蓖麻籽粒三酰甘油合成途徑及關(guān)鍵酶研究進(jìn)展

徐 瑤 ，劉俊羽 ，毛 爽 ，王英男 ，閻秀峰 ，藺吉祥 ，2*

（1.東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

蓖麻（Ricinus communis L.）是大戟科蓖麻屬一年生草本植物，生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，有很強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，對(duì)酸堿性土壤均有較好的適應(yīng)能力，在我國東北地區(qū)有著較廣泛的分布。與此同時(shí)，蓖麻也是多用途、經(jīng)濟(jì)效益高的油料作物，蓖麻油也被稱為“綠色石油”，全世界范圍內(nèi)，蓖麻油年產(chǎn)量可以達(dá)到50 萬噸[1]。但由于其含有蓖麻毒蛋白、蓖麻堿、蓖麻變應(yīng)原等有毒物質(zhì)，因此往往只用于工業(yè)產(chǎn)品的制備[2]。蓖麻籽油的主要成分是三酰甘油，種子油的品質(zhì)主要由脂肪酸種類和比例決定。一般來說，蓖麻籽粒油含量主要含六種羥基脂肪酸，即蓖麻油酸（84%）、亞油酸（7.3%）、油酸（5.5%）、棕櫚酸（1.3%）、硬脂酸（1.2%）和亞麻酸（0.5%）[3]。蓖麻種子油的結(jié)構(gòu)中含有活性基團(tuán)，因而可通過一系列化學(xué)反應(yīng)，如環(huán)氧化、脫氫、氫化、脂化等得到不同的改性產(chǎn)品，并廣泛應(yīng)用于生物柴油、紫外光固化涂料、潤滑劑、皮革加工助劑、泡沫塑料、水性聚氨酯等諸多領(lǐng)域[4，5]。因此，本文綜述蓖麻籽粒三酰甘油合成途徑和幾種關(guān)鍵酶，為提高籽粒油含量提供依據(jù)。

1 蓖麻三酰甘油合成途徑

蓖麻油中主要含有三種酰基甘油，依次為三蓖麻油酰甘油（RRR,Triricinolein）、二蓖麻油酰油酰甘油（ROR,1,3-Diricinoleoy-2-oleoyl-sn-glycerol）和二蓖麻油酰亞油酰甘油（RLR,1,3-Diricinoleoyl-2-linoleoyl-sn-glycerol）[6]。三酰甘油是蓖麻油主要積累形式，以油酰-CoA（Oleoyl-CoA）為原料在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成。

油酰-CoA 與溶血磷脂酰（LPC）反應(yīng)生成中間產(chǎn)物1- ?；?-2- 油酰基甘油（1-Acyl-2-oleoyl-sn-glycerol），經(jīng)過油酰-12- 羥化酶（FAH12）、磷脂酶A2（PLA2）、長鏈脂酰-COA 合成酶（LACS）一系列催化反應(yīng)生成蓖麻油酰 -COA 進(jìn)入脂酰 -CoA 依賴途徑中（Kennedy 途徑）[7，8]。在甘油3 磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAAT）的催化下將蓖麻油酰-COA 脂肪酸分別轉(zhuǎn)移到甘油三磷酸（G-3-P）的sn-1 和sn-2 位置上分別形成蓖麻油?！苎字岷?,2- 蓖麻油酰磷脂酸。磷脂酸磷酸酶（PAP）脫去甘油三磷酸sn-3 位置上的磷酸生成多羥脂酰- 二酰甘油（1,2-Diricinoleoyl-PA），隨后二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）將脂肪酸轉(zhuǎn)至sn-3 位置上生成三蓖麻油酰甘油（RRR）[9，10]。在非脂酰 -CoA 依賴途徑中，以蓖麻油酰-PC 為?；w，二酰甘油（DGAT）為受體，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（PDAT）將?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至DAGsn-3 位點(diǎn)形成三酰甘油，同時(shí)釋放LPC 再次進(jìn)入合成途徑中[11]。

中間產(chǎn)物1- 酰基-2- 油?；约叭ワ柡蜕?-亞油酰 -PC（2-Oleoyl-PC），在磷脂酶 C（PLC）和二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT） 的作用下生成 ROR 以及RLR。1- 酰基-2- 油?；部砷g接形成2- 亞油?；?磷脂（2-Linoleoyl-PE） 和 2- 蓖麻油?；?- 磷脂（2-Ricinoleoyl-PE）。但這兩個(gè)去向在蓖麻體內(nèi)被阻斷或部分阻斷[12，13]。

2 蓖麻三酰甘油合成關(guān)鍵酶

蓖麻三酰甘油合成途徑中涉及的酶較多，但主要集中在二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）、蓖麻油酰-12- 羥化酶（FAH12）和磷脂：二?；视王；D(zhuǎn)移酶（PDAT）的研究中。

二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是生物體內(nèi)TAG合成過程的末端，也是該途徑唯一的限速酶，其活性主要位于油體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[14]。人們?cè)谥参镏泄舶l(fā)現(xiàn)了三種類型的DGAT，其中蓖麻含有兩種類型，分別為DGAT1 和DGAT2[15]。高等植物DGAT1 蛋白的氨基酸殘基數(shù)多介于480～550，不同植物種類的DGAT 氨基端前100 個(gè)氨基酸殘基相似性不高于20%，而這之后的殘基相似性較高，一般會(huì)高于70%，分析其原因可能是由于N 端的不同進(jìn)而引起的DGAT1 酶屬性有所差異[16]。DGAT1 氨基酸序列中含有五個(gè)保守結(jié)構(gòu)，包括N 端RRR 區(qū)、?；o酶A 結(jié)合信號(hào)區(qū)、脂肪酸蛋白信號(hào)區(qū)、DAG 結(jié)合位點(diǎn)和C 端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜檢測(cè)基序，此外，還存在一個(gè)亮氨酸重復(fù)序列是與蛋白互作有關(guān)的信號(hào)區(qū)域[17]。另外，目前已經(jīng)知曉的植物DGAT2 蛋白氨基酸殘基數(shù)約為320 個(gè)。通過分析序列可以看出，N 端的保守性不如C 端。多項(xiàng)研究表明，DGAT 在控制脂肪酸進(jìn)入存儲(chǔ)TAG 的定量和定性流動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，并間接影響種子含油量、脂肪酸組成以及種子重量等多項(xiàng)參數(shù)[18]。例如，在DGAT1 過表達(dá)后，擬南芥和甘藍(lán)型油菜的種子油含量增加[19，20]。土壤真菌傘形目單胞菌（Mortierella）DGAT2 在大豆中的異源表達(dá)導(dǎo)致其種子油含量增加[21]。因此，編碼具有DGAT 活性蛋白質(zhì)的基因以改善油料作物中的油含量和脂肪酸組成已成為生物技術(shù)的目標(biāo)[22，23]。

在蓖麻油酸合成途徑中，通過蓖麻油酰-12- 羥化酶（FAH12）的作用，將磷脂酰膽堿羥化形成蓖麻油?；?，其活性位置主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[24，25]。FAH12 序列包含三個(gè)富含組氨酸的基序，在所有膜結(jié)合的去飽和酶中均保守，該結(jié)構(gòu)域在這些酶的活性位點(diǎn)中很重要，可能是結(jié)合鐵輔助因子的位點(diǎn)。研究表明FAH12 和擬南芥FAD2（油酸脫氫酶）氨基酸序列具有67%的同源性，證明了油酸羥化酶和油酸脫氫酶具有相似的反應(yīng)機(jī)制，并且FAH12 基因在蓖麻葉中表達(dá)量很少，但是在種子發(fā)育過程中卻可以高效表達(dá)[26]。RcFAH12 轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis）在其種子油中積累了20%的羥基脂肪酸（HFA），但始終不穩(wěn)定，后代種子發(fā)芽不良[27]。RcFAH12 也被引入蕓苔科油料植物甘藍(lán)型油菜和茶花種子中，轉(zhuǎn)基因植株分別顯示出15.6%和15%的HFA含量[28]。研究表明，當(dāng)RcFHA12 單獨(dú)表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因種子油中HFA 的最高和可遺傳水平為17%，并且高水平的HFA 可能會(huì)損害種子的生理代謝，導(dǎo)致種子重量、活力以及油量損失[29]。

另外，在蓖麻種子中二?；视王；D(zhuǎn)移酶（PDAT）也對(duì)油含量起著重要的作用。PDAT 是一種不依賴?；o酶A 獨(dú)立介導(dǎo)TAG 合成的酶。首先從酵母中鑒定出編碼PDAT 的LOR1 基因，隨后擬南芥同源基因PDAT1（At5g13640） 和 PDAT2 （At3g44830） 被 鑒 定 出[30]。PDAT1-2 與FAH12 表達(dá)相似，在發(fā)育的種子中表達(dá)并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與了蓖麻油酸轉(zhuǎn)化為TAG 生物過程。研究表明，蓖麻有三個(gè)PDAT 基因，分別為RcPDAT1-1、RcPDAT1-2 和 RcPDAT2。其中 RcPDAT1-1 和 RcPDAT2是植物中常見的PDAT 同源基因，但RcPDAT1-2 為蓖麻所特有的基因。在含F(xiàn)AH12 基因的擬南芥植株中表達(dá)RcPDAT1-2 提高種子中羥基脂肪酸（HFA）含量，并對(duì)植物的生長發(fā)育沒有影響[31]。另外也有研究表明，從蓖麻籽cDNA 文庫中克隆了編碼PDAT 三種酶cDNA，在擬南芥中與RcFAH12 共表達(dá)，其中一個(gè)亞型RcPDAT1A 將羥基脂肪酸（HFA）水平提高了27%[32]。RcPDAT1A 與RcPDAT1-2 進(jìn)行序列對(duì)比具有99%相同。上述研究表明蓖麻籽中特異性PDAT1-2 是轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生羥基脂肪酸的關(guān)鍵調(diào)控基因。

植物種子油及脂肪酸的合成積累是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，涉及到眾多酶基因及調(diào)節(jié)基因的協(xié)同表達(dá)，以及質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的共同參與，但同時(shí)也受到種子發(fā)育和外界環(huán)境因素的影響[33]。之前有研究表明通過表達(dá)種子油生物合成途徑上的酶基因或轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及環(huán)境因子的調(diào)控增加油菜、大豆種子含油量[34，35]。但是少有報(bào)道通過生物技術(shù)手段增加蓖麻種子油含量，因此進(jìn)一步研究蓖麻脂肪酸合成途徑、關(guān)鍵基因具有重要意義。