丙三醇對(duì)螺旋霉素I 發(fā)酵的影響及機(jī)理分析

梁培培， 高淑紅， 姚開亞， 孫玲玲， 張志勇， 賴 珅

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

螺旋霉素(Spiramycin)是一種16 元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是法國(guó)實(shí)驗(yàn)室Rhone-Poulenc 于1954 年從生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)的代謝產(chǎn)物中分離所得[1]。螺旋霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要由一個(gè)16 元內(nèi)酯環(huán)及所連接的兩個(gè)氨基糖福洛氨糖(Forosamine)、碳霉氨糖(Mycaminose)和一個(gè)中性糖碳霉糖(Mycarose)組成[2]。螺旋霉素通過將內(nèi)酯環(huán)結(jié)合到細(xì)菌核糖體的大亞基上，在空間上阻斷細(xì)菌新生肽鏈的延伸，從而達(dá)到抑菌效果。因其較強(qiáng)的抗菌活性及持續(xù)的抗生素后效性，已被廣泛應(yīng)用于臨床感染性疾病的治療[3-5]。依據(jù)C-3 位原子的?；潭炔煌?，又可將螺旋霉素分為未被?；穆菪顾丌?，乙酰化的螺旋霉素Ⅱ和丙?；穆菪顾丌骩6]。其中螺旋霉素I 生物效價(jià)較高，約是螺旋霉素II、III 的1.8 倍和1.4 倍[7]。

生二素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生螺旋霉素的發(fā)酵液中，產(chǎn)物以螺旋霉素I 為主，并有少量螺旋霉素II、III。除此之外，螺旋霉素發(fā)酵液中容易積累多種雜質(zhì)組分，如雜質(zhì)F（4'''-N-demethyl spiramycin I dipolymer），雜質(zhì)A（Neospiramycin），雜質(zhì)B（Spiramycin Ⅳ），雜質(zhì)D（Spiramycin V）等，這些組分生物效價(jià)不高，且有一定的毒副作用，不僅影響提取收率，還降低了螺旋霉素的產(chǎn)量和品質(zhì)[8-9]。因此降低雜質(zhì)組分含量，也成為螺旋霉素生產(chǎn)中的重要指標(biāo)。

螺旋霉素的合成以短鏈脂肪酸?；o酶A 為前體，在Ⅰ型聚酮合酶的催化作用下形成內(nèi)酯環(huán)，內(nèi)酯環(huán)經(jīng)一系列后修飾步驟，最終形成具有抗菌活性的螺旋霉素分子，其中內(nèi)酯環(huán)的形成被認(rèn)為是主要的限制性因素[10-11]。發(fā)酵液中含量最高的雜質(zhì)組分是D，其結(jié)構(gòu)是螺旋霉素C-9 位上的福洛氨糖被碳霉糖取代[12]。對(duì)螺旋霉素生物合成基因簇的研究表明，與糖基合成相關(guān)的基因srm20 和srm33 是分別參與福洛氨糖和碳霉糖合成途徑中的重要基因，分別編碼氨基轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶[13-14]。

為改善螺旋霉素的發(fā)酵水平，研究人員在前體添加和發(fā)酵工藝優(yōu)化方面均進(jìn)行了大量研究。其中朱鳳、武培等[15-16]在發(fā)酵前期分別添加吐溫-85 和金屬離子Zn2+，促進(jìn)了菌體代謝，增加了細(xì)胞膜的通透性，為螺旋霉素的合成提供了更多的前體物質(zhì)，促使發(fā)酵效價(jià)分別提高了11.9%和17%左右，從前體物質(zhì)增加的角度詮釋了發(fā)酵效價(jià)提高的原因。Li 等[17]在發(fā)酵初期添加Al3+，增加前體物質(zhì)的同時(shí)還提高了與內(nèi)酯環(huán)合成有關(guān)的乙酰CoA 合成酶、乙酸激酶及乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶等的活性，使螺旋霉素效價(jià)提高了19.51%。羅俊等[18]在發(fā)酵過程中添加氯化膽堿，增加乙酸等前體物質(zhì)的濃度，增大了三羧酸循環(huán)(TCA)循環(huán)的通量，使發(fā)酵效價(jià)提高了15%左右，氯化膽堿作為甲基化試劑在提高效價(jià)的同時(shí)也顯著降低了雜質(zhì)F 的含量。胡蓉等[19]在發(fā)酵過程中添加丙三醇，增強(qiáng)了糖酵解途徑EMP 途徑和TCA 循環(huán)的代謝流，促進(jìn)細(xì)胞的初級(jí)代謝，提高了螺旋霉素的生產(chǎn)速率和產(chǎn)量。上述文獻(xiàn)從多個(gè)方面對(duì)螺旋霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但并未從分子層面深入了解螺旋霉素產(chǎn)量提高及雜質(zhì)含量降低的原因。Fondi 等[20]通過代謝建模研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)srm4 基因能夠增強(qiáng)CoA 代謝途徑的碳流量，進(jìn)而顯著提高螺旋霉素的生產(chǎn)力。Yao 等[12]嘗試從基因轉(zhuǎn)錄層面研究了不同糊精對(duì)生二素鏈霉菌發(fā)酵的影響，解釋了螺旋霉素產(chǎn)量提高及雜質(zhì)組分降低的原因。

本文研究不同發(fā)酵階段添加丙三醇對(duì)螺旋霉素Ⅰ發(fā)酵的影響，優(yōu)化其最佳添加時(shí)間和添加濃度，并進(jìn)一步通過熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄水平，研究與螺旋霉素I 發(fā)酵產(chǎn)量提高、雜質(zhì)D 組分含量降低相關(guān)的原因。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)，為本實(shí)驗(yàn)室貯存菌株；糊精、玉米漿、黃豆餅粉等來源于天方藥業(yè)有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，乙腈、甲醇為色譜級(jí)。RNA 抽提試劑盒購(gòu)自TIANGEN 生物科技有限公司，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司，SYBR Premix Ex TaqTMGC 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀Agil ent Technologies 1260 Infinity(安捷倫科技有限公司)；15 L 發(fā)酵罐BSW-A(上海國(guó)強(qiáng)生物工程設(shè)備有限公司)；搖床SPH-3222(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；小型高速冷凍離心機(jī)Centrifuge5415-R(德國(guó)Eppendorf 公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀CFX96(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.3 培養(yǎng)基組分

一級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：糊精45，黃豆餅粉15，玉米漿10，碳酸鈣5，pH 7.0。

二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L)：糊精40，黃豆餅粉8，酵母粉5，硫酸銨2，氯化鈉3，磷酸二氫鉀1，玉米漿12，碳酸鈣5，豆油20，pH 7.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：糊精65，黃豆餅粉5，酵母粉5，硫酸銨4，氯化鈉15，磷酸二氫鉀4，硫酸鎂1，硫酸鋅0.1，玉米漿3，氯化鈷0.003，碳酸鈣10，豆油20，pH 7.0。

15 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)：糊精50，葡萄糖12，酵母粉2.5，硫酸銨2，磷酸二氫鉀4，氯化鈉3，硫酸鋅1，硫酸鎂1，氯化鈷0.3，玉米漿20，碳酸鈣14，豆油20，泡敵0.2，pH 7.0。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

搖瓶培養(yǎng)：將1 mL 冷凍保藏的種子液接種于裝有30 mL 一級(jí)種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度(28.0±0.5) ℃下培養(yǎng)48 h。然后將一級(jí)種子液按6%接種量接入裝有25 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中搖瓶中，在轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度(27.0±0.5) ℃下培養(yǎng)6 d。

15 L 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將一級(jí)種子液按6%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有60 mL 二級(jí)種子培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，在轉(zhuǎn)速220 r/min，溫度(28.0±0.5) ℃下培養(yǎng)26 h。然后將二級(jí)種子液按照6%接種量接入15 L 發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基裝液量10 L，培養(yǎng)溫度26.5 ℃，發(fā)酵6～7 d，并根據(jù)發(fā)酵過程中的參數(shù)變化調(diào)整轉(zhuǎn)速和補(bǔ)料。

運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定螺旋霉素效價(jià)與雜質(zhì)含量：取發(fā)酵液1 mL，在轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心10 min，取上清液用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后進(jìn)樣。

色譜柱及測(cè)試條件：ZORBAX SB-C8 色譜柱(安捷倫科技有限公司，250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動(dòng)相為9.3 g/L 高氯酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈，高氯酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈的體積比為7∶3；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm，進(jìn)樣量20 μL。外標(biāo)法測(cè)定螺旋霉素Ⅰ效價(jià)。雜質(zhì)D 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為雜質(zhì)峰面積除以螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積與雜質(zhì)A、B、F、D 峰面積之和。

總RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 反應(yīng)：采取液氮研磨的方法獲得總RNA，然后42 ℃水浴2 min將樣品中的基因組DNA 去除，最后在37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃加熱5 s 終止反應(yīng)，得到cDNA，并于-20 ℃保存。最后進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)以2-ΔΔCt法來考察基因的轉(zhuǎn)錄水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙三醇添加時(shí)間與添加濃度的優(yōu)化

螺旋霉素Ⅰ主要化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成分別如圖1和表1 所示。本實(shí)驗(yàn)選擇在搖瓶發(fā)酵0、24、48、72、96、120 h 這6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行添加，添加體積分?jǐn)?shù)均為0.55%。圖2 示出了丙三醇添加時(shí)間及添加體積分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋霉素Ⅰ合成的影響（以CK 為對(duì)照組）。由圖2 可知，添加時(shí)間為24 h 時(shí)，螺旋霉素I 效價(jià)比對(duì)照組顯著提高10.87%（p＜0.05），添加時(shí)間為0 時(shí)，螺旋霉素I 效價(jià)顯著降低24.51%（p＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)添加效果不顯著。由上述發(fā)酵結(jié)果可知，丙三醇的最佳添加時(shí)間是24 h。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選擇丙三醇體積分?jǐn)?shù)分別為0.2%、0.4%、0.55%、0.7%、0.9%和1.2%，添加時(shí)間均為搖瓶發(fā)酵24 h，研究其添加體積分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋霉素I 發(fā)酵的影響。由圖2 可知，丙三醇最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，螺旋霉素I 效價(jià)顯著提高17.12%（p＜0.01），其他濃度添加效果不顯著。

搖瓶發(fā)酵24 h 時(shí)添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇，提高了螺旋霉素I 效價(jià)，而螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ含量變化不顯著(圖略)，同時(shí)雜質(zhì)組分含量也有一定程度的降低（圖3），其中雜質(zhì)D 質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低21.39%（p＜0.01），其余3 種雜質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，因此后續(xù)主要研究雜質(zhì)D 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。

2.2 15 L 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在15 L 發(fā)酵罐中研究添加丙三醇對(duì)發(fā)酵過程的影響，與搖瓶相比，發(fā)酵罐的供氧條件較好，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)更為充足，菌體在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)更快，產(chǎn)素期提前。實(shí)驗(yàn)選擇12、15、18、24 h 這4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)一次性補(bǔ)入最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

圖 1 螺旋霉素的主要化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Main chemical structure of spiramycin

表 1 螺旋霉素的主要化學(xué)組成Table 1 Main chemical formula of spiramycin

圖 2 丙三醇添加時(shí)間及添加體積分?jǐn)?shù)對(duì)螺旋霉素I 合成的影響Fig. 2 Influences of the adding time and adding volume fraction of glycerol on the synthesis of spiramycinⅠ

由圖4 可知，在上述4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加丙三醇對(duì)螺旋霉素I 的合成均有一定的促進(jìn)作用，其中15 h 添加促進(jìn)效果最顯著（p＜0.01）。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選擇在分酵15 h 向15 L 發(fā)酵罐中添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇溶液作為最優(yōu)添加條件。

圖 3 優(yōu)化丙三醇添加時(shí)間和添加體積分?jǐn)?shù)下雜質(zhì)含量的變化Fig. 3 Change of impurity content at the optimal adding time and adding volume fraction of glycerol

圖 4 丙三醇添加時(shí)間對(duì)螺旋霉素Ⅰ合成的影響Fig. 4 Influence of glycerol adding time on the synthesis of spiramycin Ⅰ

未添加丙三醇的對(duì)照罐與15 h 添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇溶液的條件罐的發(fā)酵過程中效價(jià)和雜質(zhì)D 的變化如圖5 所示，可以看出，添加丙三醇罐螺旋霉素 I 起始效價(jià)高于未添加罐，并在整個(gè)發(fā)酵過程中保持較高的增長(zhǎng)趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，添加丙三醇罐的螺旋霉素 I 最終效價(jià)（23 314 U/mL）相比未添加罐（18 329 U/mL）顯著提高27.20%（p＜0.01）。

添加丙三醇罐的雜質(zhì)D 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在整個(gè)發(fā)酵過程中都不高于未添加罐，尤其120 h 以后，前者雜質(zhì)D 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯低于后者，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，前者雜質(zhì)D 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8.84%)與后者(11.99%)相比顯著降低26.27%（p＜0.01）。同時(shí)還測(cè)定了螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖6 所示，發(fā)酵過程中添加丙三醇罐二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)比未添加罐稍低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩罐二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本一致。

圖 5 效價(jià)和雜質(zhì)D 的變化趨勢(shì)Fig. 5 Tendency of the titer and impurity D

圖 6 螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ的變化趨勢(shì)Fig. 6 Tendency of the spiramycin Ⅱ and spiramycin Ⅲ

2.3 添加丙三醇對(duì)螺旋霉素I 合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為從基因?qū)用嫣骄柯菪顾豂 內(nèi)酯環(huán)合成、兩種糖苷配基的合成與雜質(zhì)D 組分合成之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)以鏈霉菌初級(jí)sigma 因子編碼基因hrdB 為參比，對(duì)螺旋霉素發(fā)酵過程中相關(guān)基因srm10（內(nèi)酯環(huán)合成相關(guān)基因），srm20和srm33 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)。

在螺旋霉素I 的生物合成過程中，限制性因素內(nèi)酯環(huán)的合成通常在Ⅰ型聚酮合酶的催化作用下完成。圖7 示出了發(fā)酵15 h 時(shí)添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇溶液的條件罐相對(duì)于未添加丙三醇的對(duì)照罐，srm10，srm20 和srm33 基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄結(jié)果。由圖可知，發(fā)酵48 h 時(shí)，添加丙三醇后srm10 基因的轉(zhuǎn)錄水平是未添加罐基因轉(zhuǎn)錄水平的近3 倍，說明添加丙三醇能有效促進(jìn)發(fā)酵早期srm10 基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)酵72 h 后兩罐基因轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)，說明72 h以后srm10 基因的轉(zhuǎn)錄水平變化不大。另外，添加丙三醇能顯著提高發(fā)酵72 h 時(shí)srm20 與srm33 基因的轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.01）；添加丙三醇對(duì)其他時(shí)間點(diǎn)的srm20 與srm33 基因轉(zhuǎn)錄無顯著作用。

圖 7 srm10，srm20 和srm33 基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄結(jié)果Fig. 7 Relative transcription of genes srm10, srm20 and srm33

Karray 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，螺旋霉素合成相關(guān)基因srm10、srm20 與srm33 有相似的轉(zhuǎn)錄模式，發(fā)酵36 h轉(zhuǎn)錄水平升高，之后轉(zhuǎn)錄水平下降。發(fā)酵生成螺旋霉素的過程是從40～48 h 以后開始持續(xù)合成至72 h。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，srm10 基因在48 h 大量轉(zhuǎn)錄，而與糖基合成的相關(guān)基因srm20 和srm33 在72 h左右達(dá)到峰值，說明在螺旋霉素合成過程中大環(huán)合成基因以及糖基合成基因存在時(shí)序變化，內(nèi)酯環(huán)合成后連接糖基形成完整的螺旋霉素分子。

雜質(zhì)D 與螺旋霉素I 結(jié)構(gòu)上的差異在于C-9 位的糖苷配基由福洛氨糖錯(cuò)配成碳霉糖，當(dāng)碳霉糖的相對(duì)合成增加或者福洛氨糖的相對(duì)合成減少，都會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)D 的增加[12]。從srm20 和srm33 基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)序變化來看，添加丙三醇對(duì)72 h 時(shí)srm20 的促進(jìn)作用更大，猜測(cè)福洛氨糖合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了福洛氨糖的合成，從而使得較多福洛氨糖連接在母環(huán)上，減少了螺旋霉素雜質(zhì)D 的合成。

3 討 論

為研究丙三醇的添加工藝，添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇搖瓶發(fā)酵24 h 能夠有效促進(jìn)螺旋霉素I 的合成，效價(jià)達(dá)到20 982 U/mL，與對(duì)照值(17 915 U/mL)相比提高了17.12%，雜質(zhì)D 的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為 8.16%， 與 對(duì) 照 值 (10.38%)相 比 降 低 了21.39%。在15 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，15 h 左右向罐中添加最終體積分?jǐn)?shù)為0.4%的丙三醇溶液，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，螺旋霉素I 最終效價(jià)達(dá)到23 314 U/mL，相比對(duì)照(18 329 U/mL)提高27.20%，最終雜質(zhì)D 含量為8.84%，與對(duì)照(11.99%)相比降低了26.27%。

選擇與螺旋霉素生物合成相關(guān)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的研究，實(shí)驗(yàn)選取與內(nèi)酯環(huán)合成相關(guān)的基因srm10，福洛氨糖合成通路上的基因srm20 以及碳霉糖合成通路上的基因srm33[13-14]。結(jié)果顯示，添加丙三醇罐的srm10 基因在48 h 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于未添加罐，同時(shí)srm20 與srm33 基因在72 h 轉(zhuǎn)錄水平明顯高于未添加罐。

螺旋霉素生物合成過程中，限制性因素內(nèi)酯環(huán)的合成需要諸多前體物質(zhì)在眾多酶的催化下產(chǎn)生。其中短鏈脂肪酸可作為前體物質(zhì)在CoA 合成酶及與酰基磷酸轉(zhuǎn)移酶耦聯(lián)的?；っ竷煞N酶系催化作用下可轉(zhuǎn)化成內(nèi)酯環(huán)合成所需的直接前體物質(zhì)CoA[21]。胡蓉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，丙三醇有利于乙酸和丙酸等前體物質(zhì)的積累，從而提高了螺旋霉素效價(jià)。Khaoua 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸能夠誘導(dǎo)?；っ负王；姿徂D(zhuǎn)移酶的合成，進(jìn)而提高螺旋霉素產(chǎn)量。Ⅰ型聚酮合酶體系是螺旋霉素內(nèi)酯環(huán)生物合成過程中最為重要的組成部分，已活化的?；鶈卧谄浯呋戮酆铣蓛?nèi)酯環(huán)[10]。Ⅰ型聚酮合酶基因簇由5 個(gè)亞單元組成，srm10 基因作為其中一個(gè)亞單元，其轉(zhuǎn)錄水平的高低與內(nèi)酯環(huán)的合成密切相關(guān)[14]。猜測(cè)丙三醇的添加，促進(jìn)了乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸的積累，從而誘導(dǎo)了?；っ负王；姿徂D(zhuǎn)移酶的合成，提高了短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化成?；鵆oA 的效率，為螺旋霉素合成提供更多的直接前體物質(zhì)，同時(shí)丙三醇的添加提高了發(fā)酵前期Ⅰ型聚酮合酶亞單元合成基因srm10 的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)酰基單元縮合成聚酮類內(nèi)酯環(huán)起促進(jìn)作用，從而增加內(nèi)酯環(huán)的合成。

螺旋霉素內(nèi)酯環(huán)本身沒有抑菌活性，已合成的內(nèi)酯環(huán)還需在酶的催化作用下進(jìn)行一系列的后修飾步驟才能形成具有抑菌活性的螺旋霉素分子，其中糖基是活化內(nèi)酯環(huán)的關(guān)鍵基團(tuán)，在抑菌方面發(fā)揮重要作用[22]。后修飾過程中，糖基的錯(cuò)配和缺失都會(huì)導(dǎo)致相關(guān)雜質(zhì)的產(chǎn)生。其中雜質(zhì)D 的產(chǎn)生與福洛氨糖和碳霉糖的不均一合成有關(guān)，當(dāng)C-9 位的福洛氨糖被碳霉糖取代后形成雜質(zhì)D[12]。srm20 和srm33 分別是福洛氨糖和碳霉糖合成途徑上的基因，對(duì)兩種糖基的合成起重要作用[13-14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加丙三醇能使得發(fā)酵72 h 左右的srm20 和srm33 基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅提高，且對(duì)srm20 的促進(jìn)作用更大，進(jìn)而促進(jìn)了福洛氨糖對(duì)碳霉糖相對(duì)合成比例的增加，導(dǎo)致雜質(zhì)D 組分的含量下降。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后雜質(zhì)D 組分含量的進(jìn)一步降低提供了新的思路，萬俊仙等[23]已通過過表達(dá)半胱氨酸合成途徑中兩個(gè)限速酶基因，提高了細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸水平。我們可以通過基因工程改造的辦法提高srm20 基因表達(dá)，或降低srm33 的基因表達(dá)，降低雜質(zhì)D 含量，提高螺旋霉素I 的品質(zhì)。