家蠶抗性品系NC99R抗BmNPV作用機(jī)制分析

董戰(zhàn)旗，雷雪蛟，秦琪，張新鈴，唐亮，石美寧，潘敏慧,2

·農(nóng)業(yè)生物技術(shù)·

家蠶抗性品系NC99R抗BmNPV作用機(jī)制分析

董戰(zhàn)旗1,2*，雷雪蛟1*，秦琪1，張新鈴1，唐亮3，石美寧3，潘敏慧1,2

1 西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716 2 西南大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716 3 廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530007

家蠶是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目模式昆蟲，由家蠶核型多角體病毒 (nucleopolyhedrovirus，BmNPV) 引起的家蠶血液型膿病每年給我國蠶桑產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。文中擬通過鑒定目前存在的家蠶抗病毒品系NC99R抗性特征，初步解析其抗BmNPV機(jī)制，以期為家蠶抗病品系分子機(jī)制解析提供一定參考。將對(duì)照組大造 (Dazao，DZ) 品系和實(shí)驗(yàn)組NC99R抗性品系家蠶幼蟲分別定量添食BmNPV包涵體 (Occlusion bodies，OB)，計(jì)算DZ和NC99R品系對(duì)BmNPV的半致死劑量 (Median lethal dose，LD50)，結(jié)果顯示DZ品系半致死劑量為1.2×105多角體/頭，抗性品系NC99R的半致死劑量為1.8×106多角體/頭，抗性水平相比對(duì)照組提高15倍左右。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析DZ和NC99R品系口服感染1×106多角體/頭和體腔注射1×106粒子/頭出芽型病毒粒子 (Budded virus，BV) 后的死亡率，結(jié)果顯示DZ品系死亡高峰集中在第4–6天，NC99R抗性品系死亡高峰集中在第6–8天，與對(duì)照相比延遲1–2 d。通過RT-PCR分析BmNPV DNA拷貝數(shù)，顯示DZ在口服感染和體腔注射后BmNPV基因組都快速增殖，抗性品系NC99R BmNPV DNA拷貝數(shù)緩慢增加。HE染色分析顯示DZ和NC99R品系在口服感染前期沒有顯著差異，感染到96 h，DZ中腸細(xì)胞核變大，成脫落趨勢；而抗性品系NC99R，細(xì)胞核膨大，但細(xì)胞排列仍較整齊。RT-PCR分析病毒不同時(shí)期基因表達(dá)顯示抗性品系NC99R在口服感染和體腔注射24 h后早期基因開始下調(diào)表達(dá)，其他時(shí)期基因隨即下調(diào)表達(dá)；最后維持在較低表達(dá)水平或消失。

家蠶，家蠶核型多角體病毒，抗性，NC99R

我國是世界第一蠶絲大國，蠶繭和蠶絲產(chǎn)量分別占世界的76%和81%。蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對(duì)增加農(nóng)民收入、解決三農(nóng)問題和生態(tài)建設(shè)、環(huán)境保護(hù)具有重要作用。但是，每年蠶病給我國蠶桑產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中家蠶核型多角體病毒(nucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染引起的家蠶血液型膿病尤為嚴(yán)重[1]。目前，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所培育的“華康”系列和廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)管理總站培育的“桂蠶N2”都取得了顯著的抗BmNPV效果[2-3]。其中，桂蠶N2原種是由中系NC99R和NC9C、日系NJ7和NJZ四元雜交獲得，其中NC99R是以抗病品種材料955萍和932 (石) 為母本(99)，限性品種CVDAR為父本(R) 進(jìn)行雜交選育的抗性品系，適宜亞熱帶蠶區(qū)飼養(yǎng)[4]。因此，鑒定其親本NC99R抗BmNPV特征及其抗病機(jī)制，可為桂蠶N2綜合性狀改良和家蠶抗病育種研究提供新的思路，也為家蠶抗BmNPV關(guān)鍵基因篩選提供基礎(chǔ)支撐。自20世紀(jì)70年代開始，國內(nèi)外研究者就通過攻毒試驗(yàn)篩選對(duì)BmNPV耐受性較高的家蠶品系，對(duì)抗性品種選育提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[5-6]。1991年，陳克平首次對(duì)現(xiàn)存的344個(gè)家蠶品系進(jìn)行了抗病毒耐受性篩選，確定家蠶耐受BmNPV呈正態(tài)分布，并發(fā)現(xiàn)一株抗BmNPV抗性較高的品系NB；隨后對(duì)該品系和其親本易感品系306進(jìn)行了定位克隆、重測序、雙向電泳、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等分析，鑒定到一些抗BmNPV相關(guān)基因，為家蠶抗病育種研究提供了大量素材[6-13]。同時(shí)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所過選育的“華康”系列也具有高抗BmNPV能力，對(duì)其親本抗性品系871C和敏感品系871進(jìn)行了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析和機(jī)制研究，目前已經(jīng)初步定位其抗性基因所在染色體位置，并對(duì)BmNPV在該品系中侵染特征進(jìn)行解析，確定了其侵染阻斷路徑在BmNPV復(fù)制第一輪完成之后[3, 14-15]。而“桂蠶N2”自2006年選育以來，對(duì)其抗性特征描述和抗性機(jī)制解析鮮有報(bào)道，對(duì)其抗性特征基礎(chǔ)研究更為匱乏。鑒于其在兩廣地區(qū)推廣應(yīng)用價(jià)值，迫切需要確定其親本NC99R抗性特征和抗性機(jī)制[4, 15]。本研究通過分析BmNPV入侵家蠶中腸細(xì)胞和血液特征，鑒定BmNPV在抗性品系中受抑制機(jī)制，是從病毒角度著手解決家蠶抗性品系抗病機(jī)制的重要切入點(diǎn)。通過分析家蠶抗性品系NC99R抗BmNPV特征，確定家蠶抗性品系阻斷BmNPV入侵特征，可為家蠶抗性品系抗性機(jī)制解析提供借鑒，為家蠶抗病育種研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 家蠶品系和病毒

家蠶大造品系、抗性品系NC99R和BmNPV病毒為西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 半致死劑量分析

正常飼養(yǎng)對(duì)照品系DZ和抗性品系NC99R至四齡起蠶，挑選葉面平整的新鮮桑葉剪裁成 1 cm×1 cm，每片桑葉定量添加不同濃度梯度的病毒懸液(106PIBs /mL、l07PIBs/mL、108PIBs/mL、109PIBs/mL和1010PIBs/mL)，每頭家蠶幼蟲添加10 μL，終濃度為1×104、1×105、1×106、1×107和1×108多角體/頭，陰性對(duì)照桑葉上添食相同體積的ddH2O。每組選擇40頭個(gè)體體型相似的健康的DZ和NC99R品系幼蟲，待桑葉表面風(fēng)干后，逐頭幼蟲進(jìn)行口服感染喂食病毒粒子，飼養(yǎng)1–4 h后，分別挑選完全吃完桑葉的DZ和NC99R品系幼蟲30頭進(jìn)行正常飼養(yǎng)，每天按正常品系進(jìn)行喂養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)喂食后10 d內(nèi)家蠶幼蟲死亡個(gè)體，并解剖確定感染BmNPV，統(tǒng)計(jì)每天死亡率，并計(jì)算最終死亡率。利用SPSS軟件計(jì)算半致死劑量。

1.3 BmNPV DNA拷貝數(shù)分析

DZ和NC99R品系分別感染BmNPV 6、12、24、48、72、96 h后，每組分別提取中腸組織，?80 ℃保存。取滅菌后預(yù)冷的干凈研缽，加入液氮和中腸組織，研磨成細(xì)粉狀，收集到1.5 mL無RNA酶離心管中，利用Promega全基因組提取試劑盒提取中腸組織BmNPV基因組DNA。BmNPV基因組DNA提取步驟為：1) 加600 μL核酸裂解液，劇烈振蕩為流動(dòng)液體；2) 加200 μL蛋白質(zhì)純化液，振蕩20 s，置于冰上5 min，13 400 r/min離心10 min；3) 吸取上清至包含600 μL異丙醇的離心管中，輕輕顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色線性DNA，13 400 r/min離心5 min；4) 棄上清后加600 μL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒，13 400 r/min離心5 min，棄上清；5) 在超凈工作臺(tái)風(fēng)干酒精后，加入30 μL DNA提取液在65 ℃溶解1 h，測取DNA提取濃度，根據(jù)所測濃度加水稀釋至濃度為100 ng/μL，進(jìn)行定量PCR，根據(jù)BmNPV DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同樣品BmNPV拷貝數(shù)[16]。本研究所用引物見表1。

1.4 石蠟切片制備和染色

DZ和NC99R品系分別感染BmNPV 0、12、24、48、72、96 h后，分別將每組干凈的中腸組織取出，放置于3倍體積以上的固定液中做好標(biāo)記并保存，固定24 h后用70%乙醇換洗樣品，直到淡黃色消失為止，將樣品放置于包埋盒中?4 ℃保存在70%乙醇中。將包埋盒進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋以及切片等一系列的操作后，根據(jù)樣品名稱、切片厚度、日期做好相應(yīng)的標(biāo)記放置于展片板在37 ℃烘箱過夜或60 ℃烘烤2 h。將蠟片經(jīng)過脫蠟、水化后進(jìn)行染色，其中蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，染色后進(jìn)行脫水和透明，鏡檢檢查染色情況是否合格，最后封片，干燥后利用熒光顯微觀察不同樣品，并記錄。

1.5 熒光定量PCR (RT-PCR) 分析

DZ和NC99R品系分別感染BmNPV 0、12、24、48、72、96 h后，進(jìn)行研磨分裝，總RNA使用 TRIzol Reagent (Invitrogen) 提取，檢測提取成功后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega) 合成cDNA，保存于?20 ℃?zhèn)溆?。按? μL iTMUniversal SYBR?Green Supermix (Bio-Rad) 定量試劑， 3.6 μL dH2O，0.2 μL Primer F/R，1 μL cDNA模板進(jìn)行混勻，混勻后加入定量板的孔中，即每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。將分裝好的反應(yīng)產(chǎn)物連同定量PCR板4 ℃、3 000×離心3 min后，放置在定量PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，65 ℃以0.5 ℃每5 s梯度增長至95 ℃。以家蠶真核翻譯起始因子4A (探針號(hào)：sw22934) 為內(nèi)參基因，相對(duì)定量PCR的數(shù)據(jù)處理用2-△CT法。本研究所用引物見表1。

DZ和NC99R品系中病毒DNA拷貝數(shù)分析采用絕對(duì)定量方法，將提取的不同樣品的病毒基因組DNA稀釋到相同濃度(100 ng/μL) 的家蠶組織作為PCR模板，以病毒基因?yàn)槎恳铮圆煌♂対舛?10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6) 的BmNPV基因組為標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的CT值為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線為=16.351–3.970 9，代表熒光定量的CT值，代表基因組拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值。采用上述定量PCR體系和條件進(jìn)行絕對(duì)定量檢測，根據(jù)不同樣品的CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同樣品病毒基因組拷貝數(shù)。

表1 本研究所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶品系DZ和NC99R對(duì)BmNPV的抗性鑒定

選取健康的家蠶品系DZ和NC99R飼養(yǎng)至四齡起蠶，經(jīng)口感染BmNPV病毒粒子，正常飼養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)其感染后10 d內(nèi)的死亡情況。結(jié)果顯示DZ品系經(jīng)口添食1×107和1×108多角體/頭時(shí)，死亡率為100%，經(jīng)口添食1×106、1×105、和1×104多角體/頭時(shí)，死亡率分別為84.56%、42.52%和26.38%；而抗性品系NC99R在添毒劑量為1×108、1×107、1×106、1×105和1×104多角體/頭時(shí)，死亡率分別為82.20%、62.9%、39.6%、22.00%和13.20% (圖1)。統(tǒng)計(jì)分析顯示在各添食劑量條件下，NC99R存活率均顯著高于DZ品系。根據(jù)死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用SPSS分析軟件計(jì)算分析不同品系家蠶半致死劑量，結(jié)果顯示家蠶品系DZ和NC99R的半致死劑量分別為1.2×105和1.8×106多角體/頭，家蠶品系NC99R抗性水平高于DZ 15倍，呈明顯抗性(圖1)。

圖1 家蠶品系DZ和NC99R半致死劑量分析

2.2 口服感染和體腔注射家蠶品系DZ和NC99R死亡率分析

根據(jù)兩種家蠶品系DZ和NC99R死亡率統(tǒng)計(jì)分析，我們鑒定了NC99R品系在1×107多角體/頭感染時(shí)出現(xiàn)大面積死亡，為了確定NC99R品系表現(xiàn)抗性差異的時(shí)間特征，我們分別選取1×106多角體/頭口服感染和1×106粒子/頭體腔注射兩個(gè)品系。結(jié)果顯示口服感染時(shí)，DZ品系死亡高峰出現(xiàn)在感染后5–6 d，而抗性品系NC99R死亡高峰出現(xiàn)在感染后7–8 d，死亡時(shí)間相對(duì)于對(duì)照組推遲2 d左右，死亡率顯著高于對(duì)照組(圖2A)。為了判斷這種抗性差異是否具有組織特異性和侵染差異，同時(shí)體腔注射1×106粒子/頭BV病毒，結(jié)果顯示BV注射后DZ品系在4–6 d大規(guī)模死亡，而抗性品系NC99R保持較高的抗性，在第6天出現(xiàn)少量死亡，最終呈現(xiàn)顯著抗性水平(圖2B)。

2.3 BmNPV在家蠶品系DZ和NC99R中DNA復(fù)制分析

為了在分子水平確定DZ和NC99R品系在體腔注射和口服感染后的差異，本研究通過RT-PCR分析了不同處理?xiàng)l件下BmNPV DNA拷貝數(shù)變化。結(jié)果顯示在添食1×106多角體/頭時(shí)，DZ品系中BmNPV拷貝數(shù)成對(duì)數(shù)上升，而抗性品系NC99R中在感染后相對(duì)DZ增加緩慢，在感染 72 h后，拷貝數(shù)保持在穩(wěn)定水平，可能是病毒粒子停止進(jìn)一步復(fù)制(圖3A)。同理，體腔注射BV病毒顯示，對(duì)照組DZ中BmNPV拷貝數(shù)同樣呈指數(shù)增加，而抗性品系NC99R中在感染24 h后BmNPV拷貝數(shù)逐漸下降，維持在較低水平(圖3B)。結(jié)合上述結(jié)果，說明口服感染后原發(fā)感染能夠降低BmNPV毒力，但是不能完全抑制BmNPV復(fù)制，隨著BV的二次感染，血液等組織對(duì)BmNPV能夠更高效地抑制病毒增殖。

圖2 口服感染和體腔注射家蠶品系DZ和NC99R死亡率分析

圖3 家蠶品系DZ和NC99R中BmNPV gp41拷貝數(shù)分析

2.4 家蠶品系DZ和NC99R感染BmNPV后中腸病理學(xué)變化分析

中腸和血液組織是家蠶免疫防控的主要組織，中腸組織同樣也是BmNPV原發(fā)感染的場所。為了進(jìn)一步探究BmNPV在中腸組織增殖情況，本研究對(duì)感染BmNPV 12、24、48、72、96 h后中腸組織進(jìn)行了組織切片觀察。結(jié)果顯示家蠶品系DZ和NC99R在未感染條件下，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)排列緊密，沒有顯著的差異。添食BmNPV 48 h后，DZ品系上皮細(xì)胞分泌物開始增多；72 h后，DZ品系細(xì)胞核染色變淺、細(xì)胞縮小、細(xì)胞核比例增大、往腸腔靠近；96 h后，DZ品系上皮柱狀細(xì)胞形態(tài)紊亂，細(xì)胞核繼續(xù)膨大，部分細(xì)胞核有脫落的趨勢，出現(xiàn)大量空泡。而抗性品系NC99R在感染72 h后才開始往兩側(cè)移動(dòng)，細(xì)胞核逐漸變大；在感染96 h后，上皮細(xì)胞仍較為整齊，細(xì)胞比例仍正常，但是細(xì)胞核出現(xiàn)膨大現(xiàn)象(圖4)。

2.5 BmNPV不同時(shí)期表達(dá)基因在DZ和NC99R品系中轉(zhuǎn)錄水平分析

桿狀病毒感染宿主細(xì)胞，其基因表達(dá)具有級(jí)聯(lián)調(diào)控的特征，早期基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活晚期基因的表達(dá)[17]。為了進(jìn)一步探究BmNPV在抗性品系NC99R中被抑制表達(dá)的特征，本研究選擇BmNPV立即早期基因、早期基因、晚期基因和極晚期基因?yàn)殍b定不同時(shí)期被抑制的標(biāo)記基因。RT-PCR顯示DZ品系在BmNPV感染后，隨著感染時(shí)間的增加相應(yīng)基因表達(dá)水平逐步上升。而抗性品系NC99R在口服感染和體腔注射后，不同時(shí)期基因均在24 h后開始下調(diào)表達(dá)，其中立即早期基因在口服感染48 h后幾乎檢測不到轉(zhuǎn)錄，結(jié)合體腔注射后24 h就檢測不到基因的轉(zhuǎn)錄，推測BmNPV在個(gè)體中完成第一輪復(fù)制后，沒有開始完整的生活周期(圖5)。以上結(jié)果初步闡述了是抗性品系NC99R導(dǎo)致了BmNPV在侵染后阻斷其完整的生活周期。

圖4 家蠶品系DZ和NC99R感染BmNPV后中腸病理學(xué)變化分析

圖5 BmNPV不同時(shí)期表達(dá)基因在DZ和NC99R品系中轉(zhuǎn)錄水平分析

3 討論

本研究采用半致死劑量、組織切片和熒光定量等技術(shù)，分析了抗性品系NC99R和對(duì)照組DZ在BmNPV感染過程中的差異特征，初步闡述了NC99R品系抑制BmNPV侵染路徑，這些研究結(jié)果為進(jìn)一步闡述抗性品系NC99R抑制BmNPV復(fù)制機(jī)制的解析提供了思路，為家蠶抗病品系抗病機(jī)制解析提供了參考。

目前，國內(nèi)外篩選到不同抗性特征的家蠶品系，其抗病毒能力也不盡相同。對(duì)家蠶抗病毒品系NC99R抗病毒能力鑒定，確定其半致死劑量達(dá)1.8×106多角體/頭，相比一般實(shí)用品系抗病毒能力提高10多倍，相比敏感品系抗性提高近1 000倍。并且，家蠶抗病毒品系NC99R能夠顯著延遲死亡時(shí)間1–2 d，在生產(chǎn)中同樣能夠降低發(fā)病率，說明桂蠶N2親本品系具有較高的育種價(jià)值。先前研究通過RNAi干涉、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或CRISPR/Cas9基因編輯等技術(shù)均能顯著提高家蠶品系抗病毒能力，最高能夠提高抗病毒能力近1 000倍[18-25]。桂蠶N2在兩廣地區(qū)以其產(chǎn)絲量高、綜合性能好，具有廣泛的推廣應(yīng)用市場，如果結(jié)合傳統(tǒng)育種的優(yōu)點(diǎn)，并利用分子育種手段，直接對(duì)實(shí)用品種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，這樣不僅能夠保持實(shí)用品系本身的優(yōu)點(diǎn)，同樣能夠進(jìn)一步提高實(shí)用品系的抗病毒能力。

先前遺傳規(guī)律進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NC99R可能具有多個(gè)抗性位點(diǎn)，數(shù)量性狀特征突出，與抗病材料NB和871C在定位克隆上有顯著差異，推測它們可能由不同的抗病基因控制或不同的調(diào)控機(jī)制調(diào)控[4,5,15,26-27]。為了確定這一推測，本研究分析了抗性品系NC99R和對(duì)照組DZ死亡率和BmNPV DNA，結(jié)果顯示體腔注射和口服感染BmNPV都表現(xiàn)為明顯延遲病毒感染和提高抗病毒能力，BmNPV 48 h前沒有顯著的下調(diào)，說明NC99R品系對(duì)病毒的口服感染和第1輪病毒復(fù)制增殖過程抑制不顯著，可能在第2輪復(fù)制過程進(jìn)行了抑制，結(jié)合體腔注射24 h后，BmNPV就開始顯著下調(diào)表達(dá)，說明NC99R品系對(duì)BV感染過程抑制效果更明顯。這和871C和NB的抗病毒過程并不一樣，先前研究表明871C和NB是口服感染過程直接抑制BmNPV復(fù)制的，這可能是NC99R品系抗病毒能力不如其他兩個(gè)的原因。BmNPV基因的表達(dá)是級(jí)聯(lián)調(diào)控模式，通過鑒定不同時(shí)期基因的表達(dá)可以準(zhǔn)確分析不同品系中BmNPV基因復(fù)制情況，RT-PCR結(jié)果說明BmNPV早期基因在感染24 h后就明顯下調(diào)表達(dá)，這一結(jié)果同先前研究蘋果蠹蛾(L)抗性品系抗蘋果蠹蛾顆粒體病毒(granulovirus，CpGV) 特征相似，同樣是在病毒復(fù)制早期抑制其感染，間接闡述了不同昆蟲抗病毒特征具有相關(guān)性[28-29]。

家蠶抗病毒品系NC99R具有顯著的抗病毒能力，半致死劑量達(dá)1.8×106多角體/頭；從BmNPV復(fù)制早期就開始抑制病毒DNA復(fù)制。下一步將集中研究BmNPV第一輪復(fù)制結(jié)束后，是否產(chǎn)生缺陷型病毒粒子，篩選抗BmNPV關(guān)鍵的宿主基因，完善家蠶抗病毒品系抗BmNPV機(jī)制。

4 結(jié)論

通過半致死劑量分析、組織病理學(xué)和熒光定量分析顯示家蠶品系NC99R具高抗病毒能力，主要抑制病毒早期基因表達(dá)，為完善家蠶抗病品系機(jī)制研究提供了思路。

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Mechanism analysis of Anti-BmNPV resistant strain NC99R

Zhanqi Dong1,2*, Xuejiao Lei1*, Qi Qin1, Xinling Zhang1, Liang Tang3, Meining Shi3, and Minhui Pan1,2

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China 2 Key Laboratory for Sericulture Functional Genomics and Biotechnology of Agricultural and Rural Affairs Ministry, Southwest University, Chongqing 400716, China 3 Guangxi Zhuang Autonomous Region Silkworm Technology Promotion Station, Nanning 530007, Guangxi, China

is a lepidopteran insect with important economic value.nucleopolyhedrovirus (BmNPV) causes huge economic loss to silkworm industry in China every year. The objective of this study is to determine the anti-BmNPV mechanism ofstrain NC99R, and to provide a basis for understanding the molecular mechanism of the silkworm resistance strain. The normal control Dazao (DZ) strain and the NC99R resistant strain were fed with occlusion bodies (OB). The median lethal dose (LD50) analysis of the DZ and NC99R showed that the LD50 of DZ was 1.2×105OBs/larva, while NC99R was 1.8×106OBs/larva. The LD50 of the NC99R was about 15 times higher than the DZ. The mortality of DZ and NC99R were analyzed, which were fed with 1×106OBs/larva and injection with 1×106BVs/larva. The results showed that the death peak of DZ was concentrated in the 4th to 6th day. And the death peak of NC99R was concentrated in the 6th to 8th day, with a delay of 1–2 days compared with the control. The BmNPV DNA copy number showed that the BmNPV genome in DZ proliferated rapidly. The copy number of BmNPV DNA in NC99R were increased slowly after oral infection and body injection. HE staining showed that midgut tissue has no significant difference between DZ and NC99R in the early stage of oral infection. At 96 h p.i., the nucleus of DZ midgut became larger and shedding. The NC99R had enlarged nuclei, but the cells were still arranged neatly. Finally, the expression of virus genes in different periods were analyzed by RT-PCR. The results indicated that the immediate early geneexpression levelsbegan to down-regulate after 24 h p.i.. The early, late, and extremely late genes were also down-regulated, and finally maintained at a lower expression level.

, BmNPV, resistance, NC99R

董戰(zhàn)旗, 雷雪蛟, 秦琪, 等. 家蠶抗性品系NC99R抗BmNPV作用機(jī)制分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 100–108.

Dong ZQ, Lei XJ, Qin Q, et al. Mechanism analysis of Anti-BmNPV resistant strain NC99R. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 100–108.

April 30, 2019;

May 31, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31872427, 31902214), China Agriculture Research System (No. CARS-18), Natural Science Foundation of Chongqing (No. cstc2019jcyj-msxm2371).

Minhui Pan. Tel/Fax: +86-23-68250716; E-mail: pmh047@126.com

*These authors contributed equally to this study.

10.13345/j.cjb.190170

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31872427, 31902214)，國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 (No. CARS-18)，重慶市自然科學(xué)基金 (No. cstc2019jcyj-msxm2371) 資助。

2019-06-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190617.1050.003.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)