植物乳桿菌低脂契達干酪降膽固醇活性的研究

王海霞 曲秀偉 劉 璐 李曉東 張秀秀 趙銘琪

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

添加益生菌的干酪除具有營養(yǎng)豐富、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味獨特等傳統(tǒng)干酪的特性[1]外，還具有自身獨有的益生特性，通過篩選特殊功能性的益生菌能開發(fā)出具有抗氧化、降膽固醇、降血壓等功能性的干酪[2]。近年來，隨著消費者膳食營養(yǎng)健康意識的提高，低脂干酪需求增加，相比全脂干酪，降低原料乳脂肪會影響干酪的硬度、彈性、質(zhì)地及風(fēng)味，可通過改進工藝來克服這些缺陷。研究發(fā)現(xiàn)益生菌作為輔助發(fā)酵劑，通過蛋白降解及產(chǎn)生多糖類物質(zhì)來改善干酪的風(fēng)味、組織狀態(tài)及口感[3]。添加脂肪替代物可以改善低脂干酪的品質(zhì)，例如，菊粉是一類碳水化合物的脂肪替代物，在干酪中模擬乳脂肪來改善低脂干酪的質(zhì)地、熔化特性及感官特性[4]。

高膽固醇血癥會引起冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病[5]，降低血清膽固醇可有效防止心血管疾病的發(fā)生。目前主要是依靠藥物降解血清膽固醇，存在副作用且價格昂貴。通過非藥物途徑降低血清膽固醇成為研究熱點?，F(xiàn)有動物和人體試驗表明，食用益生菌或其制品有助于降低體內(nèi)血清膽固醇。ALALIN等[6]研究發(fā)現(xiàn)灌喂含嗜酸乳桿菌的酸乳能顯著降低小鼠血清TC和LDL-C濃度。Xiao等[7]對年齡在28～60歲的32名成年男性進行研究，發(fā)現(xiàn)每天飲用300 g含108CFU/g長雙歧桿菌的低脂酸奶4周后，能顯著降低中度高膽固醇血癥患者（血清總膽固醇＞240 mg/dL）的血清膽固醇水平。目前益生菌體內(nèi)降膽固醇機制尚未明確。以低脂干酪為載體，在降低脂肪攝入量的同時，如何更好地發(fā)揮益生菌體內(nèi)降膽固醇活性還有待探究。

本實驗室工作人員自主分離鑒定出1株具有體外降膽固醇活性及良好的胃、腸道耐受性的植物乳桿菌KLDS 1.0320，將其作為益生菌添加到低脂契達干酪中，選取干酪發(fā)酵劑接種量、植物乳桿菌添加量及脂肪替代物菊粉添加量設(shè)計單因素試驗，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化干酪關(guān)鍵工藝參數(shù)；建立高脂動物模型，研究干酪對體內(nèi)膽固醇的調(diào)節(jié)作用，為開發(fā)新型具有降膽固醇活性的益生菌乳制品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗動物及飼料：雄性昆明小鼠48只，體質(zhì)量為（20±2）g，6周齡。高脂飼料：5%蔗糖，1%膽固醇，0.2%膽鹽，10%豬油，83.8%基礎(chǔ)飼料。

菌株來源：植物乳桿菌KLDS 1.0320由實驗室自主分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品（前期試驗已驗證其具有體外降膽固醇活性），保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點實驗室。

主要試劑：直投式商業(yè)發(fā)酵劑、凝乳酶Stamix 1150，科漢森公司贈送；菊粉，豐瑞生物科技；MRS固體培養(yǎng)基，上海莼試生物技術(shù)有限公司；TC、TG、HDL-C測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FUT-1800紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3k15離心機，德國Sigma公司；奶油分離機，廣州富一液體分離技術(shù)有限公司；。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的活化 根據(jù)宋曉辰[8]的方法活化菌種。

1.3.2 植物乳桿菌輔助發(fā)酵劑及干酪的制備菌株活化兩代，按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種到60 mL 12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的滅菌脫脂乳中，培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)兩代至活菌數(shù)在109CFU/mL，添加于干酪中。

干酪的制作[9]：原料乳→脂乳（脂肪含量1.0%）→菊粉→巴氏滅菌（63～65℃，30min）→降至34℃→發(fā)酵劑及益生菌→氯化鈣（0.02%）→凝乳酶（0.003%，1 h）→切割→靜置30min→加熱攪拌→排乳清→瀝干→拌鹽（1%）→成型壓榨→包裝→儲藏（4℃），重復(fù)3次試驗。

干酪水溶性提取液的制備：分別取不同干酪30 g加到90mL生理鹽水中，均質(zhì)2min后，用20~25μm定性濾紙過濾，得到干酪水溶性提取液。

1.3.3 干酪體外降膽固醇作用的測定 干酪樣品參照蔣琛等[10]的方法進行膽固醇膠束溶解度抑制率的測定。

1.3.4 感官分析 根據(jù)劉麗波[11]的方法并略作改進。采用100分制對成熟24周的干酪進行感官評價，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評價Table1 Sensory evaluation of cheeses

1.3.5 單因素試驗 分析發(fā)酵劑接種量分別為0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時膽固醇膠束溶液的溶解度抑制率及感官評分值；分析植物乳桿菌添加量分別為0%，1.0%，1.5%，2.5%和3.0%（體積分?jǐn)?shù)）時膽固醇膠束溶液的溶解度抑制率及感官評分值；分析菊粉添加量分別為0%，0.5%，1.5%，2.5%和3.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時膽固醇膠束溶液的溶解度抑制率及感官評分值。

1.3.6 響應(yīng)面設(shè)計 以發(fā)酵劑接種量、植物乳桿菌添加量、菊粉添加量為自變量，分別記為A、B、C，以成品干酪的感官評分值為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化。3個自變量的低、中、高水平以-1，0，1進行編碼，試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table2 The factors and levels of response surface experiment design

1.4 降膽固醇動物試驗

1.4.1 動物分組及試驗方案 昆明系雄性小鼠48只，體重（20±2）g，6周齡。試驗前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按體重隨機分為4組，每組12只，喂養(yǎng)35 d，分組情況如表3所示。喂養(yǎng)期間，灌胃時間為每天上午9點。

表3 試驗小鼠分組及飼養(yǎng)情況Table3 Experimental grouping and feeding mode

1.4.2 體質(zhì)量、攝食量和飼料利用率的測定 喂養(yǎng)期間，記錄小鼠攝食量及體質(zhì)量，計算飼料利用率。

飼料利用率=體質(zhì)量增量/攝食量×100%

1.4.3 臟器指數(shù)的測定 試驗結(jié)束，解剖取出小鼠肝臟、脾臟、腎臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干后稱取重，測定臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（肝、脾、腎）（%）=內(nèi)臟質(zhì)量/小鼠體重×100%

1.4.4 血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C及AI含量的測定 喂養(yǎng)49 d后，根據(jù)Akalin等[6]的方法提取小鼠血清，按照試劑盒說明書測定血清TC、TG和HDL-C含量，計算LDL-C及AI。

1.4.5 肝臟及糞便中TC、TG的測定 根據(jù)Xie等[12]的方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，Sigmaplot12.5軟件作圖。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.0分析軟件（P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著）。每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為±SD。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵劑接種量 如圖1a所示，增加發(fā)酵劑接種量使干酪膽固醇膠束溶解度抑制率降低。其原因在于發(fā)酵劑接種量加大使產(chǎn)酸速率加快，干酪中較高的酸度環(huán)境抑制植物乳桿菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶活力[13]。同時，營養(yǎng)物質(zhì)主要用于發(fā)酵劑菌體自身，益生菌能利用的營養(yǎng)成分減少，不利于保持活性[3]。如圖1b所示，感官評分值先升高后降低，在接種量為0.02%時最高。發(fā)酵劑接種量較低的菌株活力差，產(chǎn)酸速度較慢，發(fā)酵時間延長，蛋白分解能力也較差，影響干酪品質(zhì)[14]。接種量過高使預(yù)發(fā)酵的整個脫脂乳體系酸度不斷加大，pH值降低，逐漸接近酪蛋白的等電點4.6，酪蛋白凝結(jié)聚集形成凝乳塊，導(dǎo)致干酪質(zhì)地堅硬[15]。綜合對降膽固醇作用的影響，選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%的直投式商業(yè)發(fā)酵劑作為響應(yīng)面中心試驗點。

圖1 發(fā)酵劑接種量對干酪降膽固醇活性及感官評分的影響Fig.1 Effect of inoculation amount of starter on cholesterol-lowering activity and sensory score

圖2 植物乳桿菌添加量對干酪降膽固醇活性及感官評分的影響Fig.2 Effect of inoculum amount of Lactobacillus plantarum on cholesterol-lowering activity and sensory score

2.1.2 植物乳桿菌的添加量 如圖2a可知，增加植物乳桿菌添加量，干酪膽固醇降解活性增加，當(dāng)添加量大于1.5%（體積分?jǐn)?shù)）時，膽固醇降解能力變化不顯著。植物乳桿菌添加量過多，產(chǎn)酸速率加快，干酪較高的酸度環(huán)境會抑制菌株的生長，而菌株活性直接影響其對膽固醇的吸收和降解[13]。如圖2b所示，干酪感官評分值先升高后降低，當(dāng)植物乳桿菌添加量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)）時感官評分最高。植物乳桿菌接種量較小，乳酸乳球菌在干酪成熟中起主要作用，益生菌水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的風(fēng)味化合物缺乏，而且產(chǎn)生的胞外多糖較少，不利于改善干酪的質(zhì)地[16]。植物乳桿菌接種量過量，初期發(fā)酵過快，產(chǎn)酸造成大量乳清析出，干酪的組織狀態(tài)變差，且風(fēng)味物質(zhì)也缺乏[3]，感官評分值下降。最終選植物乳桿菌1.5%（體積分?jǐn)?shù)）的添加量為響應(yīng)面中心試驗點。

2.1.3 菊粉添加量 由圖3a可知，增加菊粉添加量，干酪降膽固醇活性先增加后降低，菊粉添加量為1.5%的干酪在成熟期兩個月時達到最大，且成熟過程中降幅最小，成熟24周時高于其它各組（P＜0.05），達51.12%，說明1.5%菊粉能夠顯著增加干酪的降膽固醇活性。如圖3b所示，感官評分值先增加后降低，在菊粉添加量為1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時最高。菊粉是一種能產(chǎn)生奶油狀的潤滑感和黏稠度的多糖，截留的水分可在質(zhì)感和口感上模擬脂肪[17]，其作為脂肪替代物能夠改善低脂干酪品質(zhì)，同時維持益生菌活性，進一步促進蛋白質(zhì)分解；而過量菊粉與酪蛋白緊密結(jié)合，反而不利于酪蛋白水解產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，這與Lee M R等[18]的結(jié)論相一致。最終選菊粉添加量為1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為響應(yīng)面中心試驗點。

圖3 菊粉添加量對干酪降膽固醇活性及感官評分的影響Fig.3 Effect of inoculum amount of inulin on cholesterol-lowering activity sensory score

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝的結(jié)果分析

以單因素試驗為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken原則進行響應(yīng)面分析，試驗結(jié)果見表4所示。對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，建立工藝參數(shù)回歸模型，得到回歸方程為：

Y=85.6+0.75A+6B+1.25C+0.5AB+3AC-0.5BC-4.8A2-3.3B2-5.8C2

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table4 Design and result of Response surface test

由表5可知，回歸模型的F值為82.64，P＜0.0001，說明模型達到極顯著水平；失擬項P=0.0649＞0.05，說明失擬項差異不顯著，試驗無失擬因素，可充分反映實際情況。試驗?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.9907，試驗值與預(yù)測值較接近，說明該回歸模型合理，能較好地解釋響應(yīng)值。同時，從F檢驗可判斷出各因素對干酪工藝影響的順序為植物乳桿菌添加量（B）＞和菊粉添加量（C）＞發(fā)酵劑接種量（A）。從回歸方程及方差分析能夠看出，模型中一次項B對工藝的影響達到極顯著水平（P＜0.0001），C對工藝的影響達到顯著水平（P＜0.05）；二次項A2、C2對工藝的影響為極顯著水平（P＜0.0001）；交互項AC對工藝的影響為顯著水平（P＜0.05）。

表5 回歸方程系數(shù)顯著性Table5 Significance coefficient of Regression equation

2.3 響應(yīng)面分析

由統(tǒng)計分析軟件并依據(jù)回歸方程，得到3個單因素間響應(yīng)面及等高線，結(jié)果如圖4～6所示。

由響應(yīng)面圖形可看出最佳參數(shù)及各因素間的相互作用，根據(jù)響應(yīng)面等高線圖可以看出極值出現(xiàn)在圓心處，說明在所選范圍內(nèi)可得到響應(yīng)值的最大值[19]。通過以上結(jié)果分析A，B，C三因素，得到最優(yōu)條件是：發(fā)酵劑接種量0.02%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），植物乳桿菌添加量1.94%（體積分?jǐn)?shù)），菊粉添加量2.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），用此配方制作的干酪感官評分值為87.36。為便于操作，將植物乳桿菌添加量修正為體積分?jǐn)?shù)2.00%。為檢驗此響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，按照上述修正的條件，制作5組干酪并進行感官評分，得到平均值為86.78，和理論預(yù)測值吻合，說明該響應(yīng)面結(jié)果可靠。

圖4 Y=f（A，B，0）的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface and contour lines for Y=（A，B，0）

圖5 Y=f（0，B，C）的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface and contour lines for Y=（0，B，C）

圖6 Y=f（A，0，C）的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour lines for Y=（A，0，C）

2.4 益生菌干酪體內(nèi)降膽固醇活性分析

2.4.1 體質(zhì)量、攝食量、飼料利用率及臟器指數(shù)如表6所示，飼喂高脂飼料的3組的小鼠體質(zhì)量增重、攝食量和飼料利用率明顯低于A組小鼠，這可能是由于高脂飼料導(dǎo)致小鼠膽固醇升高等一系列的機體反應(yīng)，并導(dǎo)致大鼠食欲下降。4組小鼠的肝臟質(zhì)量發(fā)生明顯的變化（P＜0.05），飼喂普通飼料的小鼠質(zhì)量顯著高于飼喂高脂飼料的3組，初步反映小鼠食入過多的膽固醇會蓄積在肝臟，對肝臟產(chǎn)生影響。D組小鼠的肝重指數(shù)顯著低于高脂B組，說明益生菌干酪在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了作用，降低了臟器上膽固醇的存積量，減輕了臟器負(fù)擔(dān)。

2.4.2 血脂 研究表明，TC、TG和LDL-C是導(dǎo)致動脈硬化的直接因素；HDL-C可以作為動脈硬化的保護因素；動脈硬化指數(shù)AI是國際醫(yī)學(xué)界制定的一個衡量動脈硬化程度的指標(biāo)，指數(shù)越高，表明患病程度越高[20]。

表6 小鼠的體重、攝食量和飼料利用率Table6 Body weight，total food intake and food efficiency of rats

表7 低脂干酪對小鼠臟器指數(shù)的影響Table7 Effect of low-fat Cheddar cheese on organ indexes

表8 低脂干酪對小鼠血脂的影響Table8 Effect of low-fat Cheddar cheese on serum TC，TG，LDL-C and HDL-C

由表8可知，3組高脂飼料組的TC、TG和LDL-C水平顯著高于普通飼料A組（P＜0.05），HDL-C水平顯著低于普通飼料A組（P＜0.05），表明小鼠己患上高脂血癥，高脂模型建立成功。35 d灌胃試驗后，與B組相比，D組的TC、TG和LDL-C含量均得到顯著抑制（P＜0.05），分別下降了21.23%，25.57%和39.11%，且顯著低于空白對照C組（P＜0.05），說明該組干酪能降低小鼠血清中TC、TG和LDL-C含量；血清HDL-C雖相比B組略有升高，但差異不顯著（P＞0.05）。EIGAWAD等[21]發(fā)現(xiàn)，添加乳雙歧桿菌和長雙歧桿菌的水牛奶酸乳和豆奶能降低高脂小鼠血清及肝臟中TC和LDL-C含量，而對HDL-C含量影響不顯著，與本試驗結(jié)論一致。高脂飼料的B、C、D組AI顯著高于A組（P＜0.05），D組AI值較B組下降35.05%，說明高脂飼料增加了小鼠的動脈硬化的風(fēng)險，益生菌干酪發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)功效。這可能是由于植物乳桿菌具有降膽固醇活性，同時菊粉作為益生元能進一步刺激其在腸道內(nèi)增殖，從而更好地發(fā)揮降膽固醇作用[22]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)益生菌能將菊粉分解成具有降低血清膽固醇的短鏈脂肪酸，從而對高脂血癥引起的動脈硬化具有更好的功效[23]。

2.4.3 益生菌干酪對小鼠肝臟和糞便中TC和TG的影響 測定4組小鼠肝臟TC、TG含量和糞便TC、TG含量，以了解膽固醇在小鼠體內(nèi)的積存和排除情況，從而得知高脂飲食中的膽固醇在動物體內(nèi)的去向。

表9 低脂干酪對小鼠肝臟和糞便中TC和TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table9 Effect of low-fat Cheddar cheese on the liver and fecal cholesterol levels in rats

由表9可知，D組小鼠肝臟中的TC、TG相比于B組分別下降了37.32%和17.33%，顯著低于灌胃空白低脂干酪的小鼠（P＜0.05），說明益生菌干酪對高脂小鼠肝臟膽固醇有明顯的降低作用，能減少膽固醇在肝臟的積存。Fukushima等[22]研究發(fā)現(xiàn)給高脂模型的大鼠飼喂嗜酸乳桿菌發(fā)酵的米糠后，降低了大鼠肝臟中膽固醇合成限速酶（HMG-CoA）的活性，進而降低由高脂飲食導(dǎo)致的肝臟中血脂水平的升高。也有研究發(fā)現(xiàn)某些益生菌發(fā)酵益生元產(chǎn)生的丁酸鹽，能夠抑制膽固醇在肝臟中的合成，產(chǎn)生的丙酸鹽通過抑制脂肪酸在肝臟中的合成來減少甘油三醋的分泌，發(fā)揮體內(nèi)降膽固醇作用[22]。D組小鼠糞便中TC和TG比B組分別升高37.2%和30.66%（P＜0.05），說明益生菌干酪使飲食來源的無法被吸收利用的膽固醇排出體外。Jeun J等[24]研究表明益生菌有助于增加糞便膽汁酸的排泄，從而有利于調(diào)節(jié)肝臟膽固醇水平的平衡。也有研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和乳桿菌對結(jié)合型膽汁酸有脫飽和作用，將膽固醇還原為糞膽固醇來發(fā)揮降膽固醇作用[25]。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化得出：在發(fā)酵劑接種量為0.02%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），植物乳桿菌添加量為2.00%（體積分?jǐn)?shù)），菊粉添加量為2.00%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時低脂干酪易被接受，且感官評分值最高。灌胃試驗組干酪小鼠的TC、TG、LDL-C及AI比高脂模型組分別下降21.23%，25.57%，39.11%和35.05%，說明該干酪具有一定調(diào)節(jié)血脂，降低體內(nèi)膽固醇的作用。小鼠肝臟中TG和TC下降，糞便中TG和TC升高，表明干酪降膽固醇作用可能與植物乳桿菌及菊粉促使體內(nèi)膽固醇的合成減少或代謝加速有關(guān)。關(guān)于益生菌及其發(fā)酵乳制品降膽固醇的作用機制尚未明確，還有待進一步研究。