人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證

陳玉，郭仁朋，黃賽飛，宋丹，劉蓉

·醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)·

人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證

陳玉，郭仁朋，黃賽飛，宋丹，劉蓉

南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095

同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體(HOPS) 由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種蛋白組成，能夠通過膜融合機(jī)制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運(yùn)輸。已有研究表明其可以作為融合因子來促進(jìn)自噬體與溶酶體膜融合過程。為在體外確定HOPS復(fù)合體與自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用，首先利用PCR技術(shù)從已有質(zhì)粒中擴(kuò)增得到6種基因的編碼序列，將其連接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表達(dá)載體上，經(jīng)菌落PCR初步鑒定和DNA測序無誤后成功構(gòu)建6種原核表達(dá)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)；利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱對重組蛋白進(jìn)行純化，煙草蝕紋病毒(TEV) 蛋白酶酶切掉GST或His-NusA標(biāo)簽，得到分子量約為105kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 kDa的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白；通過體外GST pull-down技術(shù)對6種蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)自噬性SNARE蛋白STX17和6種重組蛋白在體外均具有直接相互作用，為深入探究HOPS復(fù)合體參與自噬體與溶酶體膜融合過程中的功能及作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體 (HOPS)，原核表達(dá)，蛋白純化，自噬

HOPS是一個(gè)在哺乳動(dòng)物和酵母之間高度保守的多蛋白復(fù)合體，由6個(gè)相對分子質(zhì)量為79–123 kDa的蛋白組成。長約30 nm，形狀類似“海馬”，Vps41位于頂部鄰近Vps16和Vps33亞基，而Vps39位于底部與Vps18和Vps11亞基連接在一起[1]。HOPS又被稱為Vps (Vacuolar protein sorting) 復(fù)合物，先發(fā)現(xiàn)的Vps11、Vps16、Vps18和Vps33構(gòu)成Vps-C complex，普遍存在于酵母、果蠅、植物、哺乳動(dòng)物中。Vps-C complex能夠通過自噬過程、膽固醇和脂質(zhì)代謝途徑處理和再循環(huán)細(xì)胞質(zhì)組分[2-3]。另外兩個(gè)亞基Vps39及Vps41則屬于Vps-B complex，與Vps-C complex形成了相對分子質(zhì)量約633 kDa的HOPS復(fù)合體。最初HOPS只被鑒定為酵母內(nèi)涵體上的一種聚集復(fù)合物，如今其已被確定能夠影響內(nèi)涵體和溶酶體的成熟和傳遞過程，可以通過膜融合機(jī)制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運(yùn)輸，對于酵母和哺乳動(dòng)物中自噬體與液泡/溶酶體的膜融合過程至關(guān)重要[4-6]。

細(xì)胞自噬廣泛存在于真核生物中，是一種自我消化、進(jìn)化保守的過程，依賴于溶酶體降解途徑[7]。自噬的過程需要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：自噬的誘導(dǎo)；自噬前體的形成；自噬前體的延伸及閉合；自噬體的成熟；自噬體與溶酶體的融合及內(nèi)容物的降解[8]。其中自噬體與溶酶體的融合是自噬的關(guān)鍵過程，需要多種蛋白的參與。已知SNAREs屬于膜錨定蛋白，主要作用是介導(dǎo)囊泡與靶膜的融合[9]。在融合過程中，定位于兩個(gè)待融合膜上不同形式的SNARE蛋白會形成復(fù)合體，這一復(fù)合體之間的螺旋結(jié)構(gòu)相互纏繞，從而使膜拉近并融合。研究表明 STX17 (定位于自噬體上) 通過與SNAP29形成二元復(fù)合物，再與VAMP8 (定位于溶酶體上) 相互作用形成STX17- SNAP29-VAMP8三元復(fù)合物從而介導(dǎo)自噬體與溶酶體的融合[10]。形成SNARE復(fù)合物對膜融合過程至關(guān)重要，但它們的自發(fā)組裝效率很低，由SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合過程均需要一些聚集因子的調(diào)節(jié)。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，HOPS復(fù)合體通過與自噬性SNARE蛋白STX17相互作用來促進(jìn)SNARE復(fù)合物的組裝，加速由SNARE蛋白介導(dǎo)的膜融合過程[11-12]。但是，HOPS復(fù)合體亞基與自噬SNARE蛋白STX17是直接發(fā)生相互作用還是由其他蛋白進(jìn)行介導(dǎo)的，這一問題目前尚未可知。

鑒于HOPS復(fù)合體在細(xì)胞自噬膜融合過程中的重要作用，本研究擬純化得到VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種組成人HOPS復(fù)合體的重組蛋白，利用GST pull-down技術(shù)，在體外鑒定HOPS復(fù)合體與STX17蛋白是否存在直接相互作用，為尋找HOPS復(fù)合體的互作蛋白和進(jìn)一步探究其在自噬體與溶酶體融合過程中的功能及作用機(jī)制奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX 4T-1-GST原核表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET-28a(+)改造的pET-His-NusA原核表達(dá)質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院萬群實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；pcDNA3.1-HA-等6種重組質(zhì)粒由浙江大學(xué)孫啟明實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)公司；PCR試劑盒、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；Trelief SoSoo Cloning Kit購自南京擎科生物技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ、HⅠ、d Ⅲ和Ⅰ購自NEB公司；膠回收試劑盒、DNA marker購自Genstar公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；TAE、氨芐青霉素 (Ampicillin)、卡那青霉素 (Kanamycin)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 和考馬斯快速染色液均購自北京索萊寶科技有限公司；引物合成及DNA序列測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；Glutathione Sepharose 4B購自美國GE公司；Ni Focurose 6FF購自武漢匯研生物科技股份有限公司；鼠單克隆抗Flag抗體購自Sigma公司；鼠單克隆抗HA抗體、鼠單克隆抗VPS11、VPS18、VPS39、VPS41抗體均購自Santa Cruz公司；兔單克隆抗VPS33抗體購自Genetex公司；兔單克隆抗VPS16抗體購自Proteintech公司；兔單克隆抗STX17抗體購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG購自SBA公司；化學(xué)發(fā)光試劑購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

所用引物見表1。

1.2.2 組成人HOPS復(fù)合體6種基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

以pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-、pcDNA3.1-HA-(已有質(zhì)粒) 為模板，利用PrimerSTAR 酶擴(kuò)增目的片段，條件如下：98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，膠回收目的片段。

1.2.3 6種重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

37 ℃酶切過夜條件下，HⅠ和d Ⅲ雙酶切pET-His-NusA質(zhì)粒，RⅠ和Ⅰ、HⅠ和Ⅰ分別雙酶切pGEX 4T-1-GST質(zhì)粒，回收線性化載體。1) 無縫連接方式：Trelief SoSoo Cloning Kit連接線性化載體與目的片段，轉(zhuǎn)化.DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜。2) T4連接方式：雙酶切PCR產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶將帶有粘性末端的目的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化.DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆，進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳初步檢測，選擇條帶位置正確的菌液進(jìn)行測序鑒定。測序無誤后，進(jìn)行質(zhì)粒小提。

1.2.4 重組蛋白的分離純化

將測序正確的6種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3)，挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。1) 鎳柱親和層析：37 ℃培養(yǎng)至6000.9–1.2，加入IPTG (終濃度為0.2 mmol/L)，22 ℃誘導(dǎo)16 h，4 ℃離心棄上清收集菌體，用.裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，1.4 mmol/L β-巰基乙醇，0.05% Tween 20，0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑) 重懸，靜置 30 min后超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心取上清。2倍柱體積的平衡液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，5%甘油) 清洗鎳柱，隨后加入菌體上清，4 ℃旋轉(zhuǎn)2 h，棄流出液，加入2倍柱體積的清洗液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，5%甘油) 清洗，加入洗脫液 (20 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，5%甘油) 洗脫，得到蛋白液①加入TEV酶切掉標(biāo)簽，二次過柱時(shí)標(biāo)簽蛋白與鎳柱結(jié)合，收集蛋白液②即得最終純化好的重組蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測。2) 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂親和層析：37 ℃培養(yǎng)至6000.4–0.6，加入IPTG (終濃度為0.2 mmol/L)，28 ℃誘導(dǎo)5 h，4 ℃離心棄上清收集菌體，用.裂解緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% β-巰基乙醇，1% Triton X-100，0.2 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑) 重懸，靜置30 min后超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心取上清，并加入適量Glutathione Sepharose 4B (玻璃珠)，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日先清洗玻璃珠，再加入適量.裂解緩沖液和TEV酶，旋轉(zhuǎn)2 h，離心收集上清即得最終純化好的重組蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting方法檢測。

表1 試驗(yàn)所用引物

Note: underlined sequences are restriction enzyme sites.

1.2.5GST pull-down驗(yàn)證HOPS組分蛋白與STX17的相互作用

將pGEX 4T-1-TEV-Flag-重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)離心得到菌體，用.裂解緩沖液重懸，靜置30 min后超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心取上清，加入相應(yīng)Glutathione Sepharose 4B (對照組1為純玻璃珠，不加Flag-STX17蛋白上清)，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日清洗玻璃珠，在實(shí)驗(yàn)組與對照組1中加入已純化好的HOPS蛋白，對照組2中加入等量緩沖液，旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h，離心棄上清并清洗玻璃珠，再加入適量.裂解緩沖液和TEV酶，4 ℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)2 h，最后收集上清并制備樣品，采用Western blotting方法檢測HOPS組分蛋白與STX17之間的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的克隆及鑒定

以6種已有質(zhì)粒為模板，利用設(shè)計(jì)的6對引物擴(kuò)增得到目的片段，其中全長2 826 bp，全長2 922 bp，全長2 628 bp，全長2 520 bp，全長1 791 bp，全長2 565 bp，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定獲得與預(yù)期片段一致的6種PCR產(chǎn)物 (圖1和圖2)。

圖1 VPS18、VPS39和VPS11基因的PCR擴(kuò)增

圖2 VPS16、VPS41和VPS33基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用HⅠ和d Ⅲ雙酶切pET-His-NusA質(zhì)粒 (圖3)，用RⅠ和Ⅰ或HⅠ和Ⅰ分別雙酶切pGEX 4T-1-GST質(zhì)粒 (圖4)，37 ℃酶切過夜后得到3種線性化載體。將載體與目的片段分別連接并轉(zhuǎn)化。次日，挑取單克隆，進(jìn)行菌落PCR，用瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定 (圖5和圖6)。菌落PCR驗(yàn)證正確的菌液送測，正反向測序結(jié)果與基因序列一致，說明6種組成HOPS復(fù)合體的原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的純化

經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting方法檢測得出以下結(jié)果：利用鎳柱親和層析方式成功純化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重組蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重組蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重組蛋白 (圖7)；利用谷胱甘肽親和層析方式成功純化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重組蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重組蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重組蛋白 (圖8)。

圖3 pET-His-NusA載體圖譜

圖4 pGEX 4T-1-GST載體圖譜

圖5 pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、VPS39、VPS18重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定結(jié)果

圖6 pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、VPS41、VPS33重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定結(jié)果

2.4 HOPS蛋白與Flag-STX17蛋白的體外相互作用

以Flag-STX17為誘餌蛋白，首先將其與Glutathione Sepharose 4B結(jié)合，然后分別加入純化好的6種重組蛋白，待HOPS組分蛋白與Flag-STX17蛋白充分結(jié)合后，用TEV蛋白酶進(jìn)行洗脫。若兩種蛋白沒有直接相互作用，添加的蛋白被清洗掉，則上清中無此添加蛋白，用特異性抗體將檢測不出相應(yīng)條帶。結(jié)果如圖9所示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在分子量為105、97、108、70、97、98 kDa左右分別檢測出HA-VPS11、Flag-VPS16、HA-VPS18、Flag-VPS33、HA-VPS39、Flag-VPS41蛋白的特異性條帶，并且同一位置對照組1和2均無非特異性條帶，以上結(jié)果一方面說明制備的重組蛋白均具有生物學(xué)功能，另一方面說明組成HOPS復(fù)合體的6種重組蛋白與STX17蛋白在體外均發(fā)生直接相互作用，不存在第三者在中間作為“橋梁”形成間接相互作用。

圖7 HA-VPS11、HA-VPS18、HA-VPS39重組蛋白的SDS-PAGE (A) 與Western blotting (B) 法分析

圖8 Flag-VPS16、Flag-VPS33、Flag-VPS41重組蛋白的SDS-PAGE (A) 與Western blotting (B) 法分析

圖9 組成HOPS復(fù)合體的6種重組蛋白與Flag-STX17相互作用的體外GST pull down結(jié)果

3 討論

當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)下自噬體會吞噬長壽命蛋白，將其遞送至溶酶體進(jìn)行降解，從而回收降解所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)用來供能，使細(xì)胞在應(yīng)激條件下循環(huán)產(chǎn)生能量來繼續(xù)存活[13]。自噬還可以降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和受損害的細(xì)胞器，消除細(xì)胞內(nèi)的病原體以此維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14]。研究者們已經(jīng)在細(xì)胞和分子生物學(xué)水平上證實(shí)了自噬可以改善因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、微生物感染和蛋白質(zhì)聚集體積累引起的疾病[15]。目前對于細(xì)胞自噬與疾病的研究已包括衰老、病原體感染、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[16-17]。對自噬研究的深入將會對這些疾病的治療提供新的方法，而對與自噬相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的解析可能會對未來疾病的治療提供潛在藥物靶標(biāo)[18]。

如今，自噬體的形成機(jī)制已得到廣泛研究，而自噬體與溶酶體融合的分子機(jī)制尚不明朗。已知自噬體與溶酶體的融合經(jīng)歷了聯(lián)結(jié)、錨定、膜融合3個(gè)步驟，SNAREs在這一過程中發(fā)揮了重要作用。2012年Itakura等[19]首先確定了自噬體與溶酶體膜融合需要自噬性SNARE蛋白STX17的參與，STX17-SNAP29-VAMP8三元復(fù)合物的形成能介導(dǎo)這一膜融合過程[20]。但自噬體與溶酶體之間一些聚集因子的作用尚不清楚，因此還有許多蛋白的功能需要進(jìn)行驗(yàn)證。2014年Jiang等[11]利用免疫共沉淀 (Co-IP) 和質(zhì)譜分析 (MS) 兩種方法確定了與STX17相互作用的兩種蛋白VPS33及VPS16，當(dāng)利用siRNA干擾、或基因的表達(dá)會阻斷自噬流過程，造成STX17和LC3蛋白的積累。在293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染帶Flag標(biāo)簽的STX17和GFP標(biāo)簽的HOPS復(fù)合體亞基，結(jié)果表明所有的HOPS組分蛋白在體內(nèi)都與STX17有相互作用，但是兩者在體外的相互作用還未得到驗(yàn)證。因?yàn)镃o-IP結(jié)果只能證明兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用，這種作用可能是直接相互作用，也可能是第三者在中間作為“橋梁”，形成復(fù)合物后的間接相互作用；而GST pull-down是一種常用的探究蛋白質(zhì)體外相互作用的技術(shù)，該方法能在體外鑒定兩種蛋白質(zhì)是否發(fā)生直接的相互作用從而消除其他蛋白質(zhì)的影響。因此本試驗(yàn)純化出6種構(gòu)成人HOPS復(fù)合體的重組蛋白，采用GST pull-down技術(shù)證實(shí)HOPS復(fù)合體與STX17蛋白在體外具有直接相互作用，為在體外揭示HOPS復(fù)合體在自噬體與溶酶體膜融合過程中的作用機(jī)制提供切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)途徑，并為進(jìn)一步研究HOPS的生物學(xué)功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pGEX 4T-1-GST-TEV-Flag-、和這3種重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量很低，即使優(yōu)化培養(yǎng)條件 (誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度)，效果也并不明顯，因此選擇pET-His-NusA載體重新構(gòu)建質(zhì)粒。此載體上含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子，為了減慢蛋白質(zhì)的合成速度、降低形成包涵體的概率，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)采用22 ℃誘導(dǎo)過夜的條件，最終在His-NusA促融標(biāo)簽的作用下實(shí)現(xiàn)VPS11、VPS18和VPS39的可溶性表達(dá)，成功純化出重組蛋白。本試驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒帶有GST和His兩種標(biāo)簽，GST-tag約為26 kDa，其能夠增加重組蛋白的可溶性，提高其穩(wěn)定性并且保留抗原性和生物活性[21-22]。同樣GST-tag也有相應(yīng)的缺點(diǎn)，分子量較大可能影響蛋白質(zhì)的功能[23]。His-tag通常是由6–10個(gè)組氨酸殘基組成，約0.84 kDa。His-tag作為蛋白純化的標(biāo)簽不會影響蛋白質(zhì)的可溶性及生物學(xué)功能，免疫原性較低，用這種方式純化的蛋白可以直接注入動(dòng)物體內(nèi)制備抗體，并且能夠與其他親和標(biāo)簽一起組成雙親和標(biāo)簽利于蛋白表達(dá)[24]。NusA是一個(gè)分子量約55 kDa的蛋白標(biāo)簽，由于其自身的可溶性很高，因此作為融合標(biāo)簽與目的蛋白結(jié)合后可以提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性及可溶性[25]。并且有研究表明，NusA還有利于促進(jìn)重組蛋白的正確折疊，提高蛋白的表達(dá)量[26]。由于GST、NusA這兩種融合標(biāo)簽的分子量較大，而本試驗(yàn)純化的6種重組蛋白相對分子質(zhì)量大多超過90 kDa，所以利用TEV蛋白酶去除重組蛋白的GST或NusA融合標(biāo)簽，從而消除親和標(biāo)簽對蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的影響。

綜上所述，本研究利用pGEX 4T-1-GST和pET-His-NusA載體成功構(gòu)建出組成人HOPS復(fù)合體的6種重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至.BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在原核系統(tǒng)中正確表達(dá)，并且采用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱兩種親和純化方法獲得VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41 這6種重組蛋白，GST pull-down試驗(yàn)證實(shí)HOPS復(fù)合體與定位在自噬體上的STX17蛋白在體外具有直接的相互作用。前面已介紹到自噬體與溶酶體融合過程中，自噬體上的STX17及SNAP29會首先形成二元復(fù)合體，繼而與溶酶體上的VAMP8形成三元復(fù)合體促進(jìn)膜融合。因此我們猜想HOPS復(fù)合體是否與SNARE蛋白STX17-SNAP29二元復(fù)合體或STX17-SNAP29- VAMP8三元復(fù)合體也存在直接相互作用，從而促進(jìn)這一膜融合過程。后續(xù)將繼續(xù)采用GST pull-down技術(shù)來探究HOPS復(fù)合體與SNARE蛋白不同復(fù)合體的體外相互作用關(guān)系，闡明HOPS復(fù)合體作為融合因子在膜融合過程中的作用機(jī)制。

[1] Br?cker C, Kuhlee A, Gatsogiannis C, et al. Molecular architecture of the multisubunit homotypic fusion and vacuole protein sorting (HOPS) tethering complex. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(6): 1991–1996.

[2] Yang T. RILP interacts with HOPs complex via VPS41 subunit to regulate endocytic trafficking[D]. Xiamen: Xiamen University, 2012 (in Chinese). 楊婷. RILP通過與HOPs復(fù)合體VPS41亞基相互作用調(diào)控胞吞途徑[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2012.

[3] Stroupe C, Collins KM, Fratti RA, et al. Purification of active HOPS complex reveals its affinities for phosphoinositides and the SNARE Vam7p. EMBO J, 2006, 25(8): 1579–1589.

[4] Hu WQ, Lin ZX, Chen LL, et al. Function of HOPS complex proteins in autophagy process. Chin J Cell Biol, 2011, 33(8): 855–860 (in Chinese). 胡晚秋, 林志祥, 陳麗蓮, 等. HOPS復(fù)合體蛋白在細(xì)胞自噬過程中的功能研究. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(8): 855–860.

[5] Balderhaar HJK, Ungermann C. CORVET and HOPS tethering complexes-coordinators of endosome and lysosome fusion. J Cell Sci, 2013, 126: 1307–1316.

[6] Nickerson DP, Brett CL, Merz AJ. Vps-C complexes: gatekeepers of endolysosomal traffic. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(4): 543–551.

[7] Yang ZF, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy. Nat Cell Biol, 2010, 12(9): 814–822.

[8] Huang J, Brumell JH. Bacteria-autophagy interplay: a battle for survival. Nat Rev Microbiol, 2014, 12(2): 101–114.

[9] Hong WJ. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta, 2005, 1744(2): 120–144.

[10] Itakura E, Mizushima N. Syntaxin 17: the autophagosomal SNARE. Autophagy, 2013, 9(6): 917–919.

[11] Jiang PD, Nishimura T, Sakamaki Y, et al. The HOPS complex mediates autophagosome-lysosome fusion through interaction with syntaxin 17. Mol Biol Cell, 2014, 25(8): 1327–1337.

[12] Cheng XW, Ma XL, Ding XM, et al. Pacer mediates the function of class III PI3K and HOPS complexes in autophagosome maturation by engaging Stx17. Mol Cell, 2017, 65(6): 1029–1043.e5.

[13] Zhi XY, Feng WZ, Rong YG, et al. Anatomy of autophagy: from the beginning to the end. Cell Mol Life Sci, 2018, 75(5): 815–831.

[14] Cadwell K. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol, 2016, 16(11): 661–675.

[15] Mathew R, Karantza-Wadsworth V, White E. Role of autophagy in cancer. Nat Rev Cancer, 2007, 7(12): 961–967.

[16] Xu CM, Wang ZJ, Wang M, et al. The study on autophagy induced by pseudorabies virus in PK-15 cells(PRV). J Nanjing Agric Univ, 2018, 41(4): 701–707 (in Chinese). 許長萌, 王志建, 王咪, 等. 豬偽狂犬病毒引起PK-15細(xì)胞自噬的研究. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 41(4): 701–707.

[17] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature, 2008, 451(7182): 1069–1075.

[18] Huang R, Xu XJ, Liang YC, et al. The expression, purification and characterization of human His-ATG4B protein. Chin J Cell Mol Immunol, 2015, 31(2): 173–176 (in Chinese). 黃蓉, 徐小潔, 梁迎春, 等. 人ATG4B的表達(dá)及蛋白純化和鑒定. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2015, 31(2): 173–176.

[19] Itakura E, Kishi-Itakura C, Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell, 2012, 151(6): 1256–1269.

[20] Liu R, Zhi XY, Zhong Q. ATG14 controls SNARE-mediated autophagosome fusion with a lysosome. Autophagy, 2015, 11(5): 847–849.

[21] McTigue MA, Williams DR, Tainer JA. Crystal structures of a schistosomal drug and vaccine target: glutathione S-transferase fromand its complex with the leading antischistomal drug praziquantel. J Mol Biol, 1995, 246(1): 21–27.

[22] Sch?fer F, Seip N, Maertens B, et al. Purification of GST-tagged proteins. Methods Enzymol, 2015, 559: 127–139.

[23] Wissmueller S, Font J, Liew CW, et al. Protein-protein interactions: analysis of a false positive GST pulldown result. Proteins, 2011, 79(8): 2365–2371.

[24] Zakalskiy AE, Zakalska OM, Rzhepetskyy YA, et al. Overexpression of (His)6-tagged human arginase I inand enzyme purification using metal affinity chromatography. Protein Expres Purif, 2012, 81(1): 63–68.

[25] Marco VD, Stier G, Blandin S, et al. The solubility and stability of recombinant proteins are increased by their fusion to NusA. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(3): 766–771.

[26] Nallamsetty S, Waugh DS. Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expres Purif, 2006, 45(1): 175–182.

Prokaryotic expression, protein purification and functional verification of human homotypic fusion and vacuole protein sorting complex subunit

Yu Chen, Renpeng Guo, Saifei Huang, Dan Song, and Rong Liu

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,Jiangsu,China

Homotypic fusion and vacuole protein sorting(HOPS) is a protein complex consisting of VPS11, VPS16, VPS18, VPS33, VPS39, VPS41 and regulates membrane transportthrough membrane fusion mechanisms. The evidence suggests that HOPS complex as a fusion factor, facilitates autophagosome-lysosome fusion. To determine whether the HOPS complex directly interacts with the autophagic SNARE protein STX17, the coding sequence of the six genes were amplified from the existing plasmids by PCR, and then ligated to the prokaryotic expression vector pGEX 4T-1-GST or pET-His-NusA. After identification through colony PCR and DNA sequencing, 6 recombinant plasmids were constructed and transferred intoBL21 (DE3). The recombinant proteins were purified by glutathione sepharose 4B and nickel column. We used the tobacco etch virus protease to cut off the GST-tag or His-NusA-tag, to obtain HA-VPS11 protein of about 105 kDa, Flag-VPS16 protein of about 97 kDa, HA-VPS18 protein of about 108 kDa, Flag-VPS33 protein of about 70 kDa, HA-VPS39 protein of about97 kDa, and Flag-VPS41 protein of about 98 kDa. The function of the purified proteins was verified byglutathione S-transferases pull-down assay, confirming that autophagic SNARE protein STX17 interacted directly with HOPS components. Our findings provide experimental basis to further study the function and mechanism of HOPS complex in the process of autophagosome-lysosome fusion.

human HOPS complex, prokaryotic expression, protein purification, autophagy

陳玉, 郭仁朋, 黃賽飛, 等. 人同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體亞基的原核表達(dá)、蛋白純化及功能驗(yàn)證. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(1): 133–142.

Chen Y, Guo RP, Huang SF, et al. Prokaryotic expression, protein purification and functional verification of human homotypic fusion and vacuole protein sorting complex subunit. Chin J Biotech, 2020, 36(1): 133–142.

April 10, 2019;

May 29, 2019

Supported by:Natural Science Foundation of Jiangsu Province,China (No. BK20160729), Central Colleges Basic Business (No. KYZ201651),Outstanding Youth Foundationof Jiangsu Province,China (No. BK20170025).

Rong Liu. Tel: +86-25-8439373; E-mail: liuronglr010@163.com

10.13345/j.cjb.190133

江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK20160729)，中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi) (No. KYZ201651)，江蘇省杰出青年基金 (No. BK20170025) 資助。

2019-07-12

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190710.1209.001.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)