石油污染土壤的微生物修復(fù)研究進展*

胡永揚，劉沙沙，翁丹宜，陳顯宇，張潔瑩

(肇慶學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

隨著經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，有著“黑色黃金”美稱的石油已經(jīng)逐漸成為了當(dāng)今世界必不可少的能源，被廣泛的應(yīng)用于各行各業(yè)，關(guān)系著我國國民經(jīng)濟的發(fā)展[1]。但由于技術(shù)水平等多種原因受限，在石油開采、運輸、加工當(dāng)中，會不可避免的發(fā)生泄漏，一旦石油泄漏到環(huán)境之中，會給環(huán)境造成巨大的危害。當(dāng)石油進入土壤環(huán)境中時，會造成土壤的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)組成方面發(fā)生改變，進而直接或間接地影響農(nóng)作物的生理過程[2]，而且石油烴類中含有某些致癌物質(zhì)還可通過食物鏈的富集作用進入人體，危害人類健康，因而修復(fù)石油受污土壤變得刻不容緩。

單獨依靠土壤本身的自然修復(fù)是十分緩慢的，修復(fù)周期長，修復(fù)效果也不盡人意[3]。所以目前可以依靠的修復(fù)方法有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)及聯(lián)合修復(fù)等四種[4]。在早期的修復(fù)中多采用物理及化學(xué)方法，雖然具有周期短、見效快的特點，但大多都具有對環(huán)境造成二次污染，成本高昂等弊端[5]。而相比于物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)而言，生物修復(fù)具有成本低、無二次污染、不破壞土壤環(huán)境、處理效果好等特點[6]，憑借這些優(yōu)異的特性，生物修復(fù)逐漸成為研究熱點。微生物修復(fù)法則是整個生物修復(fù)中最重要的組成，微生物能將石油烴類有機污染物作為自身生長繁殖的碳源，在降低石油烴類污染物的含量的同時，產(chǎn)生新的降解菌，最終將土壤中的石油烴含量下降到不至于危害環(huán)境的可接受地步或是徹底轉(zhuǎn)化為無毒無害的物質(zhì)[7]。由此可見，微生物修復(fù)技術(shù)是一種符合綠色發(fā)展的修復(fù)方式，并且逐漸成為近幾年在此方面的發(fā)展重點，備受青睞。本文總結(jié)和梳理了微生物處理技術(shù)以及影響微生物修復(fù)的因素等方面內(nèi)容，并展望了該領(lǐng)域的研究進展。

1 環(huán)境中降解石油的微生物

微生物具有種類多、分布廣、個體小、繁殖快、比表面積大、容易變異的特點，并且其內(nèi)具有的降解酶體系可通過氧化還原、脫羧、脫氨、水解、脫水等各種化學(xué)作用來更高效的降解石油以及利用物質(zhì)能量，因此微生物治理環(huán)境污染成為了當(dāng)前研究的熱點。在自然中可以降解石油烴類化合物的微生物約有100多個屬、200多種，其中包括細菌、放線菌、真菌等微生物均可使石油烴類化合物得到降解，而在土壤治理中發(fā)揮著主要作用是細菌和真菌。土壤中常見的細菌降解種群有：假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)和分支桿菌屬(Mycobacterium)；其中應(yīng)用最為廣泛的是假單胞菌屬，它對烷烴和芳香烴類物質(zhì)均具有較好的降解效果[8]。常見的真菌降解種群數(shù)有：紅酵母屬(Rhodotorula)、假絲酵母屬(Candida)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)；其中研究最多的是假絲酵母，它對營養(yǎng)要求較低，生長繁殖速度快且具有較高降解效果[9]。

2 微生物修復(fù)技術(shù)

2.1 生物培養(yǎng)

生物培養(yǎng)法又稱為生物刺激法，其菌株來源為土著微生物，是指在石油受污土壤中添加某些微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)元素：如N、P等，或是加入氧氣或H2O2作為電子受體、表面活性劑等，同時為土著菌群提供適宜的代謝條件[10]。通過以上的方法來提高土著微生物的代謝活性，從而提高土著微生物的降解能力，使得土壤中的有機污染物能被徹底轉(zhuǎn)化為無毒無害的物質(zhì)。

在長期與石油烴類污染物的接觸中，土壤中原本具有一定石油降解能力的微生物成為優(yōu)勢菌種，而其他土著微生物則能逐漸適應(yīng)環(huán)境中的改變，進行有利于自身生存的選擇性改變，改變其遺傳特性，使后代得以生存。研究表明：在沒有受到石油污染的情況下，土壤中僅有1%的菌群可以降解石油中的烴類化合物，但是在長期受到石油污染的環(huán)境中，這一比例可以提升到10%[11]。土著微生物的優(yōu)點能夠很好的適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境中的改變，具有巨大的降解潛力，但缺點就是土著微生物的生長速度慢，代謝活力差[12]。因而生物培養(yǎng)法能夠刺激土壤中的土著微生物的代謝活力，使其更好更快的降解石油烴類污染物。目前，大部分的生物修復(fù)也都是利用土著微生物進行修復(fù)，外接微生物在進入土壤環(huán)境中難以保持生物活性，且會受到土著微生物的競爭作用，只有在土著微生物無法有效降解微生物的情況下，才會考慮接入外源微生物[13]。

2.2 生物通風(fēng)

生物通風(fēng)技術(shù)(BV)是在土壤氣相抽提技術(shù)(SVE)為基礎(chǔ)衍生出來的一種原位修復(fù)技術(shù)。BV實際上是生物增強式SVE技術(shù)，通過將SVE和生物降解相結(jié)合，通入空氣至污染區(qū)域，提高降解菌活性，去除土壤中揮發(fā)性有機物的一種方法[14]。生物通風(fēng)技術(shù)具有以下優(yōu)點：對影響環(huán)境較少，作為原位修復(fù)不需要太大的擾動且設(shè)備簡便易行，效率較高，無尾氣處理，相較于SVE所使用的成本較低。同時該技術(shù)也能修復(fù)低滲透性、高含水率的土壤；環(huán)境副作用小，BV的最終產(chǎn)物是二氧化碳、水和脂肪酸，如果中間產(chǎn)物為污染物，可在出口處安裝氣體凈化裝置以避免二次污染[15]，應(yīng)用范圍較寬，既能用于處理揮發(fā)組分，也能處理半揮發(fā)組分和重組分有機物，且重質(zhì)組分處理效果更為明顯[16]；操作靈活簡易，可采取一些強化措施促進微生物的修復(fù)效果，如給土壤注入純氧氣、升高土壤溫度和在通入空氣添加營養(yǎng)物質(zhì)(N、P)、添加表面活性劑或工程菌等，也可以使用間歇式通風(fēng)的方式來增強處理效果[17]。生物通風(fēng)技術(shù)是繼土壤氣相抽提技術(shù)后土壤原位修復(fù)的又一革新技術(shù)，將物理方法與生物處理兩種方法相結(jié)合，能取得更加高效的處理效果。但是該法也存在一定的局限性，對于在二惡英、殺蟲劑和多氯聯(lián)苯等有機污染物的土壤修復(fù)，或黏土含量高，濕度大等土壤通透性差的土壤修復(fù)中，就不宜采用[18]。

2.3 固定化微生物技術(shù)

固定化微生物技術(shù)是指通過物理或化學(xué)的方法，將環(huán)境中分散、游離的微生物固定在適當(dāng)?shù)妮d體中，使其保持一定的生物活性以及提高生物細胞濃度，加快細胞繁殖，并將其反復(fù)利用的一種方法[19]。固定化微生物具有以下優(yōu)點：固定化載體為微生物提供一個良好的環(huán)境，抵抗外界的不利條件的影響，如：毒害物，人為干擾，環(huán)境因素以及與土著菌種競爭等，使微生物相比于游離狀態(tài)下具有更高的穩(wěn)定性和生存能力。不僅如此，高密集的細胞可以長期保持活性，可供反復(fù)利用，能有效的降解石油的同時減少成本消耗[20]。近年來，固定化微生物技術(shù)廣泛應(yīng)用于廢水，污泥，污染土壤的治理，具有很好的發(fā)展前景[21-23]。但固定化微生物技術(shù)也具有一定的局限性，固定化微生物載體在環(huán)境中有著難以回收的問題，這將會給環(huán)境帶來一定的危害。另外，一些成分復(fù)雜的載體材料會對降解石油物質(zhì)機理的分析帶來影響。因此，在今后的研究中探尋合適的、固定化效果好的、對環(huán)境友好的載體以及分析載體、微生物與石油物質(zhì)的相互作用成為目前主要的研究方向。

3 微生物修復(fù)石油污染土壤的影響因素

3.1 微生物的種類與菌群的影響

不同種屬的微生物對石油烴的降解效果都不同，一般每種微生物只對石油烴中某種特定的成分降解能力較強，如劉俊[24]所研究表明，白腐真菌對多環(huán)芳烴菲、蒽和熒蒽降解，在初始pH為5.0、體系溫度為30 ℃、菲、蒽和熒蒽分別為10 mg/L，培養(yǎng)15 d，菲、蒽和熒蒽的降解率分別達到95.7%、85.7%和72.9%。而田秀梅等[25]篩選、分離出的一株YQJ-1醋酸鈣不動桿菌，在pH為8.0、溫度為35 ℃時，對C11～C25的短鏈烷烴的平均降解率達到87.84%，然而對C26～C37的長鏈烷烴降解效果并不高。為此改變微生物的種群結(jié)構(gòu)有利于提高石油的降解效果，如李樂等[26]研究表明，由所分離的三株菌株：LD3鏈球菌屬(降解范圍：C19～C39)、LD7葡萄球菌屬(降解范圍：C21～C39)、W6微球菌屬(降解范圍：C13～C18)，組合成復(fù)合菌劑，在溫度30 ℃、pH為7.0，其降解率高達92.06%，相比于單菌株降解有更好的效果，避免了單菌株降解范圍限制和降解效率低的缺點，充分結(jié)合了各菌株降解優(yōu)勢。因此接種復(fù)合菌劑，混合的微生物群落和構(gòu)建微生物菌群，通過其間的生物協(xié)同作用，能更加完全的降解石油。

3.2 環(huán)境因素對石油生物降解的影響

3.2.1 供氧量

不同種類的微生物對石油烴的分解隨著烴類的不同而發(fā)生變化，但所有的微生物降解石油烴的起始反應(yīng)都是相似的，在有氧的條件下，微生物菌群通過協(xié)同作用，集合多種酶促反應(yīng)[27]，催化氧氣與基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生一種含氧的中間產(chǎn)物。試驗表明[28]，在有氧的條件時，烴類經(jīng)微生物降解14 d的降解率可達20%，但在厭氧條件下，經(jīng)過233 d卻只能降解不到5%。而且氧氣含量是否充足也是成為制約著微生物降解石油烴類污染物的限制條件之一，有氧時降解速率會更快，因此通常要求降解過程中氧氣要保持充足，如果分子氧不足就會導(dǎo)致降解過程缺少受氫體，從而影響微生物的正常生長[29]。因此，在微生物修復(fù)石油污染土壤時，供氧量也會直接影響微生物的降解速率，在實際的生物修復(fù)運用實例中，可通過生物通風(fēng)法，為微生物提供充分的氧氣，以保障正常的生物降解。

3.2.2 石油烴濃度

由于所處實際的污染環(huán)境不同，石油污染土壤中的石油烴組成，含量也就各不相同。石油烴濃度的不同將會影響微生物降解石油的速率，過高的石油烴濃度將會對微生物產(chǎn)生毒害作用，阻礙微生物的代謝活性，甚至?xí)斐晌⑸锏乃劳?，過高的石油濃度也會使N、P等營養(yǎng)的缺乏，不利于微生物的降解[30]。甄麗莎[31]分別設(shè)置了5000 mg/kg、10000 mg/kg和50000 mg/kg的三個不同濃度的石油污染土壤來探討不同石油濃度對微生物修復(fù)石油受污土壤的影響，結(jié)果表明前21天累計的石油降解率分別為總降解率的91.08%、88.37%和74.67%，說明初始的土壤含油量越高，微生物修復(fù)越緩慢。此外，過低的石油濃度會使得微生物缺乏酶的誘導(dǎo)，體內(nèi)完成反應(yīng)的機制不適合低濃度污染物的降解，且在不合適的物質(zhì)供應(yīng)條件下也會喪失其基本的生存能力[32]，也會成為微生物降解的限制條件之一。在極端的石油烴濃度下，土壤不再適合進行生物修復(fù)，需要對土壤進行相應(yīng)的預(yù)處理，使石油烴濃度下降到適合微生物修復(fù)的范圍，更加利于微生物修復(fù)污染土壤，增大降解速率。

3.2.3 營養(yǎng)元素

微生物的代謝離不開營養(yǎng)物質(zhì)的參與，而微生物修復(fù)石油污染的一個重要限制條件也是營養(yǎng)元素。由于石油受污土壤常常含有過高的碳源，從而導(dǎo)致土壤中的營養(yǎng)元素相對缺乏[33]，缺乏N、P等營養(yǎng)元素也將會抑制微生物降解石油烴，直接降低微生物修復(fù)土壤的速度，王艷杰等[34]在僅添加營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，經(jīng)過90 d的修復(fù)周期，總石油烴的去除率達到27.44%，顯著高于對照組的總石油烴去除率16.15%。此外，還有另一個重要的因素則是營養(yǎng)元素的添加比例，營養(yǎng)元素是否能做到持續(xù)供給等都對微生物的降解速度產(chǎn)生明顯影響。白云[35]在對其添加的外源菌種黃孢原毛平革菌的營養(yǎng)比例探究中，在四組營養(yǎng)配比的對比中，C:N≤10的兩組降解率比C:N≥10的兩組降解率高，說明不同的營養(yǎng)配比對微生物的降解率也會有一定的影響。而且有研究表明，在不同的降解時期內(nèi)，碳氮磷比對石油中各組份的降解速率影響不同。在降解初期，較低的碳氮磷比的降解啟動時間短，氮磷的消耗和降解速率較快，而在降解后期，碳氮磷比對降解速率的影響反而不是很明顯[36]。所以在實際修復(fù)過程中根據(jù)環(huán)境中的石油污染程度投加適當(dāng)?shù)奈⑸锼锠I養(yǎng)元素，找出適宜微生物降解的營養(yǎng)元素添加比例，會使得降解速度得到明顯提高。

3.3 表面活性劑對石油生物降解的影響

表面活性劑是具有親水基和疏水基且分別能與水相和油相結(jié)合，能夠顯著降低油水界面張力和提高石油烴在溶劑中的溶解度的一類物質(zhì)[37]。但考慮到環(huán)境修復(fù)要求修復(fù)材料無二次污染的問題，那么生物表面活性劑則因其具有環(huán)境兼容性，即無毒、能夠被生物完全降解、不對環(huán)境造成污染，并且具有選擇性好、用量少等優(yōu)點[38]，在如今的石油烴污染微生物修復(fù)中得到了更廣泛的應(yīng)用。當(dāng)表面活性劑進入土壤后，表面活性劑就會吸附在土壤顆粒表面上，降低土壤表面張力，使水相與土壤固相充分接觸。隨著濃度的增加，表面活性劑分子會吸附在土壤表面上形成膠束，此時，不溶于水的石油烴類物質(zhì)通過增溶作用逐漸從土壤中脫離到膠束中，從而促進了石油烴與微生物的接觸。并且，生物表面活性劑具有可生物降解性，為降解菌提供營養(yǎng)物質(zhì)起到生物刺激的作用，協(xié)助土著或外源微生物進行修復(fù)，進而提高了降解效果[39-41]。Saeki[42]研究表明，利用生物表面活性劑生產(chǎn)的菌株JE1058制劑制成粉劑應(yīng)用于海洋石油泄漏的生物修復(fù)，結(jié)果表面其不僅可以大大的促進油污的溶解，同時還可以促進海洋本土菌ANS21對油污的降解。孫雨希等[43]研究表明，通過篩選出的O-1短小芽孢桿菌屬與 O-2威尼斯不動桿菌，配制成混合菌O-H修復(fù)含油污泥，添加槐糖脂生物表面活性劑，24 d戶外修復(fù)周期內(nèi)，石油降解率達到40.1%，較僅有土著菌修復(fù)提高了35.0%，異養(yǎng)菌群總數(shù)提高了350倍。因此在微生修復(fù)過程中，加入生物表面活性劑不僅可促進微生物與石油烴接觸，還通過生物刺激的作用，提高了生物的可利用性，從而提高石油降解的效果。

3.4 固定化載體種類對石油生物降解的影響

固定化載體材料的種類有很多，分為四種：無機載體材料、天然有機載體材料、合成高分子材料以及復(fù)合載體材料[44]。不同載體材料與降解菌結(jié)合成的固定化菌劑，其降解效果各不相同。主要是因為載體材料與微生物之間的協(xié)同機理不同：有的載體材料對石油烴的吸附能力較強，使得固定化菌能夠與之充分接觸，形成吸附-生物降解協(xié)同作用，從而提高了降解的效果。如田秀梅等[45]用乙酸改性苧麻纖維固定醋酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、威尼斯不動桿菌、紅球菌組合成混合菌劑。7 d后與游離菌相比，固定化菌劑對烷烴的降解率為86.08%，其中短鏈烷烴(C12～C20)降解效果最佳為94.85%，而游離菌僅為67.86%。這是由于乙酸改性苧麻纖維的親油疏水性，增加了對烷烴吸附，起到了富集效果，而短鏈烷烴更容易被降解菌攝取，進而提高了短鏈烴的降解效果。而有的載體材料孔隙率較大，增加了氧氣流動，其內(nèi)布滿菌絲，形成生物刺激-生物強化與真菌-細菌協(xié)同作用，提高了微生物活性，從而提高降解效果。如張博凡等[46]用菌糠作為固定化載體，固定微桿菌屬Q(mào)2，修復(fù)45 d后，菌糠固定化菌劑降解率可達63.05%，高出游離菌22.05%的降解效果。在富集吸附石油烴物質(zhì)的同時，還起到了細菌-真菌強化修復(fù)的效果。另外，為取得更好的降解效果，應(yīng)當(dāng)選擇適合的載體材料，如王智[47]所研究表明，在相同的受試菌群YJ01與相同條件下，活性炭與苧麻對石油烴某組分降解效果不同，主要體現(xiàn)為活性炭固定化菌群對石油烴中高碳數(shù)烷烴的降解效果較好，降解率可達58.64%，而苧麻固定化菌群對石油烴中中碳數(shù)烷烴降解效果較好，降解率可達93.10%。因此，選擇合適的載體材料或使用復(fù)合載體材料，可提高微生物降解石油的效果。

4 結(jié) 語

隨著我國石油產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，石油的需求量正逐年上升，伴隨其產(chǎn)生的石油污染問題也越來越嚴重。因此，為解決石油污染問題而出現(xiàn)的一種有效手段——微生物修復(fù)技術(shù)。雖然，微生物修復(fù)技術(shù)由于其高效，無污染，低成本等優(yōu)點已得到廣泛應(yīng)用，但目前仍然存在著許多問題。本文探討了生物培養(yǎng)、生物通風(fēng)、固定化微生物技術(shù)三種修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用以及幾個微生物修復(fù)石油污染的影響因素，為提高微生物修復(fù)對石油污染的處理效果，以下幾個方面還需要我們更進一步研究：

(1)完善工藝技術(shù)，優(yōu)化工藝流程降低成本，運用多種技術(shù)聯(lián)用提高降解效果；

(2)篩選、馴化，并構(gòu)建降解效果更加好的微生物菌群；

(3)深入研究微生物降解石油烴的機理，根據(jù)影響因素合理調(diào)控，作為提高降解效果的客觀保證；

(4)降低生物表面活性劑的生產(chǎn)成本，以及開發(fā)更具經(jīng)濟效益的生物表面活性，從而降低修復(fù)成本；

(5)開發(fā)更高強度，更具有生物相容性且環(huán)境友好的固定化載體材料，使固定化微生技術(shù)得到更加廣泛的應(yīng)用；

(6)綜合利用各種修復(fù)技術(shù)，將環(huán)境與修復(fù)技術(shù)相結(jié)合，制定合理的治理方針，使石油污染問題達到更科學(xué)、更經(jīng)濟、更有效的解決。