DTA-6 對(duì)甜葉菊形態(tài)建成、酶活性、產(chǎn)量及品質(zhì)的影響

馮勝杰，王新欣，賈鵬宇，王詩(shī)雅，盧潔春，左官?gòu)?qiáng)，劉雅，黃文婷，馮乃杰，2，鄭殿峰，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319；2.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院；3.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心）

甜葉菊（Bertoni）是菊科的多年生草本植物。在巴拉圭(和巴西)，甜葉菊的葉子自幾百年前就被當(dāng)?shù)厝朔Q為“甜食”[1-3]，其主要用作茶、藥品等的添加劑。存在于葉子中的甜菊醇糖苷作為主要次級(jí)代謝物是甜葉菊葉片甜度的基礎(chǔ)，并且是甜味劑的重要成分。此外，甜菊甙和杜克糖甙也是甜葉菊的次級(jí)代謝物，但其含量低于甜菊醇糖苷[4-6]。甜菊甙是甜葉菊干葉中主要的甜味成分（4.13%），而其他重要的化合物為:甜菊雙糖甙，瑞鮑迪甙A（2.4%），B，C（1.2%），D，E，F(xiàn) 和杜克甙A（0.3%）。瑞鮑迪甙A/甜菊醇糖苷比率被認(rèn)為是一個(gè)很好的反映甜味的品質(zhì)指標(biāo)。甜菊甙是一種高甜度、低熱值的非發(fā)酵性天然甜味劑，其甜度為蔗糖的200～300 倍，而熱量只有蔗糖的1/300，提取于菊科宿根多年生草本植物的甜葉菊莖葉中。甜葉菊葉片中的各種次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成在開(kāi)花以后會(huì)顯著降低，因此為了獲得更高含量的甜菊醇糖苷，甜葉菊需要在開(kāi)花前收獲葉片[7]。甜菊甙是一種新型糖源，具有重要的保健功能，如促進(jìn)新陳代謝、強(qiáng)壯身體和降低血壓等，目前在食品、醫(yī)療、日用品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。S.Gregersen[10]研究表明在甜葉菊葉的各時(shí)期發(fā)現(xiàn)了濃度不同的有甜味的化合物甜菊醇糖苷。在對(duì)甜葉菊研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了甜菊甙活性以及幾種酶活性。Bailey 和McHargue[11]研究表明番茄果實(shí)和葉片中過(guò)氧化物酶活性隨著葉齡的增加而增加，在衰老過(guò)程中活性逐漸下降。有研究表明[12-14]，應(yīng)用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可控制植株的生長(zhǎng)發(fā)育，改善植株的光合作用，調(diào)控植物的生理代謝功能以及提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。張明才等[15]研究表明，DTA-6[16-17]可提高花生器官的生理代謝功能，增加花生產(chǎn)量，改善花生品質(zhì)。目前大多數(shù)研究主要針對(duì)甜菊醇糖苷提純方面做出了研究，而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在甜葉菊栽培中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究引入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑DTA-6 并開(kāi)展了其作用效果和機(jī)理研究。試驗(yàn)在大田條件下，探討調(diào)節(jié)劑DTA-6 調(diào)控甜葉菊形態(tài)建成，生理代謝及甜葉菊產(chǎn)量品質(zhì)的作用機(jī)理，進(jìn)而為調(diào)節(jié)劑DTA-6 在甜葉菊上的應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)品種

供試品種為惠農(nóng)3 號(hào)，黑龍江省海林市海林農(nóng)場(chǎng)的主栽品種。

1.1.2 試驗(yàn)地基本情況

試驗(yàn)田地位于黑龍江省海林市海林農(nóng)場(chǎng)第五作業(yè)區(qū)（東經(jīng)128°47′30″～129°7′30″，北緯44°15′～44°25′），試驗(yàn)地氣候?yàn)榇箨懶约撅L(fēng)氣候，土質(zhì)以崗地白漿土為主，有機(jī)質(zhì)含量27 g·kg-1，含氮為98 mg·kg-1，全磷為94 mg·kg-1，含水解氮為58.8 mg·kg-1，有效磷為15 mg·kg-1。年平均≥10 ℃活動(dòng)積溫2 500 ℃左右，無(wú)霜期136 d 左右，年降水量530～550 mm。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用大田試驗(yàn)方法，隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2-N，N-二乙氨基乙基己酸酯（DTA-6）進(jìn)行葉面噴施處理，濃度分別為12.5 mg·L-1（D12.5）、60 mg·L-1（D60）、300 mg·L-1（D300），以葉面噴施清水為對(duì)照（DCK）。試驗(yàn)設(shè)置四次重復(fù)，于8 月15 日（移栽后75 d）進(jìn)行葉面噴施。小區(qū)為6 行區(qū)，壟寬0.65 m，行長(zhǎng)8 m，小區(qū)面積為31.2 m2，區(qū)間過(guò)道1 m，共16 個(gè)小區(qū)。于5 月25 日移栽大田，每公頃的保苗株數(shù)在18 萬(wàn)株。田間作業(yè)均同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)生產(chǎn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 取樣及測(cè)定方法

（1）形態(tài)指標(biāo)測(cè)定：于8 月20 日、9 月7 日、9 月22 日（分別為移栽后80、98、113 d）進(jìn)行取樣，每個(gè)處理選取大小長(zhǎng)勢(shì)一致的植株4 株，測(cè)量株高、莖粗后，按莖、葉分樣，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后分別稱其干物質(zhì)量。

（2）生理指標(biāo)測(cè)定：采取植株倒5 葉片，在液氮中速凍30 min，置于-40 ℃低溫冰箱中貯存。

（3）產(chǎn)量的測(cè)定：在9 月22 日進(jìn)行收獲測(cè)產(chǎn)，在每試驗(yàn)小區(qū)取1 m2進(jìn)行測(cè)產(chǎn)，放在室內(nèi)陰干脫葉后進(jìn)行甜葉菊干葉稱重。

1.3.2 酶液提取方法

過(guò)氧化物（POD）酶活性的提取和測(cè)定采用Sigma 法[18]測(cè)定。已知量的新鮮甜菊葉在預(yù)冷的研缽中研磨并在50 mmol·L-1預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿。轉(zhuǎn)入離心管中在4 ℃、12 000 g、20 min 的條件下進(jìn)行離心，取出上清液即為酶粗提液，用于過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定。

多酚氧化（PPO）酶活性的提取和測(cè)定方法是根據(jù)曹建康等[19]編著的《果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》測(cè)定。已知量的新鮮甜菊葉在預(yù)冷的研缽中研磨并在含有4% PVPP、1 mmol PEG 和1%TritonX-100 的已知濃度的提取緩沖液中研磨。轉(zhuǎn)入離心管中在4 ℃、12 000 g、20 min 的條件下進(jìn)行離心，取出上清夜即為酶粗提液，用于多酚氧化酶活性的測(cè)定。

1.3.3 酶活性測(cè)定

過(guò)氧化物酶活性，反應(yīng)混合物含有在0.2 M 磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中的愈創(chuàng)木酚，30%H2O2和40 μL酶提取物。通過(guò)加入相應(yīng)的酶開(kāi)始反應(yīng)。氧化染料的顏色變化在30 s 的時(shí)間間隔在470 nm 讀取1 min，重復(fù)4 次。過(guò)氧化物酶活性單位為u·g-1FW。

多酚氧化酶的活性，反應(yīng)混合物含有50 mmol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH5.5）、鄰苯二酚溶液和50 μL酶提取物。將內(nèi)容物混合并立即開(kāi)始計(jì)時(shí)。將反應(yīng)混合液倒入比色杯中，置于分光光度計(jì)樣品室中。以蒸餾水為參比，在反應(yīng)15 s 時(shí)開(kāi)始記錄反應(yīng)體系在波長(zhǎng)420 nm 處吸光度值，作為初始值，然后每隔1 min記錄一次，連續(xù)測(cè)定，至少獲取6 個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，重復(fù)4次。多酚氧化酶活性單位為ΔOD420/min·g-1。

1.3.4 瑞鮑迪甙A 和甜菊糖苷的提取及測(cè)定

酶液提?。悍Q取1 g 干樣葉片粉末，加入8 mL 熱水，混勻后進(jìn)行30 min 超聲處理，離心4 000 g，15 min，4 ℃進(jìn)行離心，取上清液，重復(fù)3 次。3 次上清液混合均勻待用，進(jìn)行色譜分析。

檢測(cè)方法：通過(guò)使用安捷倫1 200 型液相色譜儀進(jìn)行液相色譜分析，采用XDB-NH3（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，流動(dòng)相采用等度洗脫模式，流動(dòng)相乙腈/水組成比為80∶20（v/v），檢測(cè)器為紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析采用了SPSS22.0，顯著性和極顯著性的檢驗(yàn)采用Duncan’s 新復(fù)極差法，數(shù)據(jù)整理與圖表的繪制是通過(guò)Microsoft Office EXCEL2010 進(jìn)行繪制完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施DTA-6 對(duì)甜葉菊形態(tài)建成的影響

如表1 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期，株高逐漸增加。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5 的處理與CK 相比株高極顯著升高，而其他處理則與CK 相比株高無(wú)明顯差異；在9 月7 日，各處理與CK 相比株高并無(wú)顯著變化；在9 月22 日，D60 比CK 株高顯著升高，而其他處理則與CK 相比株高無(wú)明顯差異。

表1 葉噴DTA-6 處理對(duì)株高的影響Table 1 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on plant height

如表2 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期，莖粗逐漸增粗。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5 的處理與CK 相比株高極顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗無(wú)明顯差異；在9 月7 日，D12.5 的處理與CK 相比株高顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗均無(wú)顯著差異。在9 月22 日，D12.5 比CK 株高顯著增粗，而其他處理則與CK 相比莖粗無(wú)明顯差異。

表2 葉噴DTA-6 處理對(duì)莖粗的影響Table 2 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on stem diameter

如表3 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期，分枝數(shù)逐漸增加。其中在8 月20 日，葉面噴施D12.5、D300 處理與CK相比分枝數(shù)均極顯著增加，而D60 處理則與CK 相比無(wú)明顯差異；在9 月7 日，各處理與CK 相比分枝數(shù)均無(wú)顯著差異；在9 月22 日，D12.5 處理與CK 相比分枝數(shù)顯著增加，D60 處理與CK 相比分枝數(shù)極顯著增加。

表3 葉噴DTA-6 處理對(duì)分枝數(shù)的影響Table 3 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on number of branches

如表4 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期，單株莖重逐漸增加。其中在8 月20 日與9 月7 日，各處理則與CK 相比單株莖重均無(wú)明顯差異；在9 月22 日，D60 處理與CK 相比單株莖重顯著增加，而其他處理與CK 相比均沒(méi)有顯著變化。

表4 葉噴DTA-6 處理對(duì)單株莖重的影響Table 4 Effect of leaf spray DTA-6 treatment on stem weight

如表5 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期中，除在9 月7 日調(diào)查時(shí)D12.5 處理與CK 相比降低，其余各處理與CK相比均增加，但均沒(méi)有達(dá)到顯著水平。

表5 葉噴DTA-6 處理對(duì)單株葉重的影響Table 5 Effect of leaf DTA-6 spray treatment on leaf weight per plant

2.2 噴施DTA-6 對(duì)葉片中過(guò)氧化物酶活性的影響

隨著甜葉菊的抗逆性的增加，過(guò)氧化酶活性逐漸降低。噴施調(diào)節(jié)劑DTA-6 后，各處理的過(guò)氧化物酶活性均有變化。如圖1 所示，過(guò)氧化物酶活性變化為在整個(gè)生長(zhǎng)期中，氧化物酶（POD）活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中在8 月20 日，各處理中過(guò)氧化物酶活性與CK 相比顯著提高，并且均達(dá)到極顯著水平；在9 月7 日，各處理中過(guò)氧化物酶活性與CK 相比顯著提高，并且均達(dá)到極顯著水平；在9 月22 日，噴施D12.5 的處理與CK 相比過(guò)氧化物酶（POD）活性極顯著增加，噴施D300 處理與對(duì)照相比過(guò)氧化物酶（POD）活性極顯著降低，而噴施D60 的處理與CK相比活性顯著降低。

圖1 噴施DTA-6 對(duì)葉片中過(guò)氧化物酶活性的影響Fig.1 Effect of DTA-6 spray on peroxidase activity in leaves

2.3 噴施DTA-6 對(duì)葉片中多酚氧化酶活性的影響

甜葉菊的抗逆性與多酚氧化酶活性呈負(fù)相關(guān)。噴施調(diào)節(jié)劑DTA-6 后，各處理的多酚氧化酶活性均有變化。如圖2 所示，在整個(gè)生長(zhǎng)期中，氧化物酶（POD）活性變化呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢(shì)。其中在8 月20 日，D12.5、D60 處理與CK 相比多酚氧化酶活性極顯著降低，而D300 處理多酚氧化酶活性降低，但未達(dá)到顯著水平；在9 月7 日與9 月22 日，各處理多酚氧化酶活性與CK 相比均極顯著降低。

圖2 噴施DTA-6 對(duì)葉片中多酚氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of DTA-6 spray on polyphenol oxidase activity in leaves

2.4 噴施DTA-6 對(duì)葉片中瑞鮑迪甙與甜菊苷比值（ReA/ST）的影響

ReA/ST 的比值越高證明甜葉菊品質(zhì)越好。噴施調(diào)節(jié)劑DTA-6 后，各處理的ReA/ST 的比值間具有一定的差異。如圖3 所示，在8 月20 日，D12.5 處理與CK 相比極ReA/ST 顯著提高，而其他處理與CK相比均極顯著降低；在9 月7 日，各處理間葉片中ReA/ST 與CK 相比均極顯著降低；在9 月22 日，各處理間葉片中ReA/ST 與CK 相比均極顯著提高，而D60 處理的ReA/ST 最大。

圖3 噴施DTA-6 對(duì)瑞鮑迪甙與甜菊苷比值的影響Fig.3 Effect of DTA-6 spray on the ratio of rebaudioside and stevioside

2.5 噴施DTA-6 對(duì)甜葉菊產(chǎn)量的影響

根據(jù)表6 可以看出，在收獲測(cè)產(chǎn)時(shí)，各處理于CK 相比均有增加，其中D12.5 處理增加了3.8%；D60 處理增加了11.2%，并且差異達(dá)到了顯著水平；D300 處理增加了8.0%。

表6 噴施DTA-6 對(duì)甜葉菊產(chǎn)量的影響Table 6 Effect of spraying DTA-6 on Stevia yield

3 討論

POD 酶是植物重要的保護(hù)性酶[20-22]，許多植物可以通過(guò)此類酶防御系統(tǒng)來(lái)清除遭受脅迫而產(chǎn)生的活性氧，從而使植物維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育。過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物體中，是一種活性較高的酶。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中過(guò)氧化物酶活性不斷發(fā)生變化。一般表現(xiàn)為老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，所以過(guò)氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)[23-24]。多酚氧化酶（PPO）是呼吸鏈末端氧化酶之一，它參與多酚類物質(zhì)的氧化，在植物植株的防御保護(hù)體系中起重要作用[25-26]。多酚氧化酶也是生物質(zhì)體的自源代謝酶類，能夠長(zhǎng)期維持生物體的生自體次生代謝的平衡[27-28]。甜葉菊整株含有糖苷，以其葉片甜度最高，其安全性早已得到FAO 和WHO 等國(guó)際組織的認(rèn)可，因而甜葉菊醇糖苷已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、肥料以及飼料等行業(yè)[29-30]。有研究發(fā)現(xiàn)[31-32]，在植物的幼嫩組織和器官中轉(zhuǎn)化酶的活性較高，轉(zhuǎn)化酶活性會(huì)隨著組織和器官的成熟而降低。研究指出，葉面噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑DTA-6 可以使甜葉菊葉片中的POD 酶和PPO 酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并且D60 處理達(dá)到極顯著水平，這一結(jié)果與前人研究表現(xiàn)相同，但是關(guān)于調(diào)節(jié)劑DTA-6 具體對(duì)PPO 酶與POD 酶活性的調(diào)控過(guò)程可能還有許多其他因素在起作用，如基因調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物內(nèi)源激素系統(tǒng)的調(diào)控等諸多方面，其有關(guān)機(jī)理尚待深入研究。Saibi 等[33]使小麥中DHN-5 在擬南芥中超表達(dá)，結(jié)果表明，DHN-5 通過(guò)調(diào)控?cái)M南芥中抗氧化酶的活性，增加了過(guò)氧化物酶活性，這與試驗(yàn)的結(jié)果表現(xiàn)有差異，推斷調(diào)節(jié)劑對(duì)甜葉菊的作用可能是多基因共同調(diào)控的結(jié)果，今后還需進(jìn)一步挖掘相關(guān)基因，從而更好地從分子水平揭示化學(xué)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)甜葉菊品質(zhì)及產(chǎn)量建成的調(diào)控機(jī)理。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)葉噴處理，初步篩選出了對(duì)甜葉菊產(chǎn)量提高、品質(zhì)改善有較好效果的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑S3307 濃度為50 mg·L-1，該處理在葉片成熟期降低了甜葉菊葉片中POD 酶和PPO 酶活性，提高了甜葉菊中ReA/ST，增加甜葉菊產(chǎn)量，有利于甜葉菊植株更好地生長(zhǎng)發(fā)育。證明了化學(xué)調(diào)控技術(shù)在對(duì)提高甜葉菊品質(zhì)及其產(chǎn)量方面具有發(fā)展的潛力。