劉國林，陶金忠，白玲榮，李向龍，陳永宏，張 萌，羅 芳，李亞超，郭延生

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

奶牛圍產(chǎn)期是指產(chǎn)前21 d到產(chǎn)后21 d的一段時期[1]。由于妊娠、分娩等因素[2]，奶牛在圍產(chǎn)期的生理和代謝會發(fā)生劇烈變化，易導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫狀態(tài)改變，使奶牛免疫力下降[3]。奶牛由于乳腺發(fā)育、乳的合成和分泌以及能量攝入量的不足而處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，引起脂肪動員，進(jìn)而導(dǎo)致血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和酮體含量升高[4]。因此，如何緩解圍產(chǎn)期的能量負(fù)平衡和免疫抑制是奶牛生產(chǎn)上亟待解決的問題，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。奶牛日糧中添加中草藥可提高采食量、減輕能量負(fù)平衡和提高免疫力，從而降低產(chǎn)后患病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，山楂具有降血糖、降血脂、抗氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗、抗炎等作用[6]。張美英[7]研究了山楂提取物對肉仔雞的飼喂效果，發(fā)現(xiàn)山楂可以降低胃pH值，激活胃蛋白酶原，提高消化酶活力。韓瑞陽[8]研究發(fā)現(xiàn)，山楂可通過降低甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白含量，來調(diào)節(jié)脂代謝紊亂。黃芪具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力及抗氧化功能，改善腸道微生態(tài)等作用，其中以免疫調(diào)節(jié)作用最為突出[9]。黃芪多糖可激活機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞，引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，還可激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子從而激活非特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[10]。目前，山楂和黃芪在圍產(chǎn)期奶牛中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。因此，以健胃消食、增強(qiáng)免疫力為原則，將不同劑量山楂和黃芪添加到奶牛日糧中，研究山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛血液生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響，旨在為山楂和黃芪在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)儀器

全自動生化分析儀(BS-180，深圳邁瑞公司)、冰箱(BCD-576WDPU，青島海爾股份有限公司)、-86 ℃超低溫冷凍儲存箱(DW-HL388，中科美菱低溫科技股份有限公司)、離心機(jī)(TGL-16，江蘇中大儀器科技有限公司)、培養(yǎng)箱(GNP-9270，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、酶標(biāo)儀(MB-530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)、移液槍(Eppendorf所有規(guī)格)、血酮檢測分析儀(Nova Vet，北京哈羅德科技有限公司)等。

1.2 主要試驗(yàn)材料與試劑

山楂和黃芪粉購于甘肅蘭州黃河中藥市場。鈣(Ca)、磷(P)、白蛋白(ALB)、肌酸激酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(Glu)、總蛋白(TP)、肌酐(CREA)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT)含量測定試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；非酯化脂肪酸(NEFA)含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；酮體含量檢測試紙條購自北京哈羅德科技有限公司；牛免疫球蛋白G(IgG)、牛腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量測定試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2018年5月7日—7月15日在寧夏某養(yǎng)殖場進(jìn)行。選擇2～4胎次上一個產(chǎn)奶周期產(chǎn)奶量接近的健康圍產(chǎn)期(產(chǎn)前21 d—產(chǎn)后21 d)荷斯坦奶牛45頭，隨機(jī)分成3組(A組、B組、C組)，每組15頭。A組飼喂基礎(chǔ)日糧(表1)，B組和C組分別在基礎(chǔ)日糧中添加100 g/(頭·d)和300 g/(頭·d)山楂和黃芪(山楂與黃芪1∶1)，所有飼喂管理方式按照該牧場管理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，自由采食和飲水，每天飼喂3次，全混合日糧(Total mixed rations，TMR)飼喂。從預(yù)產(chǎn)期前21 d開始飼喂，到產(chǎn)后21 d試驗(yàn)結(jié)束。

表1 圍產(chǎn)前期和圍產(chǎn)后期奶?；A(chǔ)日糧組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Tab.1 Composition of basic diet of dairy cows in perinatal and late perinatal period (DM basis) %

1.4 樣品采集

根據(jù)預(yù)產(chǎn)期妊娠天數(shù)280 d，于-21 d、-7 d、0 d、+7 d和+21 d尾靜脈采集血液10 mL，肝素鈉抗凝，迅速3 000 r/min離心10 min，收集血漿，-80 ℃保存。

1.5 血液指標(biāo)的測定

血漿常溫下解凍，參照測定試劑盒的使用方法，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測Ca、P、CK、ALP、Glu、CREA、GGT、ALB、TP、GLB含量；使用酶標(biāo)儀檢測NEFA、IgG和TNF-α含量；使用血酮分析儀檢測酮體含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010整理后，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s法多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛GGT和ALP含量的影響

由表2可知，與A組相比，0 d時，B組和C組GGT含量分別顯著下降22.01%和21.21%(P<0.05)，+7 d時，B組顯著下降20.40%(P<0.05)、C組極顯著下降26.36%(P<0.01)，+21 d時，B組和C組分別極顯著下降28.92%和34.18%(P<0.01)，C組ALP含量顯著下降31.39%(P<0.05)，其他時期差異不顯著。

表2 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛GGT和ALP含量的影響Tab.2 Effects of hawthorn and Astragalus on GGT and ALP contents in perinatal dairy cows U/L

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。
Note:The different lowercase letters in the same row mean significant difference (P<0.05),different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01),the same below.

2.2 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛CREA和CK含量的影響

由表3可知，與A組相比，+21 d時，B組CREA含量顯著下降7.74%(P<0.05)，C組極顯著下降22.54%(P<0.01)；-7 d時，B組CK含量顯著下降47.02%(P<0.05)；其他時期差異不顯著。

表3 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛CREA和CK含量的影響Tab.3 Effects of hawthorn and Astragalus on CREA and CK contents in perinatal dairy cows

2.3 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛TP、ALB和GLB含量的影響

由表4可知，與A組相比,+21 d時，B組TP含量極顯著升高44.10%(P<0.01)，C組顯著升高28.06%(P<0.05)；B組和C組ALB含量分別極顯著升高20.73%和19.56%(P<0.01)；B組GLB含量極顯著升高66.16%(P<0.01)；其他時期差異不顯著。

表4 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛TP、ALB和GLB含量的影響Tab.4 Effects of hawthorn and Astragalus on TP,ALB and GLB contents in perinatal dairy cows g/L

2.4 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛Ca和P含量的影響

由表5可知，與A組相比，+7 d時,B組和C組Ca含量分別極顯著升高47.28%和45.65%(P<0.01)，+21 d時，B組顯著升高41.67%(P<0.05)；與A組相比，+21 d時，B組P含量極顯著升高33.57%(P<0.01)；其他時期差異不顯著。

表5 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛Ca和P含量的影響Tab.5 Effects of hawthorn and Astragalus on Ca and P contents in perinatal dairy cows mmol/L

續(xù)表5 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛Ca和P含量的影響Tab.5(Continued) Effects of hawthorn and Astragalus on Ca and P contents in perinatal dairy cows mmol/L

2.5 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛Glu、NEFA和酮體含量的影響

由表6可知，與A組相比，0 d時，B組和C組Glu含量分別顯著升高24.49%和23.72%(P<0.05)；與A組相比，+7 d時，C組NEFA含量顯著下降27.16%(P<0.05)，+21 d時，B組極顯著下降34.38%(P<0.01)；與A組相比，+21 d時，B組酮體含量顯著下降25.93%(P<0.05);其他時期差異不顯著。

表6 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛GLU、NEFA和酮體含量的影響Tab.6 Effects of hawthorn and Astragalus on GLU,NEFA and ketone body contents in perinatal dairy cows mmol/L

2.6 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛IgG和TNF-α含量的影響

由表7可知，-7 d、0 d、+7 d和+21 d時，與A組相比，B組和C組IgG含量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，B組TNF-α含量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表7 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛TNF-α、IgG含量的影響Tab.7 Effects of hawthorn and Astragalus on TNF-α and IgG contents in perinatal dairy cows

3 結(jié)論與討論

3.1 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛GGT和ALP含量的影響

圍產(chǎn)期奶牛由于能量負(fù)平衡而引發(fā)脂肪動員，可導(dǎo)致肝臟脂肪沉積，會引起脂肪肝，從而損傷肝臟功能。ALP和GGT在臨床上用于反映肝臟功能的狀態(tài)，主要分布在肝臟、心肌、骨骼肌及腎臟等組織細(xì)胞中，當(dāng)上述組織細(xì)胞受損時，會導(dǎo)致其活性升高。李召陽[11]在妊娠母豬的飼料中添加黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對妊娠母豬的肝臟起到良好的保護(hù)作用。喬靖怡等[12]研究發(fā)現(xiàn)，山楂總黃酮能顯著降低肝臟損傷大鼠的肝臟指數(shù)，減輕肝臟損傷的程度。高志強(qiáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同配比的山楂葉、果能顯著降低脂肪肝大鼠血清GGT與ALP含量(P<0.01或0.05)。本研究結(jié)果表明，在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加山楂和黃芪，奶牛血漿中GGT與ALP含量降低，表明山楂和黃芪添加可保護(hù)奶牛肝臟功能。但GGT及ALP水平的變化與奶牛脂肪動員而造成的肝臟損傷的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛CREA和CK含量的影響

CREA主要是由肌肉中的肌酸通過不可逆的非酶脫水反應(yīng)生成后釋放進(jìn)入血液中，主要由腎小球的過濾能力來決定，其在血液中含量低表明腎臟排泄功能強(qiáng)[14]。在妊娠母豬飼料中添加黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖在一定程度上顯著增強(qiáng)了腎臟的排泄功能[11]。本研究結(jié)果表明，在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加山楂和黃芪，產(chǎn)后奶牛血漿中CREA含量降低。可見，山楂和黃芪添加改善了產(chǎn)后奶牛腎臟排泄功能。

在動物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中CK含量最多，當(dāng)這些組織受到損傷后CK會立即釋放入血液中，使血清CK含量迅速升高，所以臨床上CK含量被作為診斷心臟損傷的重要指標(biāo)。在妊娠母豬飼料中添加黃芪多糖，母豬血液中CK含量顯著降低[11]。邱曉梅等[15]研究表明，山楂葉總黃酮(HLF)可明顯減輕大鼠心肌缺血損傷程度，從而保護(hù)心肌功能。本研究結(jié)果表明，在奶牛圍產(chǎn)期日糧中添加山楂和黃芪能降低產(chǎn)前奶牛血漿CK含量?？梢姡介忘S芪添加可保護(hù)奶牛心臟功能。

3.3 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛TP、ALB和GLB含量的影響

血清TP是由ALB和GLB組成的，TP、ALB、GLB都是由肝臟合成的，作為反映肝細(xì)胞蛋白合成代謝功能的指標(biāo)[16]。研究表明，在妊娠母豬飼料中添加黃芪多糖提高了機(jī)體對蛋白質(zhì)利用以及代謝能力[11]。蘇鳳艷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃芪可顯著提高鵪鶉血液中TP含量。彭宏剛等[18]向仔豬和育肥豬的飼料中添加黃芪多糖，血清TP和ALB的含量升髙。本研究中，ALB在分娩前后略有降低，可能由于分娩后奶牛發(fā)生能量負(fù)平衡，肝臟合成的ALB減弱或乳蛋白合成的增加導(dǎo)致ALB的分解代謝率增加[19]。TP和GLB在0 d時略有降低，與王建國[20]研究一致，表明產(chǎn)后脂肪動員在一定程度上影響了肝臟的儲備能力，使得蛋白質(zhì)代謝受到影響[21]。本研究結(jié)果表明，在奶牛圍產(chǎn)期日糧中添加山楂和黃芪能升高產(chǎn)后奶牛血漿中TP、ALB和GLB含量，這可能是由于山楂和黃芪促進(jìn)產(chǎn)后奶牛蛋白質(zhì)吸收、維持蛋白質(zhì)代謝。

3.4 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛Ca和P含量的影響

鈣、磷是動物體內(nèi)含量最多的無機(jī)鹽，幾乎所有奶牛產(chǎn)犢后血鈣的濃度都會下降。桑松柏[22]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛圍產(chǎn)期血漿Ca水平呈現(xiàn)產(chǎn)前21 d至分娩逐漸下降，分娩時最低，產(chǎn)后逐漸上升的趨勢；P水平總體呈現(xiàn)產(chǎn)前21 d至分娩略降低，分娩時最低，產(chǎn)后緩慢升高，產(chǎn)前總體水平高于產(chǎn)后的趨勢。王亮[2]研究發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期Ca出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在分娩當(dāng)天下降至最低。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加山楂和黃芪能升高產(chǎn)后奶牛Ca和P水平，這可能是由于山楂和黃芪調(diào)節(jié)Ca、P代謝。

3.5 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛GLU、NEFA和酮體含量的影響

血清GLU是衡量機(jī)體內(nèi)能量平衡與否的常用指標(biāo)。丁婭楠[23]研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期奶牛血清GLU濃度在分娩當(dāng)天顯著高于產(chǎn)前和產(chǎn)后，分娩后GLU濃度逐漸降低，至產(chǎn)后7 d時降至最低，之后趨于平緩。本研究中，GLU濃度從產(chǎn)前7 d開始急劇升高，至分娩期達(dá)峰值，此后逐漸降低，與丁婭楠[23]的研究結(jié)果一致，日糧中添加山楂和黃芪后分娩當(dāng)天奶牛GLU含量升高?？梢?，山楂和黃芪添加能改善分娩當(dāng)天能量負(fù)平衡。

NEFA主要是判定能量負(fù)平衡程度的重要指標(biāo)。通常奶牛產(chǎn)后達(dá)到產(chǎn)奶高峰后幾周，干物質(zhì)采食量才能恢復(fù)正常，但能量負(fù)平衡在分娩后第7天最明顯。SEIFI等[24]發(fā)現(xiàn)，奶牛血清NEFA水平在分娩時增加，產(chǎn)后第8天達(dá)到峰值，然后開始逐漸降低。MENDOZA等[25]發(fā)現(xiàn)，奶牛在產(chǎn)犢和產(chǎn)后7 d血清NEFA含量升高，7～14 d后開始降低,56 d降至產(chǎn)前水平。熊桂林等[26]研究表明，血清NEFA含量產(chǎn)前30 d變化不明顯，分娩當(dāng)天突然升高，產(chǎn)后5～10 d達(dá)到最高水平，之后降低，至產(chǎn)后20 d仍顯著高于產(chǎn)前。本研究中，NEFA從-21 d開始逐漸升高，至+7 d最高，之后逐漸下降，日糧中添加山楂和黃芪產(chǎn)后奶牛NEFA含量降低?？梢?，添加山楂和黃芪緩解了產(chǎn)后奶牛的能量負(fù)平衡。

體脂動員產(chǎn)生的NEFA超過肝臟的氧化能力就會轉(zhuǎn)化為酮體。王建國[20]研究發(fā)現(xiàn)，酮體含量從分娩期開始急劇升高，至產(chǎn)后7 d達(dá)峰值，此后降低，但仍保持較高水平，同時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前血清NEFA含量與產(chǎn)后酮體含量之間呈正相關(guān)。本研究中，酮體從-7 d開始急劇升高，至+7 d達(dá)峰值，此后逐漸降低。由于產(chǎn)后奶牛存在嚴(yán)重的能量負(fù)平衡，奶牛動員體脂產(chǎn)生了大量NEFA，進(jìn)而導(dǎo)致酮體含量升高，而添加山楂和黃芪降低了產(chǎn)后酮體含量。

3.6 山楂和黃芪對圍產(chǎn)期奶牛IgG和TNF-α含量的影響

奶牛在圍產(chǎn)期由于生理、代謝和泌乳的開始，會使其神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)發(fā)生很大的變化，容易出現(xiàn)不同程度的免疫抑制現(xiàn)象，因此，急需提高圍產(chǎn)期奶牛免疫力。李珊珊[27]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛圍產(chǎn)期免疫功能與其臨近分娩以及分娩后血清IgG的變化有關(guān)。李春燕等[28]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、山楂、杜仲葉等多味中藥組成的添加劑能顯著提高免疫細(xì)胞百分率，增強(qiáng)動物非特異性免疫功能和細(xì)胞免疫功能。呂軒[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸黃芪提取物復(fù)方制劑顯著提高了母豬血漿IgG的含量。金東春[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪復(fù)方中草藥添加劑明顯提高了東北黑腳麻雞血清中IgG和IgM的含量。蘇鳳艷等[17]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃芪飼料添加劑能夠提高鵪鶉血清中IgG和IgA含量，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)抗病力。本研究結(jié)果表明，在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加山楂和黃芪能升高奶牛血漿中IgG含量，這可能是山楂和黃芪提高了奶牛免疫力。但是山楂和黃芪提高圍產(chǎn)期奶牛免疫力的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

有研究表明，圍產(chǎn)期奶牛免疫功能的紊亂與血清TNF-α在產(chǎn)前變化有關(guān)[31]。TNF-α屬于單核因子，或稱促炎因子，參與機(jī)體局部或系統(tǒng)反應(yīng)，是炎癥和發(fā)熱過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有較廣泛的生物學(xué)活性，還具有免疫調(diào)節(jié)功能，能刺激合成IL-1、IL-6、IL-8等多種細(xì)胞因子，影響脂類代謝和糖代謝過程[32]。有研究指出，血漿中TNF-α增高，可以使機(jī)體獲得強(qiáng)烈的抗炎作用，能加速機(jī)體對炎癥的應(yīng)答[33]；呂建存等[34]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛圍產(chǎn)期喂服中藥后，可明顯提高圍產(chǎn)期奶牛血漿TNF-α含量，增強(qiáng)圍產(chǎn)期奶牛的免疫水平。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，說明山楂和黃芪可影響圍產(chǎn)期奶牛細(xì)胞免疫。

綜上，在圍產(chǎn)期奶牛日糧中添加100 g/(頭·d)山楂和黃芪時能顯著影響產(chǎn)后奶牛脂類、蛋白質(zhì)和Ca、P代謝，減輕產(chǎn)后能量負(fù)平衡，降低產(chǎn)后酮體水平，提高奶牛的免疫力。