磁性分離長白紅景天提取物中抗氧化組分*

尹秀梅，張敬東，王思宏

(1 延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002;2 延邊大學分析測試中心，吉林 延吉 133002)

天然提取物的許多有益健康的特性都歸功于其中所含的抗氧化成分，因為抗氧化物質可以清除自由基，自由基會對人體造成一些有害影響，如DNA損傷、致癌和與衰老有關的細胞退化。由于消費者對食品中合成抗氧化劑的安全性的擔憂，從植物提取物中開發(fā)天然抗氧化劑越來越引起重視。如何在靶向引導下從復雜的中草藥體系中實現(xiàn)活性化合物的快速篩選和分離，一直是分離技術研究者努力解決的重要課題。紅景天屬植物約20種被用作亞洲的傳統(tǒng)抗氧化中草藥，其中的咖啡酸、黃酮類物質、酚類和多酚類化合物都具有較強的抗氧化能力，能有效的清除機體內外的自由基，但是一些亞種的紅景天化學成分尚未得到深入研究[1-2]，長白紅景天(R.angustaNakai)[3]根莖葉中黃酮含量及其抗氧化活性研究尚未見報道。鑒于磁性材料的超順磁性、材料整體的制備簡單性、應用低毒性等特點，磁性材料在分離富集領域中，作為一種應用與研發(fā)潛能的固相萃取材料，一直受到廣泛關注[4]。因此從天然產物化學與材料化學的學科交叉出發(fā)，以長白紅景天提取物為研究對象，采用硼酸功能化磁性材料[5]對長白紅景天提取物進行配體垂釣，通過DPPH清除率來分析驗證功能化磁性材料與提取物不同成分之間親和作用力的差別。

1 材料和儀器

1.1 材 料

長白紅景天采自安圖二道白河，經由延邊大學藥學院呂惠子副教授鑒定；三氯化鐵、過氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、甲醇、乙酸、乙酸鈉、氯化銨、濃氨水(均為分析純)；蘆丁， 中國生物制品檢定所；DPPH，Sigma；釹鐵硼強磁(50×50×10 mm)，寧波永磁磁性材料廠；根據(jù)文獻制備和表征硼酸功能化磁性材料(MNP-BOH)[4, 6]。

1.2 儀 器

U-3400型紫外可見分光光度計，HITACHI公司；SHBⅢ型循環(huán)水式真空泵，上海豫康科教儀器設備有限公司公司；Q/BKYY31-200型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；TWIN MIXER TM-282振蕩器, ASONE。

2 實驗方法

2.1 提取物的制備

新鮮的全株長白紅景天置于烘箱中， 60 ℃烘 24 h 后，粉碎過 60 目篩。稱取 1.00 g 長白紅景天干粉，加入 20 倍體積 70% 乙醇，于80 ℃ 水浴回流 3 h，過濾，殘渣重復上述操作1次，合并 2 次提取物，轉移至 100 mL 容量瓶中，用 70% 乙醇溶液定容至刻度。

2.2 黃酮含量的測定

蘆丁0.0530 g，置25 mL容量瓶中，用70% 乙醇適量加熱溶解，得濃度為2.12 mg·mL-1對照品溶液。量取對照品溶液0、0. 5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，然后依次加5% 亞硝酸鈉溶液(1.0 mL)， 10% 硝酸鋁溶液(1.0 mL)， 4% 氫氧化鈉溶液(10.0 mL)，最后用 70% 乙醇稀釋至25 mL，置比色皿(2.0 mL)中，在波長510 nm處測定不同濃度的對照品吸光度。用origin軟件作圖，得到回歸方程。長白紅景天提取物2.5 mL，同蘆丁配制方法一樣，在波長510 nm處測定長白紅景天提取物吸光度。通過對照品回歸方程計算出長白紅景天提取物黃酮濃度，從而得到長白紅景天提取物中黃酮含量。

2.3 磁性分離

2.3.1 緩沖溶液配制

pH=3.6緩沖液：0.51 g乙酸鈉，加乙酸2 mL，再加水稀釋至25 mL；pH=8.5緩沖溶液：0.80 g氯化銨溶于水，加176 μL 濃氨水，稀釋至10 mL。

2.3.2 磁性吸附

將MNP-BOH與長白紅景天提取物混合后孵化，進行磁性吸附。2 mL離心管中，加入200 μL長白紅景天提取物，1800 μL MNP-BOH緩沖液，在漩渦振蕩器上振蕩10 min，放置于釹鐵硼強磁磁場中，將清液小心取出，然后用1 mL的乙醇浸洗MNP-BOH，在漩渦振蕩器上振蕩10 min后放置于釹鐵硼強磁磁場中10 min，將清液小心取出，重復2次。

2.3.2 磁性解離

MNP-BOH浸泡在pH=3.6緩沖液(100 μL)，超聲振蕩20 min，70% 乙醇溶液(1900 μL)中，在振蕩器上振蕩30 min，解離與磁性材料特異性吸附的成分，然后放置于釹鐵硼強磁磁場中10 min，清液即為長白紅景天的配體垂釣液。

2.4 DPPH清除率的測定

測定按參考文獻[7]進行，并計算清除率。

3 結果與分析

以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，得到回歸方程為：Y=0.15463+1.10923X，R2=0.9987，線性范圍為0.0424～0.508 mg·mL-1。依據(jù)獲得的回歸方程，計算得到長白紅景天提取物中黃酮含量，結果為 49.6 mg·g-1，如表1 所示。

制備的MNP-BOH平均粒徑為70 nm，飽和磁化強度值為50.6 emu·g-1，具有較強的磁性，滿足磁性分離的磁性要求。

表1 長白紅景天提取物中黃酮濃度

長白紅景天提取物對DPPH清除能力測定結果，如圖1所示。長白紅景天提取物在500 μL(0.248 mg·mL-1)時，清除率達到90.34%，在0～0.248 mg·mL-1范圍內，隨著濃度的增加長白紅景天提取物的DPPH清除率呈現(xiàn)遞增趨勢，高于0.248 mg·mL-1DPPH時，清除率變化不大。

圖1 長白紅景天提取物對DPPH清除率Fig.1 DPPH scavenging rate of Rhodiola angusta Nakai extract

500 μL(0.248 mg·mL-1)長白紅景天提取物，分別使用5、10、15、20和25 mg不同的MNP-BOH用量進行磁性分離、洗脫、垂釣和測試DPPH清除率，對比結果見圖2，從圖2可以看到15 mg磁性材料，能使垂釣液的DPPH清除率的能力達到93.31%，這表明MNP-BOH中硼酸與長白紅景天提取物中的含鄰1,2-OH組分存在選擇吸附作用。

圖2 不同量磁性材料的DPPH清除率Fig.2 DPPH scavenging rate for different amount of magnetic materials

用15 mg MNP-BOH 對250 μL (0.124 mg·mL-1)、500 μL (0.248 mg·mL-1)、750 μL(0.372 mg·mL-1)長白紅景天提取物，進行磁性分離、測試DPPH清除率，結果見圖3。500 μL (0.248 mg·mL-1)長白紅景天提取物，磁性分離前DPPH清除率 92.34%，磁性分離后提取物 DPPH清除率18.09%。磁性分離后的750 μL(0.372 mg·mL-1)長白紅景天提取物的清除率與500 μL (0.248 mg·mL-1)的差別變小，說明MNP-BOH吸附飽和的傾向。

圖3 磁性分離前后的長白紅景天提取物的DPPH清除率Fig.3 DPPH scavenging rate for before and after magnetic separation of Rhodiola angusta Nakai extract

4 結 論

用 70% 乙醇提取長白紅景天，以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定長白紅景天中黃酮含量。長白紅景天提取物對 DPPH 有一定的清除能力，其濃度為 0.248 mg·mL-1時，清除率達到 90.34%，其清除作用隨著濃度的增大而表現(xiàn)出明顯的量效關系。用制備的MNP-BOH比較了長白紅景天提取物的磁性分離前后的 DPPH 清除率變化，結果表明 MNP-BOH 能吸附長白紅景天提取物中的含鄰1,2-羥基組分，吸附物質有待日后下一步的富集和結構解析。