王曉爽，國 琦，朱亞飛，樊雪梅，劉松巖

癲癇(epilepsy，EP)是由多種原因導致的腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電的臨床綜合征。癲癇病因錯綜復雜。目前控制癲癇發(fā)作仍以抗癲癇藥物為主，其次為手術治療[1]，仍有一部分最終發(fā)展為難治性癲癇。隨著分子遺傳學發(fā)展，近年來癲癇的分子病因已得到全面揭示[2,3]。研究表明微小核糖核酸(miRNAs)在癲癇發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。miRNA參與樹突棘、突觸可塑性調節(jié)[5]，神經(jīng)元壞死、凋亡、神經(jīng)膠質細胞增生、異常通路形成以及炎癥反應等病理生理過程[6]，調節(jié)皮質發(fā)育及腦功能[7]，從而參與癲癇發(fā)生及調控[8]。miR-134是腦內一類特殊miRNA，對癲癇發(fā)生過程中多個病理生理過程起重要調控作用[9]，參與調控癲癇[10]、卒中[11]等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。miR-134在癲癇患者外周血是否存在差異表達，能否作為一種生物學標志物應用于預測細胞損傷、癲癇診斷、治療以及預后評估，是目前研究的熱點。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例隨機采集于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院門診及病區(qū)2013年12月-2017年12月就診的癲癇患者，根據(jù)腦電圖及臨床表現(xiàn)均符合國際抗癲癇聯(lián)盟癲癇診斷標準者為癲癇組(120例)，同時選擇年齡、性別相匹配的健康人為對照組(70例)，癲癇組根據(jù)病程、發(fā)作時限、發(fā)作頻率、特殊癲癇綜合征分為4個組，再進一步進行亞組分析(見表1)。癲癇組排除標準：年齡>80歲，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病如單純皰疹病毒性腦炎、顱內占位性病變、邊緣葉腦炎；嚴重心臟、肝臟、腎臟、內分泌系統(tǒng)疾病者；妊娠及哺乳期婦女、嚴重智能障礙不能合作者。正常對照組納入標準：近期常規(guī)體檢包括心電圖、胸片、超聲無異常；血常規(guī)、血生化及肝腎功無明顯異常；無發(fā)作性癥狀、無癲癇家族史、無外傷史；無難產(chǎn)、腦炎、高熱驚厥史。

1.2 主要試劑 miR-134、U6引物購于上海生物工程公司；Trizol購于Ambion?公司；NCodeTMVILOTMmiRNA cDNA Synthesis Kit and Express Sybr?Green ERTMmiRNA qRTPCR Kits購于Invitrogen。

1.3 設計引物 根據(jù)miRBase尋找miR-134成熟體序列(MIMAT0000134)委托上海生物工程公司合成hsa-miR-134-5p RT-Primer序列為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT

ACGACCCCCTCTG-3’及隨機對照U6RT-Primer 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 實驗方法

1.4.1 外周血采集及保存 各組于清晨空腹采集肘靜脈血液,所取標本經(jīng)處理后，于-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 RNA的提取、逆轉錄及qPCR (1)RNA的提取:經(jīng)裂解、分層、沉淀、洗滌、干燥、溶解等步驟提取RNA；(2)RNA濃度測定:使用NANODROP-2000可見分光光度計對所得樣本進行濃度及純度測定,記錄RNA濃度和OD260/OD280值,比值在1.9～2.0之間是表示RNA純度高，將樣本保存于-20 ℃冰箱；(3)將RNA逆轉錄為cDNA 逆轉錄反應條件如下：37 ℃ 60 min；95 ℃ 5 min；冷卻至4 ℃；(4)實時熒光定量PCR 每個樣品設3個重復，以U6 snRNA作為內參。qPCR反應條件：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環(huán)；60 ℃～95 ℃溫度范圍內記錄熔解曲線。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線，根據(jù)miR-134的CT、U6CT值，得出相對表達量(RQ，Relative Quantity)RQ=2-△△CT。

2 結 果

2.1 一般臨床資料比較 兩組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)(見表2)。

2.2 癲癇患者外周血miR-134表達 對提取得RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，總RNA電泳圖顯示無雜帶，表明RNA無降解(見圖1)。miR-134及U6擴增曲線平滑，溶解曲線單峰(見圖2)。統(tǒng)計學分析顯示，對照組(0.88±0.37)、癲癇組(2.38±0.47)，與對照組相比，癲癇組外周血miR-134表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義t=-22.92，P=0.000(見圖3)。

2.3 病程對癲癇患者外周血miR-134表達影響 比較病程對外周血miR-134表達量影響，對照組(0.88±0.37)、病程≤1 y組(1.94±0.39)、病程>1 y組(2.56±0.37)，病程>1 y組與病程≤1 y組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.000，病程對癲癇患者外周血miR-134表達量有影響，病程長miR-134表達量增高(見圖4)。

2.4 發(fā)作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較發(fā)作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量影響，正常對照組(0.88±0.37)、非急性發(fā)作組(1.92±0.35)、急性發(fā)作組(2.42±0.46)，與非急性發(fā)作組相比，急性發(fā)作組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義P=0.000，發(fā)作時限對癲癇患者外周血miR-134表達量有影響，急性發(fā)作組miR-134表達量增高(見圖5)。

2.5 發(fā)作頻率對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較發(fā)作頻率對癲癇患者外周血miR-134表達量影響，對照組(0.88±0.37)、頻繁發(fā)作組(2.37±0.49)、發(fā)作控制不良組(2.39±0.48)、發(fā)作控制良好組(2.38±0.46);頻繁發(fā)作組、發(fā)作控制不良組、發(fā)作控制良好組3組相比，F(xiàn)=0.013，P=0.987，無統(tǒng)計學差異(見圖6)。

2.6 特殊癲癇綜合征對癲癇患者外周血miR-134表達量影響 比較特殊癲癇綜合征(顳葉癲癇)對癲癇患者外周血miR-134表達量影響， 對照組(0.88±0.37)、非顳葉癲癇組(2.39±0.47)、顳葉癲癇組(2.36±0.48)，顳葉癲癇組與非顳葉癲癇組相比，P=0.764>0.05，差異無統(tǒng)計學意義(見圖7)。

表1 實驗分組

注：急性發(fā)作組：標本采集時3 d內存在臨床癲癇發(fā)作者；非急性發(fā)作組：標本采集3 m內無臨床癲癇發(fā)作者;頻繁發(fā)作組：發(fā)作次數(shù)≥ 4次/m；發(fā)作控制不良組：1次/m≤發(fā)作次數(shù)<4次/m；發(fā)作控制良好組：發(fā)作次數(shù)≤1～2次/y，不符合入組標準者排除

表2 研究對象分組及基本資料

注：a.獨立樣本t檢驗的P值；b.χ2檢驗的P值；“-”無相關數(shù)據(jù)

圖1 總RNA電泳圖

圖2 miR-134、U6溶解曲線及擴增曲線

圖3 癲癇患者外周血miR-134相對表達量，與對照組相比，癲癇組明顯升高P=0.000

圖4 癲癇患者外周血miR-134在不同病程組中表達，病程長表達量增高P=0.000

圖5 癲癇患者外周血miR-134在不同發(fā)作時限組中表達，急性發(fā)作組表達量升高P=0.000

圖6 癲癇患者外周血miR-134在不同發(fā)作頻率組中表達，發(fā)作頻率對表達量無影響P=0.987

圖7 癲癇患者外周血miR-134在特殊癲癇綜合征組中表達,特殊癲癇綜合征(顳葉癲癇)對表達量無影響P=0.764

3 討 論

miR-134是腦內含量豐富的一類特殊microRNA，廣泛分布于海馬神經(jīng)元和樹突，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要調控作用[12]。樹突棘大小、密度及形態(tài)變化是影響癲癇發(fā)作的重要因素[13]。Schratt等[14]在研究miRNA與樹突棘之間聯(lián)系時發(fā)現(xiàn)，miR-134對樹突棘大小及數(shù)量起調節(jié)作用，大鼠海馬神經(jīng)元中miR-134高表達，通過Limk1對樹突棘大小起調節(jié)作用，miR-134過表達，使樹突棘變小，miR-134對樹突棘的體積具有負向調節(jié)作用，從而影響突觸強度及突觸可塑性。當皮質神經(jīng)元膜去極化時，miR-134 前體水平顯著增加[15]。由此推斷癲癇患者外周血miR-134表達量存在差異，本實驗結果中在對癲癇組和對照組比較時發(fā)現(xiàn)癲癇組外周血miR-134表達量明顯升高，支持此推斷，表明miR-134在外周血中穩(wěn)定表達，這種差異表達提示miR-134可作為生物標志物深入細致研究，進一步探明其差異表達在癲癇調控中的意義。此種差異表達可能機制為神經(jīng)元去極化導致miR-134水平明顯升高，通過轉錄后調節(jié)機制，調節(jié)相關靶蛋白，參與突觸可塑性調控，促使異常興奮性環(huán)路形成，最終參與癲癇發(fā)生發(fā)展。外周血miR-134穩(wěn)定及差異表達，提示miR-134可能成為癲癇診斷、監(jiān)測藥物敏感性、評估預后等特異性生物學標記物，為新藥開發(fā)提供理論支撐，為癲癇治療帶來新的希望。

突觸重塑、異常網(wǎng)絡形成既可能是癲癇反復發(fā)作原因，也可能是癲癇反復發(fā)作的興奮性毒性結果。我們的實驗結果得出癲癇患者外周血miR-134表達量在長病程組中明顯升高，推測外周血miR-134表達量可以在一定程度上反映突觸重塑、神經(jīng)異常網(wǎng)絡形成等病理改變，外周血miR-134表達量變化可能為觀察腦損傷新的視角，為早期發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元損傷提供新的途徑，進而評估患者預后情況。

大量實驗表明[16]，miR-134與癇性發(fā)作有明顯時限性，在無鎂細胞外液誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus，SE)離體細胞模型中，模型制備成功后72 h，miR-134表達升高，在應用miR-134抑制劑預處理的細胞中SE放電頻率較對照組明顯降低，神經(jīng)元樹突棘密度減少。Jimenez-Mateos等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在制備動物癲癇模型前24 h,側腦室注射antagomirs抑制miR-134表達，結果顯示海馬神經(jīng)元破壞明顯減少，癲癇發(fā)作頻率明顯減少。SE可引起miR-134在海馬表達增加，有研究表明在實驗動物的海馬和難治性癲癇患者的顳葉皮質中miR-134的表達水平增高[18]。在鼠SE模型中，應用miRNA拮抗劑誘導使miR-134表達量下降，鼠癲癇自發(fā)性癲癇的發(fā)生率明顯下降，顳葉癲癇的病理特征有所減輕， 海馬CA3椎體神經(jīng)元中樹突棘密度降低，增加海馬CA3錐體神經(jīng)元棘突的體積，產(chǎn)生了有效的抗驚厥作用[19]。抑制大鼠海馬miR-134能夠減輕SE發(fā)作,可以縮短癲癇發(fā)作的潛伏期，縮短SE發(fā)作時間[20]。由此推測癲癇發(fā)作時限、發(fā)作頻率、特殊癲癇綜合征與外周血miR-134表達量相關，癲癇發(fā)作急性期、發(fā)作越頻繁，miR-134表達量越高，以及顳葉癲癇綜合征、miR-134的表達量升高，來評估顳葉癲癇反復發(fā)作的易感性，成為診斷特殊癲癇綜合征的輔助檢查之一。本實驗結果顯示，癲癇患者急性發(fā)作組miR-134表達量明顯升高，支撐上述推斷。但外周血miR-134在不同發(fā)作頻率以及特殊癲癇綜合征表達量無明顯差異,得出上述結果可能因樣本量較小有關，需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)癲癇組外周血miR-134表達量明顯升高，與病程、發(fā)作時限相關，提示miR-134表達與神經(jīng)元放電程度和損傷嚴重性相關，可為我們進一步研究miR-134作為生物標志物以及應用miR-134抑制劑保護神經(jīng)元提供理論支持；在癲癇急性發(fā)作組及長病程組高表達可能為癲癇預后判斷、療效評估提供幫助。