新型支架在軟骨組織工程中的研究進(jìn)展

王哲 李松軍 趙俊延

通信作者簡介：李松軍，主任醫(yī)師、教授，碩士研究生導(dǎo)師。現(xiàn)任遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院骨一科主任，遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)骨科基地主任，外科教研室主任。兼任中國研究型醫(yī)院學(xué)會骨科創(chuàng)傷與轉(zhuǎn)化委員會常委、廣東省醫(yī)學(xué)會創(chuàng)傷骨科分會委員、廣東省醫(yī)師協(xié)會創(chuàng)傷骨科分會委員、貴州省醫(yī)學(xué)會運(yùn)動醫(yī)學(xué)分會委員、珠海市醫(yī)學(xué)會骨科分會副主任委員、珠海市醫(yī)師協(xié)會創(chuàng)傷骨分會副主任委員、珠海市醫(yī)師協(xié)會骨病醫(yī)師分會副主任委員、珠海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會骨科專業(yè)委員會常委等社會職務(wù)。2003年畢業(yè)于遵義醫(yī)學(xué)院獲骨外科碩士學(xué)位。從事骨科臨床、教學(xué)及科研工作多年，對于創(chuàng)傷骨科、關(guān)節(jié)外科及運(yùn)動醫(yī)學(xué)等方面疾病診治經(jīng)驗豐富。近年主持貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金1項，主持珠海市科技計劃基金項目2項。在國內(nèi)外專業(yè)學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

【摘要】 關(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床中司空見慣，由于關(guān)節(jié)軟骨特殊的生理結(jié)構(gòu)，自身修復(fù)能力較差，傳統(tǒng)的治療手段多效果欠佳。如何修復(fù)軟骨損傷成為臨床上較棘手的問題之一，也因此愈發(fā)備受臨床研究者們的關(guān)注。軟骨組織工程使軟骨完全修復(fù)再生成為可能。合適的支架是構(gòu)建組織工程化軟骨的關(guān)鍵，為取得關(guān)節(jié)軟骨最佳的修復(fù)效果，新型組織工程支架的設(shè)計不斷優(yōu)化，多重復(fù)合的仿生支架、納米支架材料、水凝膠支架是當(dāng)下的研究熱點。該文就目前用于軟骨組織工程中新型支架的材料、設(shè)計及特性等的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 軟骨組織工程;新型支架;納米復(fù)合支架;水凝膠支架;關(guān)節(jié)軟骨;軟骨缺損; 修復(fù)

【Abstract】 Articular cartilage injury is common encountered in clinical practice. Due to the special physiological structure of articular cartilage and relatively poor repairing capability， traditional therapeutic methods yield poor effect. How to repair the cartilage injury has become one of the most challenging issues in clinical practice， which has attracted more and more attention from clinicians. Cartilage tissue engineering makes it possible to completely repair and regenerate the injured cartilage. Appropriate scaffolds are the key to construct tissue-engineered cartilage. To obtain the optimal repair effect for articular cartilage， the design of novel tissue-engineered scaffolds should be continually optimized. Multiple composite biomimetic scaffolds， nano-scaffold materials and hydrogel scaffolds are the hotspots in current research. In this article， the research progress on the materials， design and advantages of novel scaffolds for cartilage tissue engineering was reviewed.

【Key words】 Cartilage tissue engineering;New scaffold;Nano-composite scaffold; Hydrogel scaffold;Articular cartilage;Cartilage defect;Repair

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞、Ⅱ型膠原和蛋白多糖等構(gòu)成，緊密結(jié)合于骨面，起緩沖壓力、減少摩擦的作用。創(chuàng)傷、退行性疾病等因素引起的軟骨損傷會導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)疼痛、活動受限，嚴(yán)重可致運(yùn)動功能障礙，從而降低生活質(zhì)量。關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)病率日益增高，Emans等（2010年）提出：在美國每年約有100萬關(guān)節(jié)軟骨損傷患者，其中超過25萬者需要接受手術(shù)治療，這給患者及社會造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，缺乏神經(jīng)支配及血管供給，必須從關(guān)節(jié)液中汲取營養(yǎng)，因此關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力很差，軟骨缺損直徑一旦超過3 mm便很難恢復(fù)原有狀態(tài)。以往的治療手段，如微骨折術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù)、骨膜移植等，尚無法恢復(fù)其原有結(jié)構(gòu)與功能。組織工程化軟骨目前仍是研究熱點，并且已逐步試用于臨床，其為關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)提供了新的生機(jī)。組織工程研究的三大要素包括支架材料、有軟骨分化能力的種子細(xì)胞和細(xì)胞調(diào)節(jié)生長因子。支架材料是種子細(xì)胞和生長因子修復(fù)損傷軟骨的載體，其作用至關(guān)重要。理想的支架應(yīng)符合以下條件：①有良好的生物相容性，可促進(jìn)種子細(xì)胞黏附，對細(xì)胞無毒性作用，不易引發(fā)炎癥反應(yīng);②有良好的生物活性，能維持軟骨細(xì)胞的表型表達(dá);③有良好的生物降解性以利于細(xì)胞增殖;④能為軟骨細(xì)胞生長提供物理環(huán)境及力學(xué)支持;⑤具有疏松多孔的三維結(jié)構(gòu)以便于軟骨細(xì)胞的黏附生長和新陳代謝[1]。

最大程度地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)及成分是軟骨組織工程支架設(shè)計的原則之一[2]。經(jīng)過多年的研究，新型組織工程支架相對以往不斷優(yōu)化，逐漸向多重復(fù)合性、仿生性、水凝膠、納米材料等方向發(fā)展。本文旨在對近年來軟骨組織工程中新型支架的材料、設(shè)計及特性等的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、新型支架材料

1. 天然材料

軟骨組織工程天然衍生支架的生物相容性良好，但同時也存在降解速率較快、機(jī)械性能較差而且來源有限等不足。天然衍生支架的常用材料有膠原、殼聚糖、藻酸鹽、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等。目前許多專家傾向于研究天然材料復(fù)合支架，通過耦合不同種類的材料，將天然支架材料的缺點消弭，同時將其優(yōu)點發(fā)揮到極致。近年來所研究的新型支架多采用膠原、殼聚糖等熱點天然材料[3]。

1.1 膠 原

膠原是一種很有吸引力的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用材料，是哺乳動物組織中最豐富的蛋白質(zhì)，且易生物降解，抗原性低。膠原作為用于修復(fù)組織的生物材料，其主要缺點是降解速度相對較快，機(jī)械性能很快喪失。為了改善這項不足，Thomas等（2007年）設(shè)計研究出一種新型支架材料——由Ⅰ型膠原和羥基磷灰石（HAP）納米顆粒組成的靜電紡納米纖維生物復(fù)合材料支架，結(jié)果表明無機(jī)納米粒子的加入顯著提高支架拉伸強(qiáng)度和彈性模量，戊二醛進(jìn)行膠原的氣相化學(xué)交聯(lián)進(jìn)一步提高了機(jī)械性能。

1.2 殼聚糖

殼聚糖是一種以甲殼素為原料的可生物降解的陽離子氨基多糖，因其結(jié)構(gòu)類似于天然糖胺而被廣泛應(yīng)用于各種組織工程中。殼聚糖的表面具有親水性，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、分化。此外，殼聚糖還具有抗菌活性，具有良好的生物相容性。Suh等（2000年）提出：基于殼聚糖的植入物引起的異物反應(yīng)小，幾乎無纖維包繞。目前殼聚糖在可注射水凝膠支架材料中常見，Jia等[4]將兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（rbSF-MSC）封裝于可注射殼聚糖水凝膠中，探討其修復(fù)兔股骨髁間滑車軟骨的能力。研究證實殼聚糖水凝膠對rbSF-MSC具有良好的生物相容性，體內(nèi)修復(fù)評估表明實驗組修復(fù)軟骨效果明顯優(yōu)于對照組或空白組。這為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了新途徑，具有重大應(yīng)用價值。Yan等（2010年）發(fā)現(xiàn)，殼聚糖-β-甘油磷酸酯-羥乙基纖維素（CH-GP-HEC）水凝膠支架的生物相容性、生物降解性和細(xì)胞相容性均良好，可在生理溫度（37℃）下從溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)樗z，促干細(xì)胞成軟骨分化能力也顯著增強(qiáng)。Fang等[5]研究了一種新型的多孔聚L-谷氨酸/殼聚糖聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）微球，與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行軟骨再生。研究顯示該微球與單純殼聚糖微球比較，更利于軟骨細(xì)胞附著和增殖。體內(nèi)實驗表明該微載體與軟骨細(xì)胞可成功形成軟骨組織，是軟骨組織工程的有效載體。

2. 人工合成材料

人工合成材料的降解速度可控，易于塑形，來源不受限制，物理機(jī)械性能好。但其親水性及生物相容性不如天然支架材料，細(xì)胞黏附性較弱，可出現(xiàn)免疫反應(yīng)、排斥反應(yīng)等。目前新型支架材料研究常將人工合成材料與天然材料等共混制備成復(fù)合材料，以改善材料的生物相容性。常用聚乳酸（PLA）、聚已內(nèi)酯（PCL）、PLA-乙醇酸共聚物（PLGA）等作為人工合成支架材料。

2.1 PCL

PCL在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛，已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床[6]。Malheiro等（2010年）首次報道了PCL/殼聚糖共混纖維的制備及其在組織工程支架中的應(yīng)用。以甲酸/丙酮（70∶30）為溶劑，甲醇為混凝劑，采用濕法紡絲法制備了殼聚糖和PCL共混纖維，其具有結(jié)構(gòu)空間較寬且直徑可控的特性，表面存在微米級粗糙度和孔隙率，有利于細(xì)胞附著。通過評估聚合物之間的相容性，包括紅外光譜成像、殼聚糖玻璃化轉(zhuǎn)變、可控溶脹試樣的動態(tài)力學(xué)分析等，證明PCL/殼聚糖共混纖維可應(yīng)用于軟骨組織工程支架。

2.2 PLGA

PLGA由乳酸和乙醇酸2種單體聚集組成。PLGA的生物相容性和生物可降解性同樣被FDA認(rèn)可，批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。曹豫江[7]采用溶液澆鑄法制備出PLGA-骨形態(tài)發(fā)生蛋白-磷脂復(fù)合物（PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物），結(jié)果顯示磷脂可以增強(qiáng)PLGA和BMP-2的結(jié)合能力，復(fù)合物在細(xì)胞因子的體外緩釋方面有著絕對優(yōu)勢，其體外實驗證實PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化。PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物植入動物模型體內(nèi)后，經(jīng)過長時間觀察（8、12周），實驗組與對照組之間細(xì)胞的黏附、增殖和分化有顯著差異。研究表明PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物能為軟骨組織工程提供一種新型的生物材料。Kim等[8]專門為兔子的全厚度軟骨缺損設(shè)計了載有BMP-7纖維狀PLGA支架，支架為滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synMSC）的生長和宿主整合提供了有效的微環(huán)境，synMSC與BMP-7實現(xiàn)協(xié)同治療效果。電噴霧到支架上的BMP-7負(fù)載PLGA納米粒子在2周內(nèi)持續(xù)釋放BMP-7，以符合其在刺激早期軟骨內(nèi)骨化的作用。支架載有的synMSC與BMP-7的聯(lián)合給藥可導(dǎo)致高蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的誘導(dǎo)，并形成透明軟骨。Wang等（2010年）設(shè)計了由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）、編碼轉(zhuǎn)化生長因子-β1（PDNA-TGF-β1）的質(zhì)粒DNA、纖維蛋白凝膠和PLGA海綿組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)。為提高基因轉(zhuǎn)染效率，以陽離子化殼聚糖衍生物N，N-三甲基殼聚糖氯化物（TMC）為載體。TGF-β1在體內(nèi)4周時表達(dá)與2周時比較有顯著性差異（P < 0.01）。植入12周后，實驗組成功修復(fù)軟骨缺損，新軟骨與周圍組織及軟骨下組織結(jié)合良好。免疫組織化學(xué)檢查（免疫組化）和糖胺聚糖染色證實再生軟骨中Ⅱ型膠原的數(shù)量和分布與透明軟骨相似。因此，將PLGA海綿/纖維蛋白凝膠支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和基因治療相結(jié)合是修復(fù)軟骨缺損的有效方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

二、新型支架設(shè)計及特性

1. 可注射水凝膠支架

水凝膠是一種通過物理相互作用或共價鍵交聯(lián)的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的親水性聚合物，能夠吸收大量水分而溶脹，并在溶脹之后能夠繼續(xù)保持其原有結(jié)構(gòu)而不被溶解?？勺⑸渌z由于其物理性質(zhì)類似于天然的細(xì)胞外基質(zhì)和可通過微創(chuàng)注射的特點而受到了廣泛關(guān)注[9]。過去10年間涌現(xiàn)出了大量具有光敏、溫敏、因子緩釋功能的新型水凝膠材料。

1.1 水凝膠的易塑形性

溫敏水凝膠在軟骨組織工程中有許多優(yōu)點：①種子細(xì)胞容易嵌入凝膠中;②溫敏水凝膠能填補(bǔ)不規(guī)則軟骨缺損，防止前體溶液的不良擴(kuò)散;③在溫和的生理條件下引發(fā)凝膠化，與其他注射水凝膠相比更便捷[10]。Mellati等[11]研制了一種熱敏水凝膠殼聚糖-g-聚N-異丙基丙烯酰胺（CS-g-PNIPAAm）作為間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）載體，并為其增殖和分化提供支持。生化分析顯示，培養(yǎng)28 d后，包封在合成的水凝膠中的MSC的糖胺聚糖的分泌增加了6倍，總膠原分泌增加了7倍。其組織學(xué)和免疫組化鑒定證實了軟骨細(xì)胞的分化。研究結(jié)果表明，載有細(xì)胞的三維熱敏水凝膠是創(chuàng)造仿生結(jié)構(gòu)的一個很有前景的途徑。Liu等[12]研發(fā)了一種新型可注射的熱敏羧甲基幾丁質(zhì)（CMCH）水凝膠，所得的CMCH溶液為透明液體，在低溫下易流動，并在37℃下迅速凝膠化。通過改變溫度和羧甲基化程度，可以輕易地調(diào)節(jié)CMCH水凝膠的膠凝時間，有利于室溫下的細(xì)胞封裝，在人體溫度下原位形成水凝膠。此外，磷酸鹽緩沖液中的CMCH水凝膠保持穩(wěn)定和連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)，在溶菌酶或透明質(zhì)酸酶存在下可降解。CMCH水凝膠的小鼠體內(nèi)研究顯示良好的原位凝膠形成和組織生物相容性。因此，可生物降解的熱敏可注射水凝膠在生物醫(yī)學(xué)中具有巨大的應(yīng)用潛力。

1.2 水凝膠的彈性及孔隙率

理想的可注射性支架應(yīng)具有良好的流動性及生物相容性，適合種子細(xì)胞生長，并且具有一定力學(xué)強(qiáng)度、具備合適的孔隙率。然而，力學(xué)特性及孔隙率是水凝膠支架的短板。尹合勇等[13]通過將負(fù)載軟骨細(xì)胞的Cytodext-3微載體與藻酸鈉水凝膠復(fù)合制備得到可注射性Cytodext-3微載體/藻酸鈉水凝膠復(fù)合支架，復(fù)合微載體的水凝膠支架的楊氏彈性模量高于藻酸鈉水凝膠支架。證明微載體的加入可以改善水凝膠復(fù)合體的力學(xué)性能，軟骨細(xì)胞在復(fù)合體中能保持更高的活性。Abbadessa等[14]則運(yùn)用近年來熱門的3D打印技術(shù)設(shè)計一種基于甲基丙烯酸硫酸軟骨素和熱敏性高聚化合物的水凝膠支架，實驗證實該支架包埋的軟骨細(xì)胞在6 d的培養(yǎng)期內(nèi)保持活力并增殖，3D打印技術(shù)的融入使水凝膠支架具有可調(diào)控的孔隙率及更好的塑形性。

2. 納米復(fù)合支架

隨著納米技術(shù)迅速發(fā)展，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的納米材料多種多樣。納米顆粒具有較大的比表面積，能增強(qiáng)界面作用、提高材料的力學(xué)性能、增加蛋白吸附能力和生物活性，同時其具有較高的化學(xué)活性，可高效傳遞生長因子[15]。Engler等（2006年）提出：天然干細(xì)胞微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)具有特定的力學(xué)性質(zhì)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)支架材料的硬度和彈性模量接近某種天然機(jī)體組織時，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向該方向分化。納米復(fù)合材料的出現(xiàn)有效解決了水凝膠等仿生支架機(jī)械強(qiáng)度弱的問題。納米復(fù)合支架可以模擬軟骨結(jié)構(gòu)和生物特性，在保證生物活性的同時，提高細(xì)胞的黏附能力。多孔的納米纖維支架材料為軟骨內(nèi)膜細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用提供了適宜的微環(huán)境[16]。

2.1 納米纖維高孔隙率

三維納米纖維支架材料的制備過程多采用靜電紡絲技術(shù)。Xu等[17]以創(chuàng)新、便捷的方式成功制備了電紡絲PCL三維納米支架。通過熱誘導(dǎo)納米粒子自團(tuán)聚，然后冷凍干燥，形成具有相互連接、層次分明的孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙大小可達(dá)300 μm左右。新型PCL三維支架柔軟且有彈性，孔隙率可達(dá)96.4%，其形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于自然細(xì)胞外基質(zhì)，非常適合細(xì)胞生長和組織形成。其體外研究表明，該支架具有較高的細(xì)胞活力，能夠促進(jìn)BMP-2誘導(dǎo)軟骨形成。體內(nèi)結(jié)果相似，證明納米纖維支架可作為促進(jìn)骨與軟骨再生的支撐環(huán)境。

2.2 納米微球緩釋細(xì)胞因子

納米支架對于細(xì)胞因子緩釋作用亦有幫助。訾云鵬等（2017年）提出以Kartogenin作為促成軟骨分化的細(xì)胞因子，制備負(fù)載Kartogenin的納米HAP/殼聚糖支架，實驗證實該納米微球支架可以在1個月內(nèi)穩(wěn)定釋放Kartogenin，起到緩釋作用。與此相似，Sun等[18]研究人脂肪源性干細(xì)胞（HADSC）和TGF-β3微球聯(lián)合應(yīng)用對關(guān)節(jié)軟骨再生的促進(jìn)作用，其包封率試驗表明，（73.8±2.9）%的TGF-β3被包裹在微球中，其持續(xù)釋放了至少30 d，并且通過動物實驗證明納米微球?qū)τ谲浌墙M織再生起促進(jìn)作用。

2.3 納米支架提高機(jī)械性能

以天然聚合物為基礎(chǔ)的水凝膠體系具有良好的生物相容性和生物降解性，但其無足夠的機(jī)械強(qiáng)度來支撐。不同的金屬和非有機(jī)納米粒子已被用來提高水凝膠納米復(fù)合材料的力學(xué)性能[19]。這些納米顆粒包括石墨烯氧化物、石墨烯、nHA、磷酸鈣、碳納米管和生物活性玻璃[20]。對于新型納米材料“量子點”，有研究顯示膠原與量子點交聯(lián)后成膠速度變快，生物相容性好，溶脹率降低，顯著提高了材料力學(xué)性能和抗降解能力，具有促進(jìn)干細(xì)胞的成軟骨分化能力，并且可抑制纖維軟骨的形成，最終新生軟骨呈現(xiàn)透明軟骨形態(tài)。Liu等（2011年）報道了由星形可降解聚合物（星型聚乳酸）自組裝而成的納米纖維中空微球作為一種可注射的細(xì)胞載體，高度多孔的納米纖維中空微球?qū)⒛M細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與注射形式結(jié)合在一起，可以提高支架的機(jī)械強(qiáng)度，同時有效地容納細(xì)胞并增強(qiáng)細(xì)胞增殖再生能力。研究表明可注射納米纖維中空微球是一種優(yōu)良的軟骨細(xì)胞微載體，能為促進(jìn)高質(zhì)量的透明軟骨再生提供新思路。

三、展 望

關(guān)節(jié)軟骨損傷使全世界數(shù)百萬患者遭受嚴(yán)重病痛折磨，對社會產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。經(jīng)過多年來的不斷努力，軟骨組織工程研究取得了許多令人矚目的進(jìn)展，新型支架比以往更具優(yōu)勢。越來越多的研究表明，支架的力學(xué)性質(zhì)、三維結(jié)構(gòu)、多孔性質(zhì)對細(xì)胞表型行為有著顯著影響。此外，仿生傳遞基質(zhì)的設(shè)計必須使其在結(jié)構(gòu)上類似于納米級的天然組織，復(fù)合支架的設(shè)計有助于改善界面性能。由納米復(fù)合材料制成的支架可以滿足軟骨修復(fù)過程多種不同的要求。納米技術(shù)是軟骨組織工程的一項創(chuàng)新進(jìn)展，有可能開創(chuàng)生物醫(yī)學(xué)工程的一個新時代。然而，諸多問題仍丞待解決，包括：如何使材料及制備過程更加高效、經(jīng)濟(jì)以便于結(jié)合臨床;如何真正實現(xiàn)組織工程軟骨與周圍組織的有機(jī)整合;如何使組織工程軟骨植入后不僅能提供即時的力學(xué)支撐，而且還能確保長期承重等。雖然目前臨床中無明確可靠的方法來治愈軟骨缺損，但新型支架等研究成果不斷涌現(xiàn)為軟骨組織工程的進(jìn)展奠定了基礎(chǔ)，為軟骨損傷患者帶來了曙光。

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（收稿日期：2019-10-29）

（本文編輯：洪悅民）