付人杰，戚 進，余伯陽

(中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198)

中醫(yī)藥學是兩千多年臨床實踐經(jīng)驗的總結(jié)，其理論體系完整，具有深厚的歷史積淀與深刻的臨床價值。但由于中醫(yī)藥學的理論體系蘊含著我國古代樸素的哲學觀，其含義古樸深奧，很難為現(xiàn)代醫(yī)學體系所理解[1]。如何實現(xiàn)中醫(yī)藥的國際化是目前中藥現(xiàn)代化進程中的重要課題。為使中藥及其制劑為國際醫(yī)藥市場所接受，使中醫(yī)藥學具有現(xiàn)代科學理論支撐，基于中藥藥效活性成分的中藥現(xiàn)代化研究已成為一項長期戰(zhàn)略部署[2]。我國國土幅員遼闊，蘊藏著豐富的天然藥物資源，天然藥物成分具有骨架多樣，活性廣泛，高效低毒等特點，因此從中尋找和開發(fā)新藥已經(jīng)成為現(xiàn)代新藥研發(fā)的主導(dǎo)策略[3]。然而中藥和天然藥物具有復(fù)雜次生代謝產(chǎn)物，并且藥效物質(zhì)基礎(chǔ)模糊，這增加了從中發(fā)現(xiàn)和尋找新藥的難度[4]。近年來一些從復(fù)雜體系中發(fā)現(xiàn)和尋找活性成分的快速遴選方法已經(jīng)迅速發(fā)展起來，本文對此進行綜述，以期為天然來源藥物活性成分遴選提供理論支撐和科學數(shù)據(jù)。

1 基于系統(tǒng)生物學的遴選技術(shù)

系統(tǒng)生物學是借助于實驗、計算方法與系統(tǒng)論相整合，來研究生物系統(tǒng)的組成以及相互之間動態(tài)變化關(guān)系的學科[5]。其整體化思想，與中醫(yī)藥的“整體觀”、“辯證觀”、“動態(tài)觀”完美契合。

1.1 代謝組學

代謝組學是探究生物體系受到外界刺激后其內(nèi)源代謝物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學，可以從整體水平反映疾病治療過程中的小分子代謝物的動態(tài)變化[6]。常采用1H-NMR，13C-NMR，HPLC-MS等技術(shù)，對實驗動物的尿液、血清、血漿、組織、細胞及細胞內(nèi)成分等樣本進行綜合檢測[7]。目前代謝組學發(fā)展到更為精準的分析，對于細胞器代謝物的分析研究越發(fā)多樣化，由于反向液相色譜不利于極性及離子性代謝成分的檢測，陰離子交換色譜以及多色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法相繼被開發(fā)用于復(fù)雜代謝產(chǎn)物的分析鑒定[8]。將靶向和非靶向技術(shù)的優(yōu)點相結(jié)合，憑借新方法良好的分辨率和特異性，舒一崧等基于非靶向代謝組學技術(shù)，借助UHPLC-QE Orbitrap HRMS利用譜圖匹配、碎片掃描、同為素識別等方法將目標聚焦到柑橘類中藥枳實及細胞色素P450，進一步探究其對化學誘導(dǎo)肝損傷的保護作用[9]。

1.2 蛋白質(zhì)組學

化學蛋白質(zhì)組學已成為藥物發(fā)現(xiàn)過程中表型遴選必不可少的手段[10]。Dai等[11]結(jié)合SILAC定量蛋白質(zhì)組學，對黃芩苷(baicalin)給藥后HeLa細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的BP結(jié)合含量進行分析，聯(lián)合生物信息對比分析后，聚焦到對baicalin不敏感的siCPT1A，隨后進行體外酶學實驗驗證，黃芩苷通過激活CPT1A，加速脂肪酸降解。蛋白質(zhì)組學優(yōu)越性在于能夠進行多靶點、高通量遴選，但在測定多種有機成分時不準確，會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，核酸大分子也會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，蛋白酶消化后，基于肽的蛋白質(zhì)組學可能會錯過全長天然蛋白質(zhì)中存在的關(guān)鍵信息。

1.3 基因組及轉(zhuǎn)錄組學

基因組學及轉(zhuǎn)錄組學研究依托的基因芯片技術(shù)，其原理是將特定的寡聚核苷酸序列或cDNA片段固定于基片上，基于mRNA可能與特定基因的固定化靶序列的高密度陣列雜交，定性或定量檢測雜交信號以獲取相關(guān)的生物學信息[12]?；蛐酒梢詫崿F(xiàn)微量化、高內(nèi)涵、高通量的遴選研究，為藥物作用發(fā)現(xiàn)新的靶標，也為新藥遴選及研發(fā)提供新策略。其優(yōu)勢在于在單次實驗過程中，可以對基因進行高通量分析，具有快速、高特異性的優(yōu)越性[13]。周威等人依據(jù)人頸動脈正常組織及粥樣硬化和的基因表達數(shù)據(jù)，遴選出差異基因，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸中有10個成分與藥物分子結(jié)構(gòu)相似[14]。但基因芯片技術(shù)由于配套設(shè)施昂貴，獲得的結(jié)果存在假陽性、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、分析泛圍狹窄，限制了其應(yīng)用。

2 基于靶標的遴選技術(shù)

藥靶是指在疾病的病理過程中發(fā)揮某種作用的生物大分子，某種疾病的靶標被確認后，便可基于此來進行藥物遴選。早期藥物研發(fā)多以病原微生物為靶標，進而發(fā)現(xiàn)了抗生素，隨著研究水平不斷深入，分子生物學技術(shù)蓬勃發(fā)展，大量與疾病相關(guān)的受體和酶被發(fā)現(xiàn)，使藥靶的發(fā)現(xiàn)上升到分子水平[15]。因此基于受體-配體之間的親和作用，基于靶分子與配體結(jié)合的原理，從復(fù)雜體系中分離潛在配體的垂釣技術(shù)得到不斷革新[16]。目前該領(lǐng)域的技術(shù)如生物色譜，毛細管電泳，親和超濾，平衡透析，微透析和磁性納米垂釣等均廣泛應(yīng)用于中藥活性成分遴選[17]。

2.1 親和超濾法

親和超濾是基于受體與配體特異性地結(jié)合的特性，將具有潛在配體的復(fù)雜體系與靶標大分子混合后，利用超濾膜對不同大小物質(zhì)選擇透過性，截留有親和作用的配體，將截留下來的復(fù)合物通過使靶標大分子變性的方法，釋放出結(jié)合的配體[18]。親和超濾法應(yīng)用范廣，設(shè)備低廉，操作簡單，具有新穎性、高特異性和普適性，方法不足之處在于由小分子與超濾膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生假陽性結(jié)果[19]。本課題組將親和超濾質(zhì)譜法與在線清除自由基檢測技術(shù)相結(jié)合，同時對梔子中的MPO抑制劑和次氯酸清除劑進行遴選研究得到藏紅花酸衍生物作為梔子中MPO抑制劑，發(fā)現(xiàn)清除次氯酸的有效成分為喹啉酸衍生物及環(huán)烯醚萜苷類成分[20]。

2.2 平衡透析法

將靶標與配體溶液利用透析膜分隔開，建立濃度梯度，小分子以擴散壓為動力，穿過透析膜與靶標大分子結(jié)合，平衡透析法無法直接準確檢測與靶標結(jié)合的小分子，但通過檢測未結(jié)合的小分子含量，可測定結(jié)合的配體數(shù)量[21]。該方法操作簡便、裝置價格低廉、結(jié)果直觀。高迪等[22]采用平衡透析法，利用脂質(zhì)體生物膜遴選中成藥脊痛寧片中的活性成分，發(fā)現(xiàn)了9個活性成分。但此方法不足之處在于獲取結(jié)果單一，低通量，需要色譜、光譜技術(shù)和熱力學分析等方法進行輔助解析。

2.3 毛細管電泳法(CE)

目前毛細管電泳法已成為一種通用、有效的微量分離技術(shù)[23]。該法操作簡單，樣品消耗少，分析時間短。Li等[24]報道了用CE結(jié)合HPLC-MS/MS遴選天然產(chǎn)物中表皮生長因子受體抑制劑的方法，對39種天然產(chǎn)物進行了研究。但毛細管電泳法檢測小分子時不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差。

2.4 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器是模擬酶或其它微生物的功能，在體外進行生化反應(yīng)的裝置[25]。Zhao等[26]利用三維細胞生物反應(yīng)器結(jié)合高效液相色譜-光譜法培養(yǎng)3D細胞生物反應(yīng)器遴選朱砂七提取物中的生物活性成分。但生物反應(yīng)器的不足之處在于其制作費時費力，尚無標準化，商品化。

2.5 生物色譜技術(shù)

生物色譜技術(shù)是將生物活性材料如受體、酶、細胞膜或細胞等與色譜載體固著后作為固定相，利用活性成分與靶標特異性結(jié)合的原理，結(jié)合色譜技術(shù)的分離特點發(fā)展而成的新型活性成分遴選技術(shù)[27]。生物色譜法已成功應(yīng)用于中藥活性成分的發(fā)現(xiàn)研究中[28]。Chen等[29]比較了用脂質(zhì)體膜、紅細胞膜和心肌細胞膜與丹參化合物相互作用前后色譜圖，鑒定出12種可滲透的丹參化合物并證明其具有生物活性。生物色譜技術(shù)可以從復(fù)雜基質(zhì)中進行活性成分的遴選，分離和闡明活性成分的結(jié)構(gòu)[30]。該法不足之處在于色譜柱制備成本高、壽命短、傳質(zhì)限制、活性降低、無法模擬人體環(huán)境因此而導(dǎo)致活性成分的漏遴[27]。

2.6 磁性配體垂釣

在配體垂釣的研究領(lǐng)域，配體垂釣效果隨著垂釣材料的發(fā)展不斷進步革新。目前研究最集中、應(yīng)用最廣泛的配體垂釣材料就是磁性材料。依據(jù)磁性顆粒的大小可分為磁性納米粒子和普通磁性材料。磁性納米粒子在磁性材料中有著的獨特的優(yōu)勢：超順磁性，這得益于磁性納米顆粒納米級別的粒徑，因此便于表面修飾來鍵合用于垂釣的靶標大分子，一般通過共價鍵來鍵合諸如酶、受體、抗原等靶標大分子[31]。Sileshi G Wubshet等[32]提出了一種生物分析平臺，結(jié)合磁性配體捕獲α-葡萄糖苷酶抑制譜和HPLC-HRMS-SPE-NMR，用于直接從粗植物提取物中鑒定α-葡萄糖苷酶抑制配體，成功鑒定了楊梅素3-O-α-L-鼠李糖苷，楊梅素，槲皮素和山奈酚作為α-葡糖苷酶抑制配體。然而除了酶這類生物大分子之外，有研究者利用磁性納米粒子上固定細胞膜的方法來進行配體垂釣。Tang等[33]首次將細胞膜包被的磁珠用于配體垂釣，利用紅細胞膜包被的磁珠從天然產(chǎn)物檢測潛在的活性成分，例如歐前胡素。

2.7 分子對接

鎖鑰模型和誘導(dǎo)契合學說是分子對接的基本原理，前者基于受體配體均為剛性結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，后者基于受體配體均為柔性結(jié)構(gòu)，對接結(jié)果更加準確[34]。分子對接的方法分為剛體對接、半柔體對接及柔體對接，藥物發(fā)現(xiàn)過程中利用該方法完成姿勢預(yù)測，虛擬遴選和結(jié)合親和力估計的目的[35]。

目前，分子對接已廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的遴選中。中藥化學數(shù)據(jù)庫(TCMD)和中國天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(CNPD)已被成功開發(fā)并應(yīng)用于先導(dǎo)化合物的設(shè)計，成為虛擬遴選的可靠武器[36]。Gao等[37]基于多受體-配體復(fù)合物的實驗結(jié)合結(jié)構(gòu)建立了基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)抑制劑的藥效團模型，結(jié)合藥效團模型與分子對接進行虛擬遴選，從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)四種新型MMP-9抑制劑。該技術(shù)目前也被應(yīng)用于復(fù)方的活性成分虛擬遴選中。徐青青等[38]構(gòu)建了六味地黃方中己知的21種主要化學成分及代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)配體分子庫，采用虛擬遴選技術(shù)分析了六味地黃方中抑制α-葡萄糖苷酶的有效物質(zhì)。發(fā)現(xiàn)2種四環(huán)三萜類化合物結(jié)合能較低，成功推測了六味地黃方治療2型糖尿病的活性成分。當前對高度靈活配體的對接預(yù)測不太可靠，仍有一些理論和計算方面的挑戰(zhàn)需要克服。

3 基于成分本身的遴選技術(shù)

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學

傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)模式是設(shè)計精選作用于個體藥物靶標的最合適配體。然而與多靶點藥物相比，精選的化合物可能表現(xiàn)出低于預(yù)期的臨床效果。整合網(wǎng)絡(luò)生物學和多向藥理學有望擴大目前中藥活性成分的空間[39]。Tang等[40]研究了用于治療過敏性鼻炎的復(fù)方：麻黃附子細辛湯，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，發(fā)現(xiàn)了四種預(yù)測成分具有抗炎作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究過程中，優(yōu)化多種活動的同時平衡類似藥物的特性并控制不脫靶是一項艱巨的任務(wù)[39]。

3.2 血清藥物化學

基于入血成分可能是中藥有效成分這一假說，血清藥物化學研究采用中藥口服給藥后采集血清樣品，從血清中分離、鑒定移行成分的方法[41]。陳思通過血清藥物化學、文本挖掘和相似性匹配相結(jié)合的方法鑒別出四逆湯抗心衰的48個潛在活性成分[42]。中藥血清藥物化學理論體系簡單、技術(shù)成熟、設(shè)備普及、成本低廉。不足之處在適用于口服中藥，有效成分需經(jīng)過血液循環(huán)，靈敏度低，需要化學分離、活性測定等過程，周期長，通量性較差[43]。

4 結(jié) 語

基于新型技術(shù)手段建立快速、有效的遴選方法是從“天然組合化合庫”中辨認、遴選藥效活性成分及開發(fā)新藥的前提。近年來，隨著多學科交叉應(yīng)用與融合，基于生物親和作用的快速遴選模式不斷涌現(xiàn)，多種技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用使中藥藥效活性成分的研究更高效率、高靈敏度、強特異性，進而在一定程度上為新藥開發(fā)提供助力。