Persisters的研究進(jìn)展及清除策略

康佳寧

摘 要：Persisters是野生型細(xì)菌的一種表型變異，對(duì)抗生素具有高耐受性的休眠的細(xì)胞亞群，通過(guò)減少其新陳代謝并進(jìn)入休眠狀態(tài)從而在抗生素治療中存活下來(lái)，并在抗生素去除后恢復(fù)生長(zhǎng)，是造成抗生素治療頑固性和感染性疾病復(fù)發(fā)的主要原因之一。本文將對(duì)persisters的生物學(xué)特征、產(chǎn)生機(jī)制以及清除策略等內(nèi)容作一綜述。

關(guān)鍵詞：persisters;毒素抗毒素系統(tǒng);抗菌機(jī)制

Persisters這個(gè)概念是1944年都柏林大學(xué)醫(yī)學(xué)博士bigger首次提出的，他在研究青霉素殺死金黃色葡萄球菌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，大部分細(xì)菌都被殺死但總有一小部分細(xì)菌培養(yǎng)物（約占細(xì)菌種群的1%）存活下來(lái)，存活下來(lái)的這部分細(xì)菌可以重新增殖并對(duì)青霉素保持相同的敏感性，為了與傳統(tǒng)意義上的耐藥菌相區(qū)分，他將這部分細(xì)菌命名為“persisters”。與眾所周知的由基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移引起的抗生素耐藥性不同，persisters并沒(méi)有遺傳上的改變，最小抑菌濃度（MIC）不會(huì)增大，這種不發(fā)生任何抗性基因突變、僅以非增殖小亞群形式耐受抗生素的現(xiàn)象稱為“persistence” [1]。Persisters的特點(diǎn)可概括為低活性、多藥耐受、短暫表型性和生長(zhǎng)異質(zhì)性。休眠的persisters不會(huì)影響藥物與相應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合，但由于其低下的代謝活動(dòng)，會(huì)導(dǎo)致抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮殺菌作用，因而具有多種藥物耐受的特性。

1 Persisters的產(chǎn)生機(jī)制

Persisters形成機(jī)制不遵循復(fù)雜細(xì)胞功能的單個(gè)線性調(diào)節(jié)途徑的控制，它的形成機(jī)制比較復(fù)雜，受多種機(jī)制的調(diào)控，既可以自發(fā)隨機(jī)產(chǎn)生，又可以在環(huán)境壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生，目前對(duì)persisters的形成機(jī)制尚無(wú)定論，但普遍認(rèn)為與營(yíng)養(yǎng)限制、抗生素治療、ppGpp（鳥(niǎo)苷四磷酸）調(diào)控、毒素—抗毒素系統(tǒng)（TA系統(tǒng)）、代謝調(diào)節(jié)等有關(guān)系。

1.1? 營(yíng)養(yǎng)限制

微生物在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下生理機(jī)能將發(fā)生相當(dāng)大的變化，這種變化發(fā)生在微生物群體生長(zhǎng)的穩(wěn)定階段。有文獻(xiàn)表明，細(xì)菌培養(yǎng)物在進(jìn)入穩(wěn)定期后開(kāi)始積累persisters細(xì)胞。營(yíng)養(yǎng)饑餓會(huì)觸發(fā)persisters形成，例如，當(dāng)培養(yǎng)基中的氨基酸或氮缺乏，部分細(xì)菌會(huì)進(jìn)入persisters狀態(tài)，導(dǎo)致抗生素治療失效[2]。

1.2ppGpp調(diào)控

鳥(niǎo)苷四磷酸（alarmone guanosinetetraphosphate，PpGpp）作為胞內(nèi)信號(hào)分子，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，是TA 系統(tǒng)的效應(yīng)物質(zhì)，主要參與細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。響應(yīng)特定的壓力，SpoT和RelA被激活以合成核苷酸警報(bào)蛋白ppGpp。增加的ppGpp水平通過(guò)抑制胞外磷酸酶（PPX）導(dǎo)致無(wú)機(jī)多磷酸鹽（PolyP）的積累，降低PolyP。積累的PolyP與Lon蛋白酶優(yōu)先結(jié)合，以裂解抗毒素HipB，導(dǎo)致過(guò)量的毒素HipA。作為回報(bào)，游離的活性毒素HipA通過(guò)其ATP結(jié)合位點(diǎn)Ser239的磷酸化使GltX失活，結(jié)果是不帶電荷的tRNA帶有谷氨酸（tRNAGlu）在細(xì)胞中積累。不帶電荷的tRNAGlu負(fù)載在空的核糖體位點(diǎn)，并觸發(fā)RelA激活更多ppGpp合成，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)形成persisters細(xì)胞[3]。

1.3TA系統(tǒng)

毒素 - 抗毒素系統(tǒng)位于質(zhì)粒上，其編碼能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的毒素蛋白和抵抗毒素的抗毒素。在正常生長(zhǎng)條件下，抗毒素有效地抑制毒素的活性;而在應(yīng)激條件下，抗毒素被選擇性降解，釋放毒素以抑制必需的細(xì)胞過(guò)程，如DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)翻譯，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯。TA系統(tǒng)在細(xì)菌耐藥性和persister形成中發(fā)揮重要作用。目前根據(jù)它們對(duì)應(yīng)的抗毒素的蛋白質(zhì)組性質(zhì)及其不同的調(diào)節(jié)機(jī)制將TA系統(tǒng)分為六類(lèi)，被稱為I-VI型TA系統(tǒng)。在I型和III型TA系統(tǒng)中，抗毒素是非編碼RNA;在II型，IV型，V型和VI型TA系統(tǒng)中，抗毒素是一種蛋白質(zhì)。II型TA系統(tǒng)是目前研究最多的，I型，II型和V型，涉及persister的形成[4]。

I型TA系統(tǒng)具有非編碼RNA抗毒素和蛋白質(zhì)毒素。在這個(gè)系統(tǒng)中，小分子反義RNA（sRNA）與毒素的mRNA堿基配對(duì)以抑制其翻譯。在正常生長(zhǎng)條件下，這種雙鏈體抑制核糖體結(jié)合，并且迅速被RNase III降解。然而，在應(yīng)激條件下，抗毒素sRNA庫(kù)減少，導(dǎo)致現(xiàn)在非雙鏈體毒素mRNA的翻譯。II型TA系統(tǒng)是最大和研究最多的TA系統(tǒng)類(lèi)，在大多數(shù)自由生活細(xì)菌中鑒定出數(shù)千個(gè)II型TA基因座。II型TA系統(tǒng)抗毒素和毒素都是蛋白質(zhì)，抗毒素通常具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)合DNA，另一個(gè)結(jié)合并抑制同源蛋白毒素的活性。毒素和抗毒素兩個(gè)基因的表達(dá)是由TA復(fù)合物在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，該復(fù)合物涉及到啟動(dòng)子區(qū)域與回文序列的結(jié)合（抗毒素和大多數(shù)情況下TA復(fù)合物都結(jié)合TA啟動(dòng)子以抑制轉(zhuǎn)錄。）。在生長(zhǎng)條件下，毒素與抗毒素結(jié)合，后者抑制其活性。在應(yīng)激條件下，活化細(xì)胞蛋白酶如Lon和ClpXP，其優(yōu)先裂解抗毒素，釋放毒素以通過(guò)抑制翻譯或復(fù)制來(lái)抑制生長(zhǎng)。V型系統(tǒng)中，抗毒素（GhoS）是一種RNase（核糖核酸內(nèi)切酶），在生長(zhǎng)條件下裂解毒素（GhoT）mRNA。在應(yīng)激條件下，GhoS的mRNA被II型毒素MqsR降解。

第一個(gè)TA基因座tisAB-istR-1參與了SOS對(duì)DNA損傷的應(yīng)答， 該基因座編碼一個(gè)有毒的基因tisAB和兩個(gè)小RNA，即IstR-1和IstR-2。TisAB受LexA控制，并因此受到SOS反應(yīng)的激活，但只有TisB對(duì)毒性負(fù)責(zé)。 istR-2的轉(zhuǎn)錄也受SOS調(diào)節(jié)，不參與TisB的控制，而抗毒素IstR-1與LexA依賴的啟動(dòng)子結(jié)合，并通過(guò)誘導(dǎo)tisB mRNA的RNase III依賴性切割來(lái)抑制TisB的表達(dá)。在沒(méi)有SOS應(yīng)答的情況下，通過(guò)誘導(dǎo)tisB mRNA的RNase III依賴性切割，將istR-1組成性轉(zhuǎn)錄為滅活TisAB的毒性。當(dāng)環(huán)丙沙星引起DNA損傷時(shí)，它會(huì)激活RecA蛋白，從而導(dǎo)致LexA阻遏物裂解，然后引發(fā)SOS反應(yīng)。控制Lex啟動(dòng)子的抗毒素IstR-1幾乎被完全裂解，而毒素TisB逐漸積累并迅速結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜上，導(dǎo)致膜損傷，質(zhì)子動(dòng)力（pmf）和ATP水平降低。這導(dǎo)致DNA，RNA和蛋白質(zhì)合成的速率降低，并且阻止了細(xì)胞吸收藥物。結(jié)果，生長(zhǎng)減慢并形成了耐多藥的persisters。

1.4代謝調(diào)節(jié)

任何參與細(xì)菌物質(zhì)合成和能量代謝的過(guò)程都可能與persisters形成相關(guān)，其涉及機(jī)制和系統(tǒng)冗繁。Lon 蛋白酶參與大腸埃希菌多種抗毒素蛋白的降解，lon 基因敲除株對(duì)氨芐西林和環(huán)丙沙星的persisters水平都降低，過(guò)表達(dá)Lon 蛋白的野生型細(xì)菌persisters水平明顯升高，然而對(duì)于缺失10 個(gè)編碼mRNA 內(nèi)切酶的TA 基因座的突變株，persisters水平并沒(méi)有明顯變化[5]。營(yíng)養(yǎng)缺乏激活Lon 或Clp 蛋白酶，降解抗毒素蛋白，釋放HipA、RelE 等毒素蛋白。RelE裂解mRNA 或者通過(guò)ppGpp 依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯;HipA 能夠磷酸化谷氨酰- tRNA 合成酶（ glutamyl - tRNA synthetase，Glt X）的293 位絲氨酸并抑制其活性，導(dǎo)致空載glu - tRNA 增加，激活RelA 引起嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，合成ppGpp，導(dǎo)致細(xì)菌停止生長(zhǎng)。

2? 清除策略

研究發(fā)現(xiàn)[6]抗Perpersister化合物根據(jù)其作用機(jī)理，使用不同的策略殺死persisters細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)干擾群體感應(yīng)（M64），SOS響應(yīng)（lexA3 inh。），persisters特定基因，固定相呼吸（NO）和嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)（relacin）來(lái)抑制persisters形成。其他策略包括通過(guò)刺激ROS的產(chǎn)生（Ag +，L-絲氨酸）或刺激細(xì)菌的新陳代謝，從而使persisters細(xì)胞對(duì)抗生素敏感，從而刺激抗生素靶標(biāo)（C10，順式-2-癸烯酸）?；蛘?，可以通過(guò)改變pH梯度（L-精氨酸）和直接刺激氨基糖苷的攝?。↙-絲氨酸，次離子休克，代謝產(chǎn)物）來(lái)增加抗生素的攝取?？梢酝ㄟ^(guò)刺激非特異性蛋白酶活性（ADEP4，拉霉素），DNA交聯(lián)（絲裂霉素C，順鉑）或膜去極化（硼霉素，HT61，NCK-10）來(lái)直接殺死persisters細(xì)胞。直接殺死persisters細(xì)胞的最常見(jiàn)策略是通過(guò)廣泛破壞細(xì)菌膜。

3 展望

由于目前針對(duì)persisters形成機(jī)制研究的目標(biāo)菌主要集中在大腸埃希菌，對(duì)于其他的細(xì)菌持留狀態(tài)研究較少，因此，需要加強(qiáng)對(duì)其他細(xì)菌持留狀態(tài)的研究，以進(jìn)一步明晰不同細(xì)菌的持留機(jī)制是否具有保守性或差異性。尋找轉(zhuǎn)化persisters的藥物是控制慢性感染的關(guān)鍵，未來(lái)我們可以在中藥或者天然化合物中尋找能夠促進(jìn)persisters向藥物敏感狀態(tài)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，根據(jù)persisters產(chǎn)生的機(jī)制尋找藥物有效的作用靶點(diǎn)，也可以嘗試研究聯(lián)合用藥先將persisters轉(zhuǎn)化為抗生素敏感狀態(tài)，再利用抗生素徹底消滅的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bigger JW. Treatment of staphylococcal infections with penicillin. [J].Lancet 1944;244：497-500.

[2]Brown DR.Nitrogen starvation induces persister cell formation in Escheridhia coii.[J].Bacteriol，2019，201（3）：e00622-18.

[3]Rocker A，Meinhart A.Type II toxin：antitoxin systems.More than small selfish entities.Current genetics，2016，62（2）：287-290.

[4]Równicki M，Pieńko T，Czarnecki J，et al.Artificial Activation of Escherichia coli mazEF and hipBA Toxin-Antitoxin Systems by Antisense Peptide Nucleic Acids as an Antibacterial Strategy.Frontiers in microbiology，2018，9：2870.

[5]Maisonneuve E， Shakespeare LJ， Jorgensen MG， et al. Bacterial persistence by RNA endonucleases [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（32）：13206 - 13211.

[6]Conlon BP， Nakayasu ES， Fleck LE， et al. Activated ClpP kills persisters and eradicates a chronic biofilm infection [J]. Nature， 2013， 503（7476）： 365 - 370.

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）