電穿孔法轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的條件優(yōu)化研究

閆東科，許鳳霞，呂平，李冬

（天津職業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津 300350）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)常見的一種女性癌癥。2017年全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌的發(fā)病率高達(dá)30%，排在首位，且乳腺癌的死亡率為14%，僅次于肺癌[1]。在我國(guó)，乳腺癌是導(dǎo)致女性癌癥患者死亡的首要原因[2]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，尋找用于乳腺癌早期診斷和治療的分子靶標(biāo)已成為當(dāng)前乳腺癌研究的熱點(diǎn)。例如，針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epithelial growth factor receptor-2，HER-2）靶標(biāo)的重組人源化單克隆抗體帕妥珠單抗[3]（Pertuzumab，商品名Perjeta，帕捷特），已于2018年12月被我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)上市，用作HER-2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的靶向治療藥物。

而在癌癥治療分子靶標(biāo)研究中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是研究特定基因表達(dá)調(diào)控的重要技術(shù)手段之一。其中，電穿孔法作為一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，具有轉(zhuǎn)染效率高、轉(zhuǎn)染操作程序簡(jiǎn)單、快捷、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、樣本處理量大、無殘留毒性以及適用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，不僅可用于對(duì)干細(xì)胞、原代細(xì)胞、細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染，而且可用于對(duì)類器官、受精卵（胚胎）、活體（離體）組織器官[4]、昆蟲[5]和藻類[6]以及植物種子[7]、花粉、原生質(zhì)體等的轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染是利用高于某一閾值的外加電脈沖刺激細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)重排，形成瞬時(shí)性孔洞，從而使外源生物大分子通過孔洞導(dǎo)入細(xì)胞的過程。也有研究認(rèn)為，電脈沖對(duì)生物大分子與細(xì)胞膜的結(jié)合起促進(jìn)作用，生物大分子是通過細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的[8]。影響電轉(zhuǎn)染效率的因素眾多，不同細(xì)胞系最佳電轉(zhuǎn)染條件也不盡相同。本次實(shí)驗(yàn)以目前常用的乳腺癌細(xì)胞模型人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象，研究電轉(zhuǎn)染時(shí)的電壓、電脈沖時(shí)長(zhǎng)、電脈沖次數(shù)、質(zhì)粒濃度和細(xì)胞傳代時(shí)間對(duì)其電轉(zhuǎn)染效率的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞

pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒購自豐暉生物科技有限公司；大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

無血清培養(yǎng)基Opti-MEM（即電轉(zhuǎn)Buffer）和DMEM培養(yǎng)基均購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購自美國(guó)HyClone公司；牛胰島素購自康朗生物科技（上海）有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司；胰蛋白酶購自美國(guó)Sigma公司；酵母提取物、胰蛋白胨和氯化鈉均購自美國(guó)Oxiod公司；氨芐青霉素購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 主要儀器

電穿孔儀（NEPA21 Super Electroporator）及 2 mm電轉(zhuǎn)杯購自日本 NEPA GENE 公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)、CO2培養(yǎng)箱和高速冷凍離心機(jī)均購自美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自博大博聚科技（深圳）有限公司；恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱購自昕?jī)x儀器儀表（上海）有限公司；恒溫細(xì)菌培養(yǎng)搖床購自圣科儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準(zhǔn)備

利用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將菌體涂布在LB平板（氨芐青霉素濃度為100 μg/mL）上，37 ℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素濃度為100 μg/mL）中，37 ℃恒溫細(xì)菌搖床中培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取擴(kuò)增后的質(zhì)粒。利用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，A260/A280為 1.8～1.9，測(cè)得質(zhì)量濃度為 1.176 μg/μL。

1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

從液氮罐中取出裝有MCF-7細(xì)胞的凍存管，于37 ℃水中搖晃融化，加 4～5 mL DMEM 培養(yǎng)基混勻，1 000 r/min 離心 4 min，棄上清，加 1～2 mL 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于 T25培養(yǎng)瓶中，加含 10% FBS、0.01 mg/mL牛胰島素的 DMEM 培養(yǎng)基 6～8 mL，于 37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液 1次，每2～3 d按1∶4比例傳代1次。

1.2.3 MCF-7細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染

融合度為80%～90%的MCF-7細(xì)胞在經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化完全后，用電轉(zhuǎn)Buffer Opti-MEM重懸細(xì)胞2遍以除去消化終止液中的血清，而后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。NEPA21電穿孔儀（2 mm電轉(zhuǎn)杯）懸浮電轉(zhuǎn)時(shí)，要求100 μL的電轉(zhuǎn)混合液中細(xì)胞數(shù)量不低于106個(gè)，質(zhì)粒質(zhì)量不少于10 μg。電轉(zhuǎn)染時(shí)，將裝有電轉(zhuǎn)混合液的電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)杯腔，按下“Ω”鍵測(cè)定電阻值（應(yīng)處于30～50 Ω），按下“start”鍵執(zhí)行電轉(zhuǎn)程序，每組電轉(zhuǎn)程序重復(fù)3次。電轉(zhuǎn)完成后，細(xì)胞轉(zhuǎn)入預(yù)熱的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察EGFP表達(dá)情況，計(jì)算電轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 電轉(zhuǎn)染效率觀察

每組轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化收集，制成相同體積的細(xì)胞懸液，于熒光顯微鏡下固定1個(gè)視野計(jì)算出可見光下細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)換為熒光光源，計(jì)算出發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，按公式1計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 不同條件對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

分別在不同電壓（100 V、125 V、150 V、175 V、200 V）、不同電脈沖次數(shù)（1～4次）、不同電脈沖時(shí)長(zhǎng)（2.5 ms、5.0 ms、7.5 ms）、不同質(zhì)粒濃度（0.377 μg /μL、0.565 μg/μL、0.778 μg/μL、0.985 μg/μL、1.176 μg/μL）、不同細(xì)胞狀態(tài)（傳代后 0 h、24 h、48 h、72 h）條件下對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，分別計(jì)算細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 19.0軟件對(duì)轉(zhuǎn)染效率數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相同條件下每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有組間數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 電壓對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)電脈沖次數(shù)為2次，電脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL，按照表1中的電壓值進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。由單因素方差分析可知，150 V電壓條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率為66.20%±2.48%；從圖1中可觀察出電壓自100 V增加至150 V時(shí)，轉(zhuǎn)染效率呈遞增趨勢(shì)，但當(dāng)電壓升高至200 V時(shí)，由獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析可知，轉(zhuǎn)染效率顯著降低（P＜0.05）。

當(dāng)電壓自100 V增加至150 V時(shí)，細(xì)胞膜上形成的瞬時(shí)性孔洞不斷增多，MCF-7細(xì)胞獲取外源質(zhì)粒DNA的量不斷增大，但當(dāng)電壓升至175 V和200 V時(shí)，電脈沖對(duì)細(xì)胞的損傷程度較大，細(xì)胞死亡率上升，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)染效率下降，從而使MCF-7細(xì)胞在150V時(shí)具有最大轉(zhuǎn)染效率為（66.20±2.48）%。

表1 不同電壓條件下人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖1 不同電壓條件對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.2 質(zhì)粒濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)電脈沖次數(shù)為2次，電脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms，電壓值為150 V，按照表2中的質(zhì)粒濃度進(jìn)行電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。由單因素方差分析可知，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率為66.20%±2.48%；從圖2中可觀察出隨著質(zhì)粒濃度的不斷提高（0.377～0.985 μg/μL），轉(zhuǎn)染效率相應(yīng)提高，但當(dāng)質(zhì)粒濃度為1 μg/μL左右（0.985～1.176μg/μL）時(shí)，由獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析可知，質(zhì)粒濃度的變化對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響不顯著（P＞0.05），提示電轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒濃度存在飽和性問題，1 μg/μL很可能是其閾濃度。

表2 不同質(zhì)粒濃度條件下人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖2 不同質(zhì)粒濃度條件對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.3 電脈沖次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)電脈沖時(shí)長(zhǎng)為 5 ms，質(zhì)粒濃度為 1.176 μg/μL，電壓值為150 V，按照表3中的電脈沖次數(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。由單因素方差分析可知，脈沖次數(shù)為2次時(shí)獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖3和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果可知，脈沖次數(shù)為2時(shí)與1次及3次時(shí)的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表3 不同脈沖次數(shù)條件下人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖3 不同脈沖次數(shù)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.4 電脈沖時(shí)長(zhǎng)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)電脈沖次數(shù)為2，質(zhì)粒濃度為1.176 μg/μL，電壓值為150 V，按照表4中的電脈沖時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。由單因素方差分析可知，脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖4和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果可知，脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms時(shí)與2.5 ms及7.5 ms時(shí)的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

電脈沖時(shí)長(zhǎng)過短或電脈沖次數(shù)過少，細(xì)胞膜上無法形成或形成的瞬時(shí)孔洞不足，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下；電脈沖持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)或電脈沖次數(shù)過多，電穿孔時(shí)產(chǎn)生熱量過多，細(xì)胞死亡率升高或后續(xù)培養(yǎng)時(shí)失去生物學(xué)功能。電脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms，脈沖數(shù)為2次時(shí)，電轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞可獲得最大轉(zhuǎn)染效率。

表4 不同脈沖時(shí)長(zhǎng)下人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖4 不同脈沖時(shí)長(zhǎng)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

2.5 細(xì)胞狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)電脈沖次數(shù)為2，脈沖時(shí)長(zhǎng)為5 ms，質(zhì)粒濃度為 1.176 μg/μL，電壓值為 150 V，按照表5中的細(xì)胞傳代后培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。由單因素方差分析可知，傳代時(shí)間為24 h條件下獲得最大轉(zhuǎn)染效率66.20%±2.48%；由圖5和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果可知，傳代時(shí)間為24 h時(shí)與48 h及72 h時(shí)的轉(zhuǎn)染效率差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表5 不同細(xì)胞狀態(tài)下人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的電轉(zhuǎn)染率

圖5 不同細(xì)胞狀態(tài)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7電轉(zhuǎn)染效率的影響

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在電壓150 V、質(zhì)粒濃度1 μg/μL左右、脈沖數(shù)2次、脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms、傳代時(shí)間 24 h時(shí)，電穿孔人乳腺癌細(xì)胞MCF-7可獲得最大轉(zhuǎn)染效率。本研究通過優(yōu)化MCF-7細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染條件，顯著提高了MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，為MCF-7細(xì)胞株的相關(guān)基礎(chǔ)研究和乳腺癌臨床靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)參數(shù)。