郭潔心，馬超，朱洪磊，張寶俊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

芽孢桿菌具有抗逆能力強(qiáng)、抑菌活性高、促進(jìn)植物生長等特性，是植物病害微生物防治的首選資源。拮抗芽孢桿菌在生長代謝過程中能夠產(chǎn)生多類抗菌物質(zhì)，主要包括由核糖體合成的細(xì)菌素[1](bacteriocin)或拮抗蛋白[2]，由非核糖體合成的脂肽類抗生素[3](lipopeptides antibiotics)或揮發(fā)性物質(zhì)[4]等。其中脂肽類抗菌物質(zhì)是由非核糖體途徑合成的一種小分子物質(zhì)，因具有抑菌廣譜及較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外輻射穩(wěn)定性被廣泛研究。目前已報道的芽孢桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)主要有伊枯草菌素(Iturin A、C和桿菌抗霉素L、D、F等)、表面活性素(Surfactin A、B、C)和豐原素(Fengycin A、B、D和制磷脂菌素)[5～7]等。楊瑞先等[8]研究發(fā)現(xiàn)牡丹內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33產(chǎn)生的脂肽類抗菌物質(zhì)對牡丹灰霉病菌、牡丹炭疽病菌、牡丹黑斑病菌和牡丹黃斑病菌具有良好抑菌效果。

G-1菌株為從丁香樹莖部分離獲得1株植物內(nèi)生細(xì)菌，對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、立枯絲核病菌等多種植物病原真菌具有較好的拮抗作用。本研究擬通過形態(tài)學(xué)觀測及多基因聯(lián)合分析初步明確G-1菌株種屬分類，并通過對其抗菌粗提物的穩(wěn)定性及脂肽類抗生素編碼基因簇分析，探究該菌株代謝物中抗菌物質(zhì)的主要類型，為后續(xù)生防菌制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

內(nèi)生拮抗菌G-1菌株分離自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)丁香樹莖部，由山西省植物內(nèi)生菌服務(wù)共享平臺保藏并提供。病原菌：番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、胡蘿卜腐爛病菌(Ceratocystisfimbriata)、菜豆菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersic)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)和小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)均系山西省綠色生物農(nóng)藥工程技術(shù)中心保存、提供。

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂16 g·L-1，pH 7.0；NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，瓊脂16 g·L-1，pH 7.0；BPY培養(yǎng)液：蛋白胨10 g·L-1，牛肉浸膏5 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，pH 7.0。

1.2 G-1菌株抑菌譜測定

采用平板對峙法，培養(yǎng)9種植物病原菌，在培養(yǎng)的菌落上打取直徑為5 mm的菌餅，分別接種于PDA平板中央，在距菌餅2 cm處取2點接種G-1，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，測定病原菌菌落直徑，計算抑菌率，以只接病原真菌為對照(CK)，3次重復(fù)。

抑菌率/%=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-5 mm)×100

1.3 G-1菌株分類地位鑒定

采用平板劃線法，將拮抗菌株G-1接種于NA培養(yǎng)基上活化24 h后，對其單菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，同時進(jìn)行革蘭氏染色，并利用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征。

采用CTAB法[9，10]提取G-1基因組DNA。以G-1基因組DNA為模板，分別以27F和1492 r、gyrA-F和gyrA-R、gyrB-F和gyrB-R為引物(表1)，建立PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：2×Taq PCR Master MiX 12.5 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，54～56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送于生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將獲得的16SrDNA、gyrA、gyrB測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載近似種的基因序列，利用MEGA5.05軟件進(jìn)行多重序列比對后，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定植物內(nèi)生菌G-1的分類地位。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 G-1代謝物部分物理性質(zhì)測定

采用“酸沉醇提”的方法，從G-1菌株BPY發(fā)酵液中獲得抗菌粗提物，抗菌粗提物用無菌水配制成10 g·L-1的抗菌粗提液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熱穩(wěn)定性測定：分別于40、60、80、100、121 ℃條件下處理抗菌物質(zhì)30 min，采用生長速率法，以番茄灰霉病菌為指示菌測定抑菌活性，分析抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

抑菌率/%=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-5 mm)×100

酸堿穩(wěn)定性測定：分別用1 moL·L-1HCL和1 moL·L-1NaOH將抗菌粗提液分別調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。室溫放置3 h后，再依次調(diào)節(jié)pH至7.0，采用生長速率法測定抗菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性。

紫外輻射穩(wěn)定性測定：將抗菌粗提液于紫外燈15 cm處分別照射2、4、6、8、10、12、24 h，采用生長速率法測定抗菌物質(zhì)對紫外輻射的穩(wěn)定性。

1.5 抗菌肽物質(zhì)PCR驗證

根據(jù)調(diào)控Iturin A、Fengycin A和Surfactin合成的基因分別設(shè)計合成3對特異引物ituA、fenA和srfC，并以菌株G-1基因組DNA為模板，建立PCR擴(kuò)增體系，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌G-1菌株抗真菌譜

平板抑菌試驗表明，G-1菌株對多種植物病原菌都具有較強(qiáng)的抑菌活性(圖1)，抑菌率在69.1%～83.14%之間(表3)。其中，對番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌抑菌效果最好，抑菌率分別為83.14%和81.65%；對灰葡萄孢菌、鏈格孢菌等有較好的抑制效果，但對棉花立枯病菌、小麥赤霉病菌的抑制率為70.78%和69.1%，抑制效果相對較差。

表2 抗菌肽調(diào)控基因的引物序列

表3 G-1菌株對9種病原真菌的抑制作用

1～9分別為菜豆菌核病菌、番茄枯萎病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、桃褐腐病菌、辣椒枯萎病菌、胡蘿卜腐爛病菌、棉花立枯病菌、小麥赤霉病菌1～9 respect Sclerotinia sclerotiorum、Fusarium oxysporum f. sp.Lycopersic、Botrytis cirerea、Alternaria solani、Monilinia fructicola、Ceratocystisfimbriata、Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum、Rhizoctonia solani、Fusarium graminearum圖1 G-1菌株抑菌圖譜Fig.1 The antifungal map of the G-1 strain against pathogenic fungi

2.2 植物內(nèi)生菌G-1分類地位

2.2.1 形態(tài)特征

通過對菌株G-1培養(yǎng)特征的形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)G-1菌株菌落在NA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)乳白色，表面較干燥、菌落中心凸起褶皺，邊緣為鋸齒狀(圖2A)。

光學(xué)及電子顯微觀測表明，菌株G-1為桿狀，大小約20.5～20.6 μm×2.0～2.4 μm，芽孢橢圓形，革蘭氏染色為陽性，初步確定其為芽孢桿菌(圖2)。

2.2.2 多基因聯(lián)合分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，每對引物所擴(kuò)增條帶單一，與預(yù)期片段相符，長度分別約在1500、600、280 bp左右，表明引物的特異性良好，PCR產(chǎn)物質(zhì)量較高。

A：G-1菌落形態(tài)B：染色前芽孢形態(tài) C：染色后芽孢形態(tài) D：G-1掃描電鏡圖A: Colony morphology of G-1 B: predyed spore morphology C: postdyed spore morphology D: G-1 scanning electron microscopy圖2 菌株G-1形態(tài)觀察及掃描電鏡觀察Fig.2 Morphology observation and electron microscopy of strain G-1

圖3 菌株G-1 16SrDNA、gyrA、gyrB擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of the genome of 16SrDNA、gyrA and gyrB by PCR products of strain G-1

將獲得的16SrDNA、gyrA和gyrB序列分別與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中芽孢桿菌屬及其相近種的16SrDNA、gyrA和gyrB序列Blast比對后，發(fā)現(xiàn)與Bacillusamyloliquefaciens、Bacillusmethylotrophicus同源性最高，均可達(dá)到98%以上，以不同芽孢桿菌種的模式菌株為基礎(chǔ)，采用Sequence Matrix軟件，分別將不同芽孢桿菌種的細(xì)菌促旋酶、gyrA部分基因序列、gyrB部分基因序列及16SrDNA 基因序列串聯(lián)，構(gòu)建數(shù)據(jù)集，同質(zhì)性檢驗，采用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：菌株G-1與枯草芽孢桿菌群的多個物種的同源性均高于90%以上，其中與Bacillusmethylotrophicu(KT920452.1)的同源性最高(圖4)，二者聚為一類。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)、16SrDNA基因序列分析結(jié)果，初步將G-1菌株的分類地位鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。

2.3 內(nèi)生菌G-1抗菌物質(zhì)的物理性質(zhì)

G-1抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性如圖5A所示，抗菌物質(zhì)經(jīng)不同溫度處理后，隨著溫度的升高，抑菌活性逐漸降低的趨勢，在121 ℃處理30 min后對番茄灰霉病菌仍保持81.76%的抑菌效率，與對照(25 ℃)的抑菌活性94.3%相比，仍保持86.7%的活性，表明菌株G-1產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定較好。

在pH 2～12處理條件下，G-1菌株均有較好的抑菌活性，其對番茄灰霉病菌的抑菌活性在81.37%～93.81%之間。在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下，抑菌活性有所下降，在pH為12處理后，依然保持81.37%的抑菌活性(圖5B)，與對照相比下降13.26%。

菌株G-1經(jīng)過不同時間紫外輻射后其抑菌活性較穩(wěn)定，下降幅度較小，即使紫外照射24 h后，其抑菌活性仍然能達(dá)到85.68%(圖5C)、表明菌株G-1抗菌物質(zhì)具有較好的抗紫外輻射的能力。

2.4 抗菌脂肽調(diào)控基因的PCR分析

擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示：所擴(kuò)增得到目的片段單一、條帶清晰，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段相符，擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步表明，菌株G-1具有分泌代謝ituA、fenA和srfC的能力。因此表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌G-1主要抗菌物質(zhì)為抗菌脂肽。

3 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌菌群是一類表型相似產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，現(xiàn)已報道的有10多個近緣種，其16SrDNA序列相似度可達(dá)99%以上，因此芽孢桿菌的分子鑒定中須結(jié)合其保守的功能基因如gyrA、rpoB、purH、polC、groEL等才能明確到種[11]。Yu G H等[12]利用16S rDNA結(jié)合gyrA和gyrB基因?qū)⑸姥挎邨U菌R31快速鑒定為枯草芽孢桿菌。Yuji Kubo等[13]結(jié)合rpoB、purH、gyrA、groEL等基因進(jìn)行多位點核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析，成功鑒定出多株枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。本文利用形態(tài)觀察、16SrDNA與gyrA、gyrB多基因聯(lián)合分析將該菌株的分類地位初步鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

圖4 基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因數(shù)據(jù)集構(gòu)建的G-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic trees based on datasets of the concatenated sequences of 16SrDNA,gyrA,and gyrB genes

圖5 G-1菌株抗菌物質(zhì)部分理化性質(zhì)Fig.5 Inhibitory activity of crude extract of G-1 responding to different environmental condition

圖6 菌株G-1 ituA、FenA和srfC擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of the genome of ituA,FenA and srfC by PCR products of strain G-1

同時，針對芽孢桿菌幾種代表性脂肽的合成酶基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，推測G-1菌株生物合成抗菌物質(zhì)的潛在類型。特異引物擴(kuò)增分析表明，G-1菌株具有分泌代謝ituA、fenA和srfC的能力，這與曲曉旭[14]芽孢桿菌產(chǎn)抗菌脂肽調(diào)控基因的檢測方法相似。脂肽類抗菌物質(zhì)普遍具有較好的熱穩(wěn)定和抗酸堿和紫外輻照能力。黃華毅等[15]試驗表明枯草芽孢桿菌STO-12的脂肽類物質(zhì)在高溫處理、強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理及紫外線處理下，其抑菌活性保持一定的穩(wěn)定性。灑榮波[16]從楊樹內(nèi)生拮抗菌N6-34中分離純化出一種活性組分Fengycin，其對溫度、酸性、紫外線照射、水解蛋白酶等條件穩(wěn)定。本試驗測定結(jié)果表明，G-1菌株不但抑菌活性高，抗菌譜廣，而且其抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性也較好，表明菌株G-1為1株具有開發(fā)潛力的拮抗菌株。后續(xù)可對其不同脂肽類抗菌物質(zhì)進(jìn)行抑菌活性測定，進(jìn)而明確哪一類脂肽類物質(zhì)起主要抑菌作用，為拮抗菌的快速篩選及生防菌制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。