祝連明，黃楠，孫愛華

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院藥劑科，杭州 310003； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，杭州 310053；3.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，杭州 310053)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，由于乳腺癌細(xì)胞連接松散，脫落后容易隨血液和淋巴液轉(zhuǎn)移，所以乳腺癌的一大特點(diǎn)為早期轉(zhuǎn)移[1-3]。維生素C是人體必需的維生素之一，人體不能自身合成，只能從體外攝取，其在維持機(jī)體的功能和物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[4]。臨床上常將維生素C作為輔助性藥物，目前化療時(shí)也使用維生素C，但劑量一般較小。有學(xué)者認(rèn)為，維生素C通過影響物質(zhì)代謝和能量代謝達(dá)到抗腫瘤作用，但其抗腫瘤效果一直存在爭議[5-6]。近年有研究認(rèn)為，靜脈注射大劑量的維生素C(每日10 g)對(duì)腫瘤治療有效[7-8]。順鉑是一種廣譜抗腫瘤藥物，作為細(xì)胞周期非特異性藥物通過激活DNA損傷殺死細(xì)胞。目前，順鉑廣泛應(yīng)用于膀胱癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種實(shí)體瘤的治療[9-11]。然而長期使用順鉑會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)和藥物耐受，因此尋找一種既可以保證化療療效又可以減少化療不良反應(yīng)的藥物或藥物組合是抗腫瘤治療的研究方向之一[12]。MCF-7細(xì)胞是廣泛應(yīng)用于乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及治療實(shí)驗(yàn)室研究的乳腺癌細(xì)胞系，本研究以MCF-7細(xì)胞為細(xì)胞模型，旨在探討維生素C與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的殺傷作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。順鉑購自美國Sigma公司(批號(hào)：20170919)，維生素C注射液購自上海現(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司(批號(hào):17051516)。四氮唑鹽比色法試劑盒由美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀由美國Becton,Dickinson and Company公司生產(chǎn)，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及檢測 將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7置于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.1四氮唑鹽比色法檢測不同濃度的維生素C和(或)順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用 將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用胰蛋白酶溶液消化后吹打均勻并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，用微量加液器移取至96孔板，每孔加100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。鏡下觀察細(xì)胞生長情況、形態(tài)學(xué)變化，若發(fā)現(xiàn)96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長，且形態(tài)正常，分別加入維生素C和順鉑，使維生素C終濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L，順鉑的終濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL；根據(jù)單獨(dú)用藥對(duì)細(xì)胞生長抑制率檢測結(jié)果確定維生素C和順鉑聯(lián)合用藥劑量，聯(lián)合用藥時(shí)維生素C的終濃度為1 mmol/L，順鉑的終濃度分別為 0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL，組成8種組合。所有藥物抑制作用檢測實(shí)驗(yàn)均以不加藥同期培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h,同一藥物、同一濃度均重復(fù)3孔。鏡下觀察細(xì)胞生長情況、形態(tài)學(xué)變化，四氮唑鹽比色法檢測不同濃度的維生素C和(或)順鉑對(duì)細(xì)胞生長的抑制率，細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值)×100%，將MCF-7細(xì)胞抑制率為50%時(shí)維生素C和(或)順鉑的藥物濃度記為半數(shù)細(xì)胞抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測不同濃度維生素C和(或)順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用結(jié)果，維生素C濃度分別選擇0、0.5、1、2 mmol/L，順鉑濃度分別為0、2.5、5 μg/mL，組成12種聯(lián)合用藥組合，同一藥物、同一濃度均重復(fù)3孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化，離心半徑8 cm、800 r/min、4 ℃離心10 min后收集細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 分別選擇濃度為0、0.5、1、2 mmol/L的維生素C與5 μg/mL順鉑進(jìn)行組合用藥確定順鉑單獨(dú)用藥或與維生素C聯(lián)合加入對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，以不加藥同期培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h，同一藥物、同一濃度均重復(fù)3孔。收集細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌2遍收集到1.5 mL的EP管中，4 ℃、離心半徑8 cm、150 00 r/min離心5 min，取上清液加入裂解液置于冰上反應(yīng)5 min，4 ℃、離心半徑8 cm、120 00 r/min離心10 min收集上清液即為蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白[胱天蛋白酶3(caspase-3)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)]的表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，每孔加入各組收集蛋白10 μg，各組收集蛋白并進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉液封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗 (1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST(Tris-HCl緩沖鹽+吐溫)洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000 稀釋)，室溫孵育2 h，應(yīng)用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色。美國伯樂凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描并分析。

2 結(jié) 果

2.1維生素C和(或)順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用 維生素C、順鉑單獨(dú)用藥和1 mmol/L 維生素C和順鉑聯(lián)合用藥的MCF-7細(xì)胞增殖抑制率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低濃度維生素C(≤1 mmol/L)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用小，濃度升高>1 mmol/L時(shí)，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制率明顯提高，且隨著維生素C濃度升高抑制率增加，維生素C對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為2.84 mmol/L。順鉑單獨(dú)用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用隨藥物濃度升高而增加，IC50為4.89 μg/mL。1 mmol/L的維生素C和不同濃度順鉑聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用隨順鉑濃度升高而增加，IC50為2.14 μg/mL。維生素C和順鉑聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于維生素C或順鉑單獨(dú)用藥(P<0.05)。濃度≥1.25 μg/mL的順鉑和 1 mmol/L的維生素C聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率均明顯高于順鉑單獨(dú)用藥(P<0.05)。按金氏公式計(jì)算q值均>1.15，提示1 mmol/L的維生素C與1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL 和10 μg/mL的順鉑有協(xié)同效應(yīng)，增加了順鉑的敏感性。見表1。

2.2維生素C和(或)順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 維生素C與順鉑聯(lián)合用藥的MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯高于維生素C或順鉑單獨(dú)用藥(P<0.05)。對(duì)于維生素C用藥組，0.5 mmol/L的維生素C與對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1 mmol/L和2 mmol/L的維生素C對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。對(duì)于順鉑用藥組，2.5 μg/mL和5.0 μg/mL順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)。所有單獨(dú)用藥高劑量組的MCF-7細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)應(yīng)低劑量組(P<0.05)；所有聯(lián)合用藥組的MCF-7細(xì)胞凋亡率均明顯高于單獨(dú)用藥(P<0.05)；所有聯(lián)合用藥高劑量組的MCF-7細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)應(yīng)低劑量組(P<0.05)。維生素C和順鉑單獨(dú)用藥或聯(lián)合用藥的MCF-7細(xì)胞凋亡率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

維生素C抑制率順鉑抑制率維生素C+順鉑抑制率0.125 mmol/L1.87±0.430.312 5 μg/mL7.76±3.571 mmol/L+0.312 5 μg/mL11.89±3.860.25 mmol/L2.21±0.510.625 μg/mL14.76±4.801 mmol/L+0.625 μg/mL21.46±6.390.5 mmol/L2.87±0.471.25 μg/mL29.24±5.831 mmol/L+1.25 μg/mL46.17±5.781 mmol/L4.06±0.612.5 μg/mL39.82±4.471 mmol/L+2.5 μg/mL58.11±5.092 mmol/L42.51±2.415 μg/mL51.28±5.741 mmol/L+5 μg/mL70.88±6.314 mmol/L59.72±3.3010 μg/mL63.86±6.021 mmol/L+10 μg/mL84.10±6.378 mmol/L66.44±2.8720 μg/mL70.97±5.361 mmol/L+20 μg/mL90.12±4.5016 mmol/L74.93±2.4540 μg/mL78.56±5.091 mmol/L+40 μg/mL90.25±5.02F值17.837F值23.514F值42.906P值0.003P值0.003P值0.001

維生素C順鉑0 μg/mL2.5 μg/mL5.0 μg/mL0 mmol/L7.21±2.9015.47±3.40a29.68±3.08ab0.5 mmol/L10.45±3.2727.09±3.67ac41.55±4.07acd1 mmol/L 31.30±4.98ab40.66±4.02acd68.21±4.63acd2 mmol/L53.98±4.99ab68.40±4.51acd85.83±5.77acdF值16.94518.78733.200P值0.0030.0030.001

a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與單獨(dú)用藥對(duì)應(yīng)低劑量組比較，P<0.05；c與單獨(dú)用藥組比較，P<0.05；d與聯(lián)合用藥對(duì)應(yīng)低劑量組比較，P<0.05

2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果 與5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥相比，順鉑與維生素C聯(lián)合用藥的caspase-3表達(dá)量升高和Bcl-2表達(dá)下降(均P<0.05)。與對(duì)照組相比，5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥或與0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L 維生素C聯(lián)合用藥后MCF-7細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)減少；且1 mmol/L和2 mmol/L 維生素C與5 μg/mL順鉑聯(lián)合用藥的caspase-3表達(dá)明顯高于順鉑單獨(dú)用藥(均P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)明顯低于5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥(均P<0.05)。以GAPDH為內(nèi)參，利用美國伯樂凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描并分析，caspase-3和Bcl-2的表達(dá)與內(nèi)參比值(Bcl-2/GAPDH)，見圖1和表3。

3 討 論

維生素C在腫瘤治療中的作用廣泛。研究認(rèn)為，維生素C對(duì)腫瘤具有治療作用[5-8]，但有研究認(rèn)為維生素C不能抑制惡性腫瘤進(jìn)展，延長患者生存時(shí)間[13]。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，維生素C對(duì)腫瘤的治療作用與血藥濃度相關(guān)，高劑量維生素C對(duì)癌細(xì)胞具有殺傷作用[7,14]。另外，有學(xué)者在研究維生素C的抗腫瘤機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)維生素C可通過協(xié)同效應(yīng)增敏其他抗腫瘤藥物[15-16]。本研究分析0.125～16 mmol/L倍比遞增維生素C濃度對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)低濃度維生素C(≤1 mmol/L)對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率(≤2.23%)低，而維生素C濃度>1 mmol/L時(shí)，其對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率顯著上升且呈濃度依賴性，提示維生素C對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用與濃度相關(guān)，只有達(dá)到一定的細(xì)胞濃度才能有效抑制細(xì)胞增殖，表明在維生素C治療腫瘤時(shí)應(yīng)考慮維生素C在消化道的吸收率，以保證細(xì)胞藥物濃度，故建議注射用藥，這與劉珊和韓艷秋[17]對(duì)維生素C對(duì)順鉑治療大鼠卵巢癌療效的影響研究結(jié)果一致。然而在腫瘤治療中，無論是維生素C還是本研究用的腫瘤治療經(jīng)典藥物順鉑均有不良反應(yīng)，特別是高劑量時(shí)不良反應(yīng)尤為明顯[18]。本研究結(jié)果顯示，1 mmol/L 維生素C與不同濃度順鉑聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7的抑制率均高于同濃度順鉑單獨(dú)用藥，其中順鉑單獨(dú)用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的IC50為4.89 μg/mL，當(dāng)順鉑與1 mmol/L的維生素C聯(lián)合用藥后IC50為2.14 μg/mL，而1 mmol/L 維生素C對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制率僅為2.23%，1 mmol/L 維生素C與較低濃度的順鉑聯(lián)合能起到很好的腫瘤殺傷作用，且不良反應(yīng)較少,提示1 mmol/L的維生素C對(duì)較低濃度的順鉑有協(xié)同增敏效應(yīng)。

VitC：維生素C；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；caspase-3：胱天蛋白酶3；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖1順鉑單獨(dú)用藥或聯(lián)用不同濃度維生素C后MCF-7細(xì)胞caspase-3和Bcl-2的表達(dá)

組別caspase-3/GAPDHBcl-2/GAPDH對(duì)照組10.52±1.01230.29±14.205 μg/mL順鉑80.78±5.67a157.34±10.49a5 μg/mL順鉑+0.5 mmol/L 維生素C111.58±8.51a124.89±8.94a5 μg/mL順鉑+1 mmol/L 維生素C176.04±10.61ab74.71±5.62ab5 μg/mL順鉑+2 mmol/L 維生素C240.12±12.07ab20.80±4.10abF值87.96793.221P值<0.001<0.001

caspase-3：胱天蛋白酶3；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥比較，P<0.05

細(xì)胞增殖和凋亡均是復(fù)雜的多基因調(diào)控過程，它們同時(shí)受到各種原癌基因及抑癌基因的雙向調(diào)控[19]。其中，Bcl-2是常見的抑制凋亡基因，有延長細(xì)胞生存周期的作用，還可作用于線粒體通過抑制促凋亡蛋白發(fā)揮作用；caspase-3是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的酶，可促進(jìn)凋亡[20-21]。本研究結(jié)果顯示，5 μg/mL順鉑或5 μg/mL 順鉑與不同濃度維生素C聯(lián)合作用對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組；維生素C的濃度為1 mmol/L時(shí)，其與5 μg/mL順鉑聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯高于5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥。提示，Bcl-2和caspase-3與5 μg/mL順鉑單獨(dú)用藥或與維生素C聯(lián)合用藥促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用，其機(jī)制可能是通過抑制Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)caspase-3的表達(dá)發(fā)揮促M(fèi)CF-7細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，維生素C和(或)順鉑可抑制MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且聯(lián)合用藥效果優(yōu)于單獨(dú)用藥。1 mmol/L的維生素C對(duì)順鉑抑制MCF-7細(xì)胞增殖有增敏作用，順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過促進(jìn)caspase-3和抑制Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。