張晨霞，王國成，王超，李清，劉順航，畢開順，*

（1.沈陽藥科大學，遼寧沈陽110016；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津300410；3.云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司，云南普洱665000）

普洱茶[Camellia sinensis（Linn）var.assamica（Mast.）Kitamura]是我國云南省特有的歷史名茶，也是典型的地理標志產(chǎn)品[1]。普洱茶是以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料加工制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉。按其加工工藝及品質(zhì)特征，普洱茶可分為普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。

普洱生茶是以曬青茶經(jīng)蒸壓成型、干燥、包裝等工藝加工而成，可以直接飲用，又可以通過貯藏過程中自然發(fā)酵轉(zhuǎn)化為普洱陳茶，貯藏過程對普洱生茶影響較大，研究表明貯藏時間越長，茶品質(zhì)越好，尤其是對普洱生茶品質(zhì)中的香氣成分影響最為顯著[4-5]。而不經(jīng)貯藏的普洱生茶與普洱曬青茶品質(zhì)相似，其主要香氣成分為醇類、碳氫類和酮類化合物[6]。同時，有研究指出，普洱茶的主要香氣成分會因產(chǎn)地、同一產(chǎn)地不同產(chǎn)茶區(qū)而存在很大的差異[7-8]。目前，不同地區(qū)普洱茶差異性研究較多，同一地區(qū)不同產(chǎn)茶區(qū)普洱茶香氣成分的差異性的相關(guān)報道較少，值得進一步的研究。

固相微萃取 （headspace solid-phase microextraction，SPME）技術(shù)是一種新型的無溶劑樣品預處理技術(shù)，該技術(shù)集取樣、萃取、濃縮和進樣為一體，具有操作簡單、樣品量少、無溶劑、萃取樣品后可直接與氣相色譜（gas chromatography，GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 聯(lián)用進行進樣分析等優(yōu)點[9-10]。目前，SPME 技術(shù)現(xiàn)已廣泛應用于食品[11-13]、藥品[14]、環(huán)境[15]等領(lǐng)域樣品的分析。本研究采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合 GC-MS 對普洱市 5 個產(chǎn)茶區(qū)（思茅區(qū)、景東、景谷、景邁山、鎮(zhèn)沅）普洱生茶樣品進行香氣成分的分析和比較，揭示不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分的差異，以期為普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶的產(chǎn)區(qū)判別和香氣品質(zhì)的提升提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樣品：思茅區(qū)（SM）7 個、景東產(chǎn)茶區(qū)（JD）8 個、景邁山產(chǎn)茶區(qū)（JM）12 個、景谷產(chǎn)茶區(qū)（JG）8 個、鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)（ZY）7 個：2010～2012 年制作普洱生茶，云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司提供，茶葉樣品使用前經(jīng)粉碎機粉碎，并通過2.0 mm 圓孔篩；氯化鈉（分析純）：天津市化學試劑一廠，使用前 120 ℃烘 2 h；C8～C32正構(gòu)烷烴混標（500 mg/L，溶于氯仿中）：美國AccuS－tandard 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace1300-ISQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；HP-5MS 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國 Agilent 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取頭、固相微萃取裝置、手動進樣手柄：美國Supelco 公司；IT-09A 型恒溫磁力攪拌器：上海一恒科學儀器有限公司；ME-T 分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取方法

稱取粉碎普洱生茶粉2.0 g 放置于20 mL 頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，放入轉(zhuǎn)子，加入6 mL 煮沸超純水，立即采用聚四氟乙烯封口，將頂空瓶放置于磁力攪拌器上的水浴中，在（60±2）℃、300 r/min 條件下平衡10 min，然后將65 μm PDMS/DVB 萃取頭插入頂空瓶中，推出吸附頭，（60±2）℃恒溫下吸附 60 min，吸附結(jié)束后拔出萃取頭立即插入到氣相色譜（GC）進樣口，250 ℃解吸附4.0 min，同時啟動GC-MS 進行數(shù)據(jù)采集。

1.3.2 儀器條件

GC 條件：色譜柱為HP-5MS 石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣方式為手動進樣；升溫程序：初始溫度 50 ℃，以 2 ℃/min 升溫至 130 ℃，保持 2 min，然后以10 ℃/min 升溫至280 ℃，保持3 min，總運行時間為60 min；載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；載氣流速0.8 mL/min；進樣口溫度250 ℃；進樣模式為無分流進樣。

MS 條件：離子源為EI 源，電子能量70 eV；接口溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；發(fā)射電流為34.6 A；掃描方式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：35 aum～350 aum；溶劑延遲時間：3 min。

1.3.3 保留指數(shù)測定

取C8～C32混標稀釋液，將1.3.2 中進樣方式改為自動進樣、進樣量 1 μL、分流比為 10 ∶1，其余條件不變，進行正構(gòu)烷烴的分析。根據(jù)C8～C32每個烷烴的出峰時間和所要計算化合物的出峰時間，采用下式計算各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)（retention index，RI）：

式中：tx、tn和tn+1分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于 n、n+1 之間的烷烴（tn＜tx＜tn+1）流出峰保留時間，min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Trace1300-ISQGC-MS 自帶譜庫（NIST 11）檢索定性分析，同時將每種化合物計算所得保留指數(shù)與文獻已報道的采用相同色譜柱所得保留指數(shù)進行對比，并綜合NIST 譜庫相似度、RI 一致度高的化學結(jié)構(gòu)為最優(yōu)鑒定結(jié)果，文獻查詢不到保留指數(shù)的化合物以NIST 數(shù)據(jù)庫相似度為判定標準。試驗結(jié)果采用峰面積歸一法進行定量，以各組分峰面積與色譜圖總峰面積之比值表示其相對含量。不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品中香氣成分差異采用Duncan's multiple range test 分析，分析采用SPSS 17.0 軟件；偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）采用SIMCA-P 12 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣組成分析

采用 65 μm PDMS/DVB 結(jié)合 GC-MS 分別對普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶香氣組分進行分析，每個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶代表性香氣成分總離子流圖如圖1 所示，香氣定性和定量結(jié)果如表1 所示。

圖1 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶代表性香氣總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of representative arome of raw Pu-erh tea samples of different producing areas

表1 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中香氣化合物Table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

續(xù)表1 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中香氣化合物Continue table 1 Aroma compounds in raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

在普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)42 個普洱生茶樣品中共檢測出83 種物質(zhì)，其中醇類化合物23 種，碳氫類化合物20 種，酯類化合物12 種，甲氧基苯類化合物8 種，酮類化合物8 種，酸類化合物4 種，酚類化合物3 種，醛類化合物3 種，含氮類化合物2 種。景東產(chǎn)茶區(qū)8 個普洱生茶樣品共檢測出74 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達到了（52.109±4.126）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（12.274±2.963）%、甲氧基苯類化合物（8.655±2.729）%、酯類化合物（8.580±1.910）%和碳氫類化合物（7.725±2.898）%，含氮類化合物（2.358±1.149）%、醛類化合物（1.934±1.101）%、酚類化合物（1.202±0.844）%和酸類化合物（0.992±0.861）%相對百分含量較低；鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)7 個普洱生茶樣品共檢測出62 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達到了（50.666±4.394）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（15.013 ±1.883）%、碳氫類化合物（9.499±3.869）%、酯類化合物（9.078 ± 1.564）%和甲氧基苯類化合 （5.463 ±1.163）%，含氮類化合物（2.351±0.417）%、醛類化合物（1.432±0.425）%、酚類化合物（1.257±0.663）%和酸類化合物（0.803±0.282）%相對百分含量較低；景邁山產(chǎn)茶區(qū)12 個普洱生茶樣品共檢測出68 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達到了（53.509±4.683）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（15.711±3.324）%、碳氫類化合物（10.038±3.098）%和酯類化合物（8.595±1.822）%，甲氧基苯類化合（2.995±1.483）%、含氮類化合物（1.855±0.673）%、醛類化合物（1.435±0.531）%、酚類化合物（1.297±0.574）%和酸類化合物（0.721±0.282）%相對百分含量較低；思茅區(qū)7 個普洱生茶樣品共檢測出63 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達到了（54.776±10.854）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（14.523±4.215）%、碳氫類化合物（9.311±2.421）%、含氮類化合物（8.230±4.703）%和酯類化合物（5.163±1.278）%，醛類化合物（1.212±0.544）%、酚類化合物（0.946±0.648）%、甲氧基苯類化（0.652±0.641）%、酸類化合物（0.383±0.401）%相對百分含量較低；景谷產(chǎn)茶區(qū)8 個普洱生茶樣品共檢測出60 種化合物，其中醇類化合物相對百分含量最高，達到了（48.266±7.880）%，其次相對百分含量較高的分別為酮類化合物（21.937±4.666）%、碳氫類化合物（10.444±4.486）%、和酯類化合物（6.607±1.710）%，含氮類化合物（3.466±2.266）%、酚類化合物（1.847±0.523）%、醛類化合物（1.747±0.896）%、甲氧基苯類化（0.641±1.129）%、酸類化合物（0.078±0.151）%相對百分含量較低。

通過分析可見，普洱生茶的香氣組成中醇類、酮類、碳氫類和酯類化合物含量均較高，醇類化合物大多具備的花果香，其中一些醇類化合物還伴有木香（芳樟醇、芳樟醇氧化物、萜品醇、雪松醇等）對普洱生茶香氣具有較好的協(xié)調(diào)性[16]；酮類、酯類化合物大多也具備花果香，其中酮類化合物中β-紫羅蘭酮也伴有特殊的木香[17]；碳氫類化合物中的飽和烴對茶香氣貢獻較小，不飽和烴對茶香氣貢獻較大[18]；甲氧基苯類化合物是普洱生茶貯藏過程中自然陳化產(chǎn)生，是普洱茶陳香風味的主要貢獻者[19-20]。

2.2 不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分差異性分析

2.2.1 差異顯著性分析

為了考察不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣成分的差異，試驗采用Duncan’s multiple range test 進行多組樣本間差異顯著性分析，結(jié)果如表1 所示，不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中醇類、碳氫類和醛類化合物相對百分含量差異不顯著（P＞0.05）；景東、鎮(zhèn)沅和景邁山3 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異不顯著（P＞0.05），思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異也不顯著（P＞0.05），景東、鎮(zhèn)沅和景邁山產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物與思茅區(qū)、景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酯類化合物差異顯著（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和思茅區(qū) 4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酮類化合物差異不顯著（P＞0.05），均與景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酮類化合物存在顯著差異（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和思茅區(qū) 4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異不顯著（P＞0.05），景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和景谷4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異不顯著（P＞0.05），思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酚類化合物差異顯著（P＜0.05）；景東、鎮(zhèn)沅、景邁山和景谷4 個產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中含氮類化合物差異不顯著（P＞0.05），均與思茅區(qū)普洱生茶中含氮類化合物存在顯著差異（P＜0.05）；景東產(chǎn)茶區(qū)分別與思茅區(qū)、景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酸類化合物差異顯著（P＜0.05），鎮(zhèn)沅、景邁山與景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中酸類化合物差異顯著（P＜0.05）；對于甲氧基苯類化合物，僅有思茅區(qū)和景谷產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中的含量差異不顯著（P＞0.05），其余產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中含量之間差異均顯著（P＜0.05），甲氧基苯類化合物是普洱生茶貯藏過程中自然陳化產(chǎn)生，不同產(chǎn)茶區(qū)樣品之間差異顯著可能是因為原料其他組分差異所致。

2.2.2 PLS-DA 分析

以普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)的42 個普洱生茶中所檢測到的香氣成分相對百分含量為變量進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），建立PLS-DA 模型對普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品進行區(qū)分和差異研究，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)42 個普洱生茶樣品PLS-DA 分析得分散點圖Fig.2 PLS-DA score scatter plot of 42 raw Pu-erh tea samples of different producing areas of Pu'er city

不同產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，景邁山與鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品差異性相對較小，與思茅區(qū)普洱生茶樣品差異較大。根據(jù)不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品離散度來看，思茅區(qū)和景東產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品間離散度較大，說明樣品間差異稍大，景邁山和鎮(zhèn)沅產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品間離散度相對較小，說明樣品間差異相對較小。為了進一步探究對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶區(qū)分起重要作用的香氣成分，試驗采用42 個普洱生茶樣品中所檢測到的香氣成分進行PLSDA 變量重要性因子（VIP）分布分析，VIP 值可以量化PLS-DA 分析中的每個變量對分類的貢獻度[21]，VIP 值越大，變量在不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶之間的差異越顯著，相應結(jié)果見表2。

變量重要性因子分布分析結(jié)果顯示，共有33 種香氣成分對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品區(qū)分起主要作用（VIP ＞ 1），其中 4-乙基-1，2-二甲氧基苯（VIP =1.962）、3，4-二甲氧基甲苯（VIP=1.954）、1，2，3-三甲氧基-5-甲基苯（VIP=1.873）、1，2，3-三甲氧基苯（VIP=1.691）、乙酸香葉酯（VIP=1.582）、香葉基丙酮（VIP=1.519）、咖啡堿（VIP = 1.499）、β-紫羅蘭酮（VIP =1.489）、Z-2-辛烯-1-醇（VIP = 1.458）、棕櫚酸甲酯（VIP=1.456）、1-辛烯-3-醇（VIP = 1.361）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（VIP=1.358）、苯乙醇（VIP=1.357）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（VIP=1.314）、α-紫穗槐烯（VIP=1.313），起主要作用的主要為甲氧基苯類、酮類、酯類和醇類物質(zhì)，其中甲氧基苯類物質(zhì)對區(qū)分不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶貢獻度最大，這可能是因為不同產(chǎn)茶區(qū)茶葉原料差異導致普洱生茶儲藏過程中甲氧基苯類化合物生成物質(zhì)、生成量的不同，其主要機理有待于深入研究。

表2 變量重要性因子（VIP）值大于1.0 的香氣化合物Table 2 Aroma compound list with VIP value larger than 1.0

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 分別對普洱市5 個產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶香氣組分進行分析，42 個普洱生茶樣品中共檢測出83 種香氣成分，香氣組分以醇類化合物為主，其次為碳氫類、酯類、甲氧基苯類和酮類化合物。其中不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶中醇類、碳氫類和醛類化合物相對百分含量差異均不顯著（P＞0.05），甲氧基苯類化合物含量差異顯著性（P＜0.05）比例較大，酯類、酮類、酚類、酸類和含氮類化合物含量差異顯著性比例較小。以83 種香氣組分相對百分含量為變量進行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），不同產(chǎn)茶區(qū)的普洱生茶樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢，變量重要性因子（VIP）分析，33 種香氣成分對不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶樣品區(qū)分起主要作用（VIP ＞1），33 種香氣成分中甲氧基苯類、酮類、酯類和醇類物質(zhì)占比最大。本研究可為普洱市不同產(chǎn)茶區(qū)普洱生茶香氣差異及貯藏過程中香氣形成規(guī)律的深入研究提供理論支撐。