1,25-二羥維生素D3對小鼠急性結(jié)腸炎模型的干預(yù)研究

陳穎，周仁民，陳欣濤，林瓊

(無錫市兒童醫(yī)院消化科，江蘇 無錫 214000)

炎癥性腸病是一種非特異性腸道炎癥性疾病，近年來兒童炎癥性腸病發(fā)病率逐年升高，其特異性致病因素和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為與多種因素有關(guān)，免疫紊亂可能是其致病的基礎(chǔ)機(jī)制[1-2]。1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3，1,25(OH)2D3]是機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子，在多種自身免疫性疾病中通過與維生素D受體(nuclear receptor vitamin D receptor，VDR)結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[3-4]。炎癥性腸病患者和小鼠模型血清中1,25(OH)2D3水平較低[5-6]。將小鼠的VDR基因敲除，可以誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生，而在補(bǔ)充1,25(OH)2D3后結(jié)腸炎癥得到明顯改善[7]。大多數(shù)研究認(rèn)為，成人炎癥性腸病患者補(bǔ)充維生素D是必要的，也有部分研究不支持這一觀點(diǎn)[8-9]。在兒童炎癥性腸病患者中，維生素D缺乏更為明顯，但現(xiàn)有研究對于維生素D能否作為治療手段仍不明確[10]。

炎癥性腸病患者及小鼠模型中均有腸黏膜凋亡增多[5-6]，而Bax和Bcl-2是重要凋亡調(diào)控基因，胱天蛋白酶3(caspase-3)是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。研究發(fā)現(xiàn)，在人腎小球系膜細(xì)胞中，1,25(OH)2D3能夠改善系膜細(xì)胞凋亡并促進(jìn)caspase-3表達(dá)[11-12]。本研究進(jìn)一步證實(shí)1,25(OH)2D3在小鼠急性腸炎中的治療作用，探討其可能的作用機(jī)制，以期為炎癥性腸病的臨床治療提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1材料 選取6～8周齡清潔級BALB/c雄性小鼠24只，體重18～22 g，購自江蘇亞東實(shí)驗(yàn)動物研究院有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0009]。飼養(yǎng)溫度控制在18～22 ℃，濕度50%～60%。主要試劑：右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)(美國Sigma公司)；維生素D3(羅蓋全膠囊，上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn))；核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)單克隆抗體、caspase-3多克隆抗體均購自美國CST公司；GTVisionTM抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自南京貝斯特生物技術(shù)有限公司。主要儀器：離心機(jī)(美國Beckman公司)；組織切片機(jī)(德國徠卡)；光學(xué)顯微鏡(美國Olympus公司)等。

1.2小鼠模型及分組 24只小鼠編號后按隨機(jī)數(shù)字法分為對照組、模型組、干預(yù)組，每組8只。維生素D3是按照成人維生素D缺乏的常規(guī)劑量給藥(50 000 IU/周)，按體表面積折算為小鼠的等效劑量，采用該劑量的5倍作為本實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。根據(jù)Cooper等[13]的經(jīng)典方法，對照組小鼠自由飲用蒸餾水7 d；模型組和干預(yù)組小鼠自由飲用 3% DSS溶液7 d建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。同時，于第 1、3、5、7 天行灌胃，對照組和模型組小鼠予無菌磷酸鹽緩沖液灌胃，干預(yù)組小鼠予維生素D3灌胃。每天觀察并記錄小鼠體重、大便、活動、飲食、存活等情況。造模10 d后，處死各組小鼠，采集小鼠結(jié)腸標(biāo)本備檢。

1.3疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI) 每日觀察小鼠體重、大便性狀和隱血或血便情況，計(jì)算DAI評分。DAI結(jié)合患者(患病動物)的體重下降百分率(體重不變?yōu)?，1%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～15%為3分，>15%為4分)、大便黏稠度(正常為0，松散的大便為2分，腹瀉為4分)和大便出血(正常0分，隱血陽性為2分，肉眼血便為4分)三種情況進(jìn)行綜合評分。DAI=(體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3[13]。

1.4結(jié)腸組織病理學(xué)評分 取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織，石蠟包埋的腸組織分別做5 μm連續(xù)切片，按照二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、自來水沖洗1 min、蘇木精染色7 min、自來水沖洗2 min、1%鹽酸乙醇2 s、自來水沖洗2 min、1%氨水30 s、自來水沖洗4 min、0.5%伊紅乙醇30 s、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片順序行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，根據(jù)表1進(jìn)行組織病理學(xué)評分[13]。

1.5采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)測定小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達(dá)情況 應(yīng)用RNAiso Plus總RNA提取試劑盒提取標(biāo)本總RNA，并測定其濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTMRT reagent試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，以肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參并檢測TNF-α的相對表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)如下。TNF-α上游引物：ACTCCAGGCGGTGCCTATGT，TNF-α 下游引物：GTGAGGGTCTGGGCCATAGAA；β-actin上游引物：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC，β-actin 下游引物：ATGGAGCCACCGATCCACA，聚合酶鏈反應(yīng)總反應(yīng)體系為20 μL，置入聚合酶鏈反應(yīng)儀中，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，4 ℃終止反應(yīng)。

表1 結(jié)腸組織病理評分

1.6采用免疫組織化學(xué)法測定結(jié)腸組織中NF-κB、 caspase-3的表達(dá)情況 將石蠟包埋組織連續(xù)切片后，依次行脫蠟、 水化、3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液沖洗，微波爐內(nèi)行抗原修復(fù)，再滴加山羊血清封閉液，一抗后4 ℃過夜，二抗、 三抗室溫各孵育30 min，正置顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺顯色 2 min后，行復(fù)染、脫水、透明，封片鏡檢。采用半定量法分別判斷NF-κB、caspase-3陽性結(jié)果。首先，判斷陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞記0分，1%～10%記1分，11%～50%記 2分，51%～80%記 3分，>80%記4分；再判定染色強(qiáng)度，根據(jù)陰性、弱、中、強(qiáng)分別記0、1、2、3分；最終評分為陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度的乘積。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠的一般狀況 研究期間，對照組小鼠大小便正常、體重持續(xù)增加、毛發(fā)有光澤，飲食、活動等正常。模型組小鼠造模后第1天，體重增長，進(jìn)食進(jìn)水較多；造模后第3天體重逐漸下降、進(jìn)食進(jìn)水量逐漸減少，大便松散逐漸呈稀便，第5天后肛周可見肉眼血便。干預(yù)組小鼠造模后癥狀同模型組，但灌胃干預(yù)后，體重逐漸升高，進(jìn)食進(jìn)水量逐漸增加，大便量增加。

2.21,25(OH)2D3改善DAI及結(jié)腸長度 模型組與干預(yù)組小鼠DAI均高于對照組(Z=-2.498，P=0.013;Z=-2.400,P=0.016)，而干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.369，P=0.712)。模型組、干預(yù)組結(jié)腸長度短于對照組(t=21.176，9.954，均P<0.01)，而干預(yù)組小鼠結(jié)腸長度長于模型組(t=16.088，P<0.01)，見表2。三組小鼠結(jié)腸長度測量結(jié)果見圖1。

表2 各組小鼠DAI及結(jié)腸長度比較

DAI:疾病活動指數(shù)；a與對照組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

圖1 對照組(1a)、模型組(1b)及干預(yù)組(1c)小鼠結(jié)腸長度

2.31,25(OH)2D3改善結(jié)腸組織病理損傷 對照組鏡下結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，模型組小鼠顯示結(jié)腸結(jié)構(gòu)紊亂，包括炎癥細(xì)胞浸潤、腺體萎縮，部分可見淋巴濾泡形成等，見圖2。干預(yù)組小鼠結(jié)腸病理損傷較模型組改善，干預(yù)組與模型組小鼠組織病理評分分別為(17.75±2.87)分、(15.00±2.62)分，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.004，P=0.065)。

2.41,25(OH)2D3對結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)的影響 對照組、模型組及干預(yù)組TNF-α mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.85±0.08、2.74±0.06，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=989.112，P<0.01)，模型組及干預(yù)組TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(t=39.147、54.129，均P<0.01)，而干預(yù)組TNF-α mRNA表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.925，P=0.127)。

圖2 對照組(2a)、模型組(2b)及干預(yù)組(2c)小鼠結(jié)腸組織病理結(jié)果圖像(HE ×200)

2.51,25(OH)2D3對凋亡途徑的影響 模型組與干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)均高于對照組小鼠(Z=-3.489，-3.491，P均<0.01)，而干預(yù)組和模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.489，P=0.138)。模型組和干預(yù)組caspase-3高于對照組(Z=-3.475，-3.491，均P<0.01)，而干預(yù)組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.560，P=0.119)。見表3。 NF-κB p65、caspase-3在對照組結(jié)腸組織內(nèi)無表達(dá)，兩者在模型組和干預(yù)組黏膜層、黏膜下層腺體內(nèi)及其炎癥細(xì)胞中均有表達(dá)，但兩者在干預(yù)組中表達(dá)較模型組低，見圖3。

3 討 論

約1/4的炎癥性腸病患者在20歲前被診斷[14]。兒童炎癥性腸病的發(fā)生率逐年升高，其腸道外并發(fā)癥、營養(yǎng)不良等發(fā)生風(fēng)險較成人更為顯著。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者存在不同程度的維生素D缺乏，在兒童炎癥性腸病患者中更為明顯。額外補(bǔ)充維生素D能否作為一種新的治療手段仍不確定。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床表現(xiàn)及組織病理損傷類似，包括食欲下降、體重減輕、腹瀉、便血、炎癥細(xì)胞浸潤、腺體萎縮等[15-16]。因此，本研究利用DSS結(jié)腸炎小鼠作為研究模型。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織內(nèi)NF-κB p65、caspase-3相對表達(dá)水平比較 [M(P25，P75)]

NF-κB：核因子κB；caspase-3：胱天蛋白酶3；a與對照組比較，P<0.05

對照組 模型組 干預(yù)組

NF-κB：核因子κB；caspase-3：胱天蛋白酶3

圖3 對照組、干預(yù)組及模型組小鼠NF-κB p65、caspase-3表達(dá)圖像(HE ×200)

本研究結(jié)果顯示,模型組和干預(yù)組DAI高于對照組，與既往研究一致[17]。對比結(jié)腸長度，模型組較對照組顯著縮短，而干預(yù)組較模型組改善。本研究通過HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸組織病理可見炎癥細(xì)胞浸潤、腺體萎縮，部分可見淋巴濾泡形成等，干預(yù)組和模型組組織病理評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，建模成功。同時，本研究結(jié)果提示，干預(yù)組結(jié)腸組織也可見結(jié)腸炎表現(xiàn)，但嚴(yán)重程度較模型組低，與之前的研究一致[18]，表明1,25(OH)2D3可以改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠DAI及結(jié)腸組織病理炎癥表現(xiàn)。

1,25(OH)2D3是維生素D的活性形式，具有免疫調(diào)節(jié)特性，對自身免疫性疾病發(fā)生及治療具有潛在作用。VDR是介導(dǎo)1,25(OH)2D3發(fā)揮生物效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，其在腸道組織內(nèi)廣泛表達(dá)。既往研究著重于維生素D/VDR信號通路在炎癥性腸病動物模型中免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，也有研究表明，維生素D/VDR信號通路可以通過非免疫機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥性腸病[7-8]。NF-κB信號通路可以調(diào)控多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等基因的表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生物進(jìn)程，其也是腸道炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一。在實(shí)驗(yàn)性小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，NF-κB 可以調(diào)節(jié)多種促炎因子與抗炎因子表達(dá)，如TNF-α、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10、環(huán)加氧酶-2等，調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致結(jié)腸黏膜損傷[14-20]。本研究結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3可顯著降低局部TNF-α mRNA表達(dá)，減輕腸道炎癥反應(yīng)，與既往研究結(jié)果一致[16]。VDR與NF-κB p65結(jié)合可以阻止其發(fā)生核轉(zhuǎn)移，阻斷NF-κB信號途徑，抑制后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。VDR在腸上皮細(xì)胞上表達(dá)減少導(dǎo)致NF-κB信號途徑的表達(dá)增加，從而促進(jìn)促炎因子的表達(dá)。本研究中，模型組NF-κB p65蛋白表達(dá)較對照組升高，而干預(yù)組較模型組表達(dá)降低，表明1,25(OH)2D3可以通過結(jié)腸組織內(nèi)NF-κB信號通路系統(tǒng)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)。故推測1,25(OH)2D3可以通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥因子平衡，改善結(jié)腸炎癥。

炎癥性腸病患者及小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)結(jié)腸細(xì)胞凋亡表達(dá)增加，從而導(dǎo)致腸黏膜損傷。腸上皮細(xì)胞凋亡使腸上皮屏障受損及腸道損傷。Bax和Bcl-2是B細(xì)胞淋巴瘤2家族成員，在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。Bax是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bcl-2位于線粒體外膜，可競爭性與Bax蛋白結(jié)合，形成Bax/Bcl-2二聚體，從而終止凋亡的發(fā)生。Bax/Bcl-2比率增加可以促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。正常情況下，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)caspase-3以無活性酶原形式存在，細(xì)胞凋亡信號可以導(dǎo)致其發(fā)生裂解而活化，活化后的caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶，而細(xì)胞色素C能促進(jìn)caspase-3活化，進(jìn)而發(fā)生下游級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡發(fā)生。本研究顯示，1,25(OH)2D3下調(diào)caspase-3表達(dá)，提示1,25(OH)2D3可以改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明，抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡及NF-κB信號通路激活可能是1,25(OH)2D3抑制結(jié)腸炎癥的機(jī)制之一[21]。

綜上所述，急性結(jié)腸炎模型小鼠給予1,25(OH)2D3可顯著改善DAI、結(jié)腸長度及炎癥反應(yīng)，減輕腸道損傷，并抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，對急性結(jié)腸炎小鼠具有較好的干預(yù)效果。