et al.，2003）。

GL2在表皮毛形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞分枝、擴(kuò)張和細(xì)胞壁成熟（Szymanski et al.，1998）。GL2是一種同源框基因，編碼含有StAR（steroidogenic acute regulatory protein）結(jié)構(gòu)域的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子。這種同源框蛋白可在植物不同的發(fā)育過(guò)程中協(xié)調(diào)靶基因的表達(dá)（Rerie et al.，1994; Di & Al，1996）。GL2在成熟表皮毛中持續(xù)表達(dá)，并且是在早期形態(tài)發(fā)生中非根毛細(xì)胞和表皮毛分化所必需（Fyvie et al.，2015）。前人研究表明，GL2是調(diào)節(jié)根毛發(fā)育所必需的，并且優(yōu)先在根的分生組織和伸長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的非毛發(fā)表皮細(xì)胞中表達(dá)（Masucci et al.，1996）。GL2突變體和GL2/GL3雙突變體均影響表皮毛的形態(tài)發(fā)生，使葉片上的表皮毛降解和減少，同時(shí)GL2突變體還具有種皮粘液缺乏、形成異位根毛等表型（Gao et al.，2008; Shi et al.，2012）。此外GL2突變體不能形成圍繞表皮毛的毛狀輔助細(xì)胞。遺傳實(shí)驗(yàn)表明，GL2是GL1和TTG1的下游調(diào)控基因 （Pesch & Hülskamp，2011）。

本研究利用貴州省廣泛種植的‘貴農(nóng)5號(hào)分離克隆與果刺發(fā)育有關(guān)的RrGL2，對(duì)RrGL2基因進(jìn)行了生物信息分析和時(shí)空表達(dá)檢測(cè)，可為進(jìn)一步研究刺梨果刺形成和發(fā)育的分子機(jī)制以及通過(guò)基因工程培育刺梨無(wú)刺果實(shí)提供了遺傳資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和細(xì)胞學(xué)分析

采集刺梨‘貴農(nóng)5號(hào)的葉片和果實(shí)后，一部分立即在液氮中冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃。選擇葉、幼果和成熟果實(shí)并收集花后3周、5周和7周的果刺以檢測(cè)RrGL2的表達(dá)水平。另一部分通過(guò)體視顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）觀察并拍照。

采摘不同時(shí)期的幼芽用FAA固定液固定，先在離心管中裝入3 mL固定液，將樣品放入固定液中，封口膜封口，用解剖針在封口膜上扎幾個(gè)小孔，然后抽真空，抽過(guò)真空后再加入2 mL固定液（樣品與固定液之比約為1∶20）。若長(zhǎng)期保存應(yīng)將固定液換成70%酒精，4 ℃冰箱保存。第1天用70%酒精過(guò)夜，第2天用85%酒精、95%酒精、無(wú)水酒精、無(wú)水酒精、1/5二甲苯、2/5二甲苯、3/5二甲苯、4/5二甲苯、純二甲苯進(jìn)行梯度洗脫，純二甲苯處理后加碎蠟（放入36 ℃烘箱，放置3 d以上）洗滌。將已固著和修好的蠟塊裝在樣品固定器上，并固定好。將切片刀裝在切片機(jī)上。調(diào)節(jié)刀片的厚度為8～15 μm。

將切出的蠟帶，平展于盒內(nèi)以供展片。之后經(jīng)顯微鏡（BX53，Olympus，Japan）觀察，SPOT FLEXTM CCD拍攝（Diagnostic Instrument，USA）。

1.2 RNA提取和純化

使用Trizol試劑（TaKaRa，Japan）提取莖、葉片、花芽、種子和花后3周、5周和7周的皮刺部位的總RNA，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明。先用DNA酶（TaKaRa，Japan）處理RNA樣品。然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明使用oligo dT-接頭引物的RT-PCR Kit（TaKaRa，Japan）將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 分離GL2 cDNA

1.3.1 3′RACE的合成 利用3′ RACE（TaKaRa，Japan）試劑盒以刺梨葉片提取的RNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成。根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載的其他生物所報(bào)道的與果刺發(fā)育有關(guān)的GL2同源序列設(shè)計(jì)引物。用引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增基因的3′ 末端（表1）。第一輪PCR：首先94 ℃變性3 min，然后進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）和最后72 ℃延伸10 min。然后以第一輪PCR產(chǎn)物作為第二次PCR擴(kuò)增的模板，并且在與第一輪PCR相同的條件下運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。

1.3.2 5′RACE的合成 根據(jù)SMARTerTM RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（No.634923，Clontech），以葉片總RNA為模板合成cDNA第一鏈。按照上述3′末端的序列合成基因特異性引物（表1）進(jìn)行Touch-down PCR：首先（94 ℃，30 s;72 ℃，90 s）5個(gè)循環(huán)，然后（94 ℃，30 s;70 ℃，30 s;72 ℃，1 min）5個(gè)循環(huán)，最后（94 ℃，30 s;55 ℃，2 min;72 ℃，2 min）30個(gè)循環(huán)。

1.4 克隆和測(cè)序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，挖膠回收后以瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒（DV805A，TaKaRa，Janpan）純化，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa，Janpan）中，最后熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株（Trans，China）。陽(yáng)性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（中國(guó)上海）測(cè)序。

1.5 序列分析

使用NCBI ORF finder對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的GL2開(kāi)放閱讀框片段進(jìn)行分析。通過(guò)NCBI BLASTp獲得RrGL2同源蛋白。使用ProtParam分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成。用ProtScale的Kyte & Doolittle方法預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)的親水性或疏水性。TMHMM 2.0服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。SMART在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ESPript 3.0（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。Mega6.0軟件Neighbor-Joining法用于構(gòu)建系譜樹(shù)。

1.6 基因表達(dá)檢測(cè)

使用FastStart DNA Master SYBR Green I試劑盒在LightCycler 480儀器（Roche，Switzerland）中進(jìn)行RrGL2的qRT-PCR檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參基因。引物為RrGL2，F(xiàn)orward （5′-3′）：CGAGGCAGTGACAGTGAAGG; Reverse （5′-3′）：GGCAGACTCAACAGACTCCATAG。β-actin Forward （5′-3′）：CCGCCATGTA TGTTGCCATCC; Reverse （5′-3′）：AGCCAGGTCAAGACGCAGAAT。

qRT-PCR程序根據(jù)SYBR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：在95 ℃變性30 s，在55 ℃退火30 s，并在72 ℃延伸1 min。相對(duì)于對(duì)照的表達(dá)水平通過(guò)計(jì)算△△Ct[（△△Ct=sample △Ct-control △Ct），△Ct= RrGL2 Ct -（β-actin）Ct]，然后用2-△△Ct方法分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中的所有數(shù)據(jù)均為三次生物學(xué)重復(fù)的平均值和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用SPSS單因素方差分析方法分析獲得的數(shù)據(jù)，Duncan多重檢驗(yàn)以比較統(tǒng)計(jì)顯著性差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨不同組織的觀察和早期細(xì)胞學(xué)研究

分別選取刺梨的不同部位觀察，如圖1所示，包括的組織有莖（圖1：A）、葉（圖1：B）、花芽（圖1：C）、果實(shí)（圖1：D）和種子（圖1：E）。在莖和果實(shí)的組織表面上觀察到有一些堅(jiān)硬的刺，分別為枝刺和果刺。在花芽最外的部位也存在少量刺的形態(tài)，葉片和種子外表面沒(méi)有出現(xiàn)堅(jiān)硬的刺。

進(jìn)一步選取不同發(fā)育階段的果實(shí)進(jìn)行果刺數(shù)量和長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)，如表2所示。選取花后3、5和7周形成的果實(shí)，此時(shí)刺梨果實(shí)的直徑分別是1.5、2.3和3.4 cm。將果實(shí)分為三個(gè)部位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別為上部、中部和下部。從表2可以得到，在不同的發(fā)育時(shí)期，果刺的數(shù)量均主要集中在中部，上部和下部數(shù)量較少。隨著果實(shí)的發(fā)育，三個(gè)部位果刺的長(zhǎng)度均發(fā)生顯著性的增加。

刺梨經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后，在外界各因素達(dá)到一定要求時(shí)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，這是刺梨果實(shí)形成的必經(jīng)階段。當(dāng)刺梨進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期，刺梨莖端分生組織細(xì)胞開(kāi)始分裂分化，在花的發(fā)育過(guò)程中刺梨萼片上的刺細(xì)胞也開(kāi)始不斷發(fā)生?；ǖ陌l(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，最初觀察到花萼上有少量已經(jīng)形成的刺結(jié)構(gòu)，隨著花的發(fā)育，萼片上刺結(jié)構(gòu)會(huì)成批次的產(chǎn)生，逐漸增多（圖2：A）。當(dāng)花的結(jié)構(gòu)慢慢向外展開(kāi)時(shí)，在花瓣原基基部處，雄蕊原基開(kāi)始慢慢發(fā)育形成一些粗而短的近似橢圓形的結(jié)構(gòu)，刺原基突起內(nèi)的基本分生組織細(xì)胞進(jìn)行切向分裂，細(xì)胞數(shù)目開(kāi)始增加，表皮上的細(xì)胞也進(jìn)行分裂以適應(yīng)刺的向外延伸（圖2：B）。基部?jī)?nèi)的細(xì)胞迅速分裂使基部擴(kuò)展變大，中部細(xì)胞增多，形態(tài)也發(fā)生變化，橢圓形的細(xì)胞開(kāi)始變細(xì)、變長(zhǎng)，尖端呈“針”狀型結(jié)構(gòu)，刺結(jié)構(gòu)的整體外形初步形成（圖2：C）。

2.2 刺梨RrGL2的序列分析

以‘貴農(nóng)5號(hào)的RNA為模板，通過(guò)RACE方法得到RrGL2的全長(zhǎng)cDNA。RrGL2（Genebank登錄號(hào)：MG386498）的全長(zhǎng)為2 292 bp，編碼763個(gè)氨基酸。BLAST分析表明，刺梨的RrGL2序列和野草莓（Fragaria vesca）、碧桃（Prunus persica）、蘋果（Malus domestica）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）和桑（Morus notabilis）GL2具有較高的同源性，分別是96%、88%、86%、78%和80%的相似性。

ProtParam分析RrGL2得到其分子量為8.49 kDa。RrGL2的等電點(diǎn)是5.73。 RrGL2含有13.76%的酸性氨基酸、13.63%的堿性氨基酸、38.79%的疏水性氨基酸、27.39%的帶電荷氨基酸和61.07%的極性氨基酸。ProtScale分析RrGL2得到其親水性氨基酸的數(shù)量明顯大于疏水性氨基酸的數(shù)量，且親水性的平均值為-0.525，表明RrGL2編碼的蛋白質(zhì)為可溶性蛋白質(zhì)。TMHMM2.0預(yù)測(cè)表明RrGL2不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.3 RrGL2的同源蛋白和系譜樹(shù)分析

將不同物種的GL2進(jìn)行比對(duì)分析（圖3：A）。BLAST分析表明，RrGL2和野草莓（Fragaria vesca）、碧桃（Prunus persica）、蘋果（Malus domestica）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）和桑（Morus notabilis）的蛋白質(zhì)序列相似性較高，分別是98%、92%、90%、83%和82%相似性。

基于RrGL2的三維結(jié)構(gòu)（PDB編號(hào)：2Z9Z），利用ESPript 3.0得到蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖3：A所示，β-轉(zhuǎn)角是序列的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)。多序列比對(duì)的結(jié)果表明，RrGL2與其他物種的二級(jí)結(jié)構(gòu)域也較為保守。SMART分析顯示RrGL2的結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，分別是位于107～169氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域HOX（homeobox）和位于276～500氨基酸的START（StAR和磷酰膽堿轉(zhuǎn)移蛋白）（圖3：B）。圖3：C以兩種不同的方式顯示了RrGL2三維結(jié)構(gòu)，在不同的折疊處，包括轉(zhuǎn)角和不規(guī)則的卷曲均可發(fā)生與DNA/RNA的結(jié)合。使用Mega 6.0軟件構(gòu)建RrGL2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖，得到刺梨與其他植物的親緣關(guān)系，如圖4所示。圖中顯示RrGL2與野草莓中的GL2序列最相似。除此之外，RrGL2與其他薔薇科植物的親緣關(guān)系也較近，如桃、櫻桃、梅和蘋果。

2.4 RrGL2在不同組織和果實(shí)發(fā)育的表達(dá)模式

利用Real-time PCR獲得RrGL2在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示。RrGL2在種子中的表達(dá)量最低，莖和果實(shí)的RrGL2表達(dá)量分別是種子的59.95倍和33.52倍。葉和花中RrGL2的表達(dá)量分別是種子中的7.99倍和15.62倍。

從圖5：B中可以看出，花后3、5和7周的果刺中RrGL2表達(dá)量。結(jié)果表明隨著果實(shí)的發(fā)育和果刺的增加，RrGL2表達(dá)量逐漸增加，在花后7周果刺中RrGL2表達(dá)量最高，分別是花后3周和5周果刺中的7.87倍和2.10倍，可以推斷RrGL2在果刺的形成中發(fā)揮一定的作用。

3 討論

形態(tài)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺梨莖上有一些堅(jiān)硬的刺，果實(shí)外表面上密披果刺。通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察得到，果刺在花芽階段已經(jīng)形成。同時(shí)，RrGL2在莖和果中的表達(dá)水平高于其他組織，說(shuō)明RrGL2可能在果刺和表皮毛形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。研究表明RrGL2作用在果實(shí)發(fā)育早期的果刺中檢測(cè)到RrGL2的表達(dá)，證明它可能在果實(shí)發(fā)芽階段起作用（Ohashi et al.，2002; Vernoud et al.，2009）。隨著果實(shí)的成熟，果刺的數(shù)量和長(zhǎng)度都增加。與形態(tài)學(xué)改變相對(duì)應(yīng)，RrGL2的表達(dá)水平也隨之提高。這些結(jié)果暗示RrGL2可能與刺梨果刺發(fā)育起始密切相關(guān)（Rerie et al.，1994）。而在花后7周的果實(shí)果刺中RrGL2表達(dá)量達(dá)到最高，暗示與刺發(fā)育相關(guān)的RrGL2基因能夠增加果刺的形成。轉(zhuǎn)錄因子EGL3和TTG1參與GL2的表達(dá)調(diào)控，最終導(dǎo)致表皮毛形成（Song et al.，2015）。MYB類蛋白如GL1和WER，可通過(guò)與bHLH蛋白相互作用來(lái)調(diào)節(jié)GL2同源框基因在特定部位的表達(dá)。同時(shí)GL2的表達(dá)還受到CAPRICE MYB的抑制（Lee & Schiefelbein，1999）。RrGL2作為一個(gè)關(guān)鍵基因和其他參與調(diào)節(jié)刺梨果刺發(fā)育的基因功能還需要進(jìn)一步的功能分析確定。

本研究通過(guò)RACE技術(shù)從刺梨中克隆得到RrGL2。在NCBI blast數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得RrGL2與其他物種的氨基酸結(jié)構(gòu)域的高度相似性的GL2類蛋白成員，表明RrGL2可能與這些物種中的GL2具有類似功能，參與調(diào)節(jié)果刺的起始，形態(tài)發(fā)生和發(fā)育（Wang et al.，1999）。結(jié)構(gòu)域分析顯示RrGL2是一個(gè)Homeodomain蛋白。Homeodomain蛋白可結(jié)合DNA并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄DNA模板，參與形成多蛋白復(fù)合物從而調(diào)控發(fā)育基因的表達(dá)（Foronda et al.，2009）。RrGL2的三級(jí)結(jié)構(gòu)是DNA/RNA結(jié)合螺旋結(jié)構(gòu)和orthogonal結(jié)構(gòu)，這也暗示RrGL2可以與DNA相互作用并控制。同時(shí)，GL1和GL3轉(zhuǎn)錄因子的相互作用激活GL2的表達(dá)（Wang & Chen，2008）。據(jù)報(bào)道GL2以細(xì)胞位置依賴性方式在根毛分化形成過(guò)程中調(diào)節(jié)根毛發(fā)育，并影響種子含油量（Masucci et al.，1996; Shen et al.，2006）。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)的分析方法得到RrGL2調(diào)節(jié)蛋白與其他物種中的直系同源物，展現(xiàn)GL2中正向進(jìn)化選擇的潛力。利用時(shí)空表達(dá)的檢測(cè)獲得RrGL2在不同組織和果刺不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平。因此，本文為揭示和理解參與刺梨果刺發(fā)育的基因以及果刺發(fā)育分子機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)，為通過(guò)基因工程培育更少或甚至無(wú)刺刺梨提高理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）