曹佳鑫 達(dá)夢(mèng)婷 龐海龍 賈凌云 馮漢青

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

近年來，由于礦產(chǎn)資源大規(guī)模開采、富含重金屬污染物的無序排放以及含重金屬的農(nóng)藥和化肥大量使用等因素，土壤和水體中重金屬的含量水平不斷增加。其中，鉛是當(dāng)前環(huán)境中最為常見且毒性最強(qiáng)的重金屬污染之一[1]。

鉛作為植物的非必需元素能夠?qū)χ参锂a(chǎn)生毒害作用[2]。研究表明，鉛會(huì)隨著植物吸收礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)時(shí)通過根部進(jìn)入植物體內(nèi)[3]，而過量的鉛吸收會(huì)抑制植物種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)，引起植物根部中毒，進(jìn)而造成發(fā)育遲緩并影響植物的形態(tài)建成[4]。細(xì)胞生物學(xué)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鉛會(huì)抑制植物酸性磷酸酶、酯酶、過氧化物酶等多種酶的活性，并通過增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生引起組織中的氧化壓力，進(jìn)而導(dǎo)致DNA的損傷、基因突變和膜質(zhì)過氧化等一系列變化[5～6]。而植物也能夠利用體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)在一定程度上抵抗鉛脅迫對(duì)植物造成的上述不良影響[7]。

三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate，ATP)是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存和供應(yīng)能量的貨幣分子。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，三磷酸腺苷通常存在于細(xì)胞內(nèi)部，通過提供能量來維持機(jī)體的正常代謝和生存。然而，許多研究表明，動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷可以通過通道蛋白、囊泡運(yùn)輸?shù)确绞奖会尫诺郊?xì)胞外基質(zhì)中，因而在細(xì)胞外基質(zhì)中也存在三磷酸腺苷，即胞外三磷酸腺苷(extracellular ATP,eATP)[8]。在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，胞外三磷酸腺苷能夠通過作用于細(xì)胞膜上的特異性受體調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞或組織的多種生理活動(dòng)，如平滑肌血小板的聚合、糖原的降解以及激素的釋放等[9]。近年來，植物胞外三磷酸腺苷及其生物學(xué)功能的研究也越來越受到關(guān)注和重視。現(xiàn)有的研究表明，植物細(xì)胞能夠通過ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白或膜泡運(yùn)輸?shù)姆绞綄⒓?xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷釋放到胞外[10～11]。進(jìn)一步研究揭示，植物的胞外三磷酸腺苷也是一種重要的信號(hào)分子，能夠通過受體介導(dǎo)的作用來調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞活力、生長(zhǎng)發(fā)育、抗病性、向地性等生理活動(dòng)[12]；此外，胞外三磷酸腺苷還能夠刺激Ca2+、活性氧、一氧化氮等信號(hào)分子的產(chǎn)生，且茉莉酸和乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)也被受到了胞外三磷酸腺苷的上游調(diào)控[13～15]。Choi等[16]已在擬南芥中鑒定出能特異性結(jié)合胞外三磷酸腺苷的受體蛋白，進(jìn)一步明確了胞外三磷酸腺苷在植物中作為信號(hào)分子的角色。最新的研究證明，胞外三磷酸腺苷可以緩解鹽脅迫引起的植物細(xì)胞死亡和呼吸抑制[17]。然而，在鉛這一常見的毒性重金屬脅迫發(fā)生時(shí)，植物胞外三磷酸腺苷在植物細(xì)胞中的生理學(xué)變化以及相應(yīng)的生物學(xué)功能尚未見明確的報(bào)道。

基于此，本文以煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物為材料，探討了在鉛離子脅迫下胞外三磷酸腺苷的水平變化以及其對(duì)細(xì)胞損傷、H2O2(過氧化氫)含量及H2O2清除酶活性的調(diào)節(jié)。相信該研究將進(jìn)一步豐富人們對(duì)鉛脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)在生理學(xué)變化的認(rèn)識(shí)，也有助于進(jìn)一步了解胞外三磷酸腺苷的生理學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用BY-2煙草懸浮細(xì)胞(NicotianatabacumL.cv.Bright Yellow-2)由香港中文大學(xué)姜里文教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

將懸浮細(xì)胞置于補(bǔ)充了3%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的蔗糖和0.4 mg·L-1的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS[18]液體培養(yǎng)基(pH=5.8)(Sigma-Aldrich公司)中，在25℃黑暗的條件下振蕩培養(yǎng)(振蕩速率為130 r·min-1)。每7天吸取10 mL的細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至100 mL新鮮的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。所有操作均在無菌條件下完成。

1.2.2 懸浮細(xì)胞的處理

取一定體積的處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞懸液，以1∶5的體積比用去離子水稀釋并搖勻，過濾后用去離子水洗滌1～2次并分別進(jìn)行如下兩組處理，第一組處理：將細(xì)胞分別置于30、100、200或400 μmol·L-1的Pb(NO3)2中，在25℃黑暗條件下振蕩孵育5 h，以等體積去離子水處理的懸浮細(xì)胞液作為對(duì)照；第二組處理：將細(xì)胞分別置于30 μmol·L-1ATP、200 μmol·L-1Pb(NO3)2+30 μmol·L-1ATP或200 μmol·L-1Pb(NO3)2中，在25℃黑暗條件下振蕩孵育5 h，以等體積去離子水處理的懸浮細(xì)胞液作為對(duì)照。

1.2.3 細(xì)胞損傷水平的測(cè)定

用伊文思藍(lán)(Evans blue)定量檢測(cè)細(xì)胞的受損程度。取1 mL處理后的細(xì)胞懸液，加入100 μL 0.25%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的伊文思藍(lán)染液混勻染色8 min，之后在3 000 r·min-1下離心3 min后棄上清，加入1 mL磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，于3 000 r·min-1離心3 min后棄上清以洗去未與細(xì)胞結(jié)合的染料。之后向細(xì)胞中加入1 mL 1%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的十二烷基磺酸鈉溶液(50%甲醇配制而成)，混勻后在50℃恒溫水浴中放置30 min，使細(xì)胞裂解。于10 000 r·min-1條件下離心10 min，取500 μL上清液，用蒸餾水稀釋至3 mL，在595 nm處測(cè)定吸光值，以反映細(xì)胞的損傷程度[19]。

熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate,FDA)可與活細(xì)胞結(jié)合，并在被激發(fā)后釋放出綠色熒光；碘化丙啶(Propidium iodide,PI)能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。上述兩種染料的雙染可用于進(jìn)一步定性檢測(cè)細(xì)胞活力以及受損水平[20]。取415 μL處理后的細(xì)胞懸液，加入20 μg·mL-1的FDA和5 μg·mL-1的PI(Sigma-Aldrich公司)，在室溫下黑暗培養(yǎng)10 min，加800 μL磷酸緩沖液(PBS)，在1 600 r·min-1下離心3 min，去上清液，將樣品在激光共聚焦顯微鏡(Leica,sp8)下進(jìn)行觀察并成像。

1.2.4 胞外及胞內(nèi)三磷酸腺苷水平的檢測(cè)

三磷酸腺苷水平使用螢火蟲尾部提取物(Sigma-Aldrich公司)測(cè)定。螢火蟲尾部提取物的主要成分為熒光素和熒光素酶，三磷酸腺苷可與熒光素經(jīng)熒光素酶催化發(fā)生反應(yīng)并釋放熒光，通過測(cè)定發(fā)光強(qiáng)弱測(cè)定三磷酸腺苷的水平[21]。取處理后的細(xì)胞懸液1 mL,在4 000 r·min-14℃條件下離心4 min，吸取上清液，進(jìn)行胞外三磷酸腺苷水平的測(cè)定；在去除上清的細(xì)胞中加入100 μL ATP檢測(cè)裂解液(Sigma-Aldrich公司)使細(xì)胞內(nèi)ATP釋放，于12 000 r·min-1條件下4℃離心5 min，上清液用于胞內(nèi)三磷酸腺苷水平的測(cè)定。測(cè)定方法依照制造商說明書進(jìn)行。

1.2.5 H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的測(cè)定

H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的測(cè)定分別采用過氧化氫含量檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶活性檢測(cè)試劑盒、過氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶公司)采用分光光度法定量檢測(cè)。具體操作參考說明書進(jìn)行。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上測(cè)量取4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，并將數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用雙總體t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)在P<0.05水平上的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb(NO3)2對(duì)細(xì)胞損傷水平和H2O2含量的影響

結(jié)果顯示，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加，細(xì)胞損傷水平呈顯著性上升。其中，30和100 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理分別使得細(xì)胞損傷水平較之對(duì)照增加了1.21和1.95倍；而200和400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理則使得細(xì)胞損傷水平進(jìn)一步上升，較之對(duì)照分別增加了2.84和3.14倍(圖1)。

圖1 不同濃度Pb(NO3)2處理下的細(xì)胞受損水平 不同字母表示在P<0.05水平上具有顯著性差異，下同。Fig.1 The level of cellular damage under the treatment with different concentrations of Pb(NO3)2 Different letters indicate significant differences at P<0.05,the same as below.

通過檢測(cè)H2O2的含量變化發(fā)現(xiàn)，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增大，細(xì)胞H2O2的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在30、100 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下細(xì)胞H2O2含量較之對(duì)照顯著性升高；在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下，H2O2含量達(dá)到最大值，在400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下H2O2含量較之峰值有所下降，但仍高于對(duì)照(圖2)。

圖2 不同濃度Pb(NO3)2處理下細(xì)胞內(nèi)H2O2水平Fig.2 The level of H2O2 under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖3 不同濃度Pb(NO3)2處理下CAT活性變化Fig.3 The level of CAT activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

2.2 Pb(NO3)2脅迫對(duì)CAT和POD活性的影響

CAT和POD是植物細(xì)胞清除過氧化氫的主要酶類。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加，CAT酶的活性表現(xiàn)出和H2O2含量相似的變化規(guī)律：在30、100、200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下，CAT酶的活性不斷增加，在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下達(dá)到最大值，較對(duì)照提高了5.8倍；而當(dāng)Pb(NO3)2濃度達(dá)到400 μmol·L-1時(shí)，CAT酶的活性較之峰值有所下降，但仍顯著性高于對(duì)照(圖3)。

POD酶活性則隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加不斷下降。與對(duì)照相比，在30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下，POD酶活性分別降低了20%，41.7%，58.1%，65.1%，其差異均達(dá)到顯著性水平(圖4)。

圖4 不同濃度Pb(NO3)2處理下POD活性變化Fig.4 The level of POD activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖5 不同濃度Pb(NO3)2處理下細(xì)胞外三磷酸腺苷含量的變化Fig.5 The level of extracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖6 不同濃度Pb(NO3)2處理下細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的變化Fig.6 The level of intracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖7 不同處理下細(xì)胞損傷水平的變化 A.伊文思蘭染色法檢測(cè)細(xì)胞損傷程度；B.FDA/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞損傷和活力程度Fig.7 The level of cellular damage under different treatments A.Detection of cell damage with Evansblue staining; B.Detection of cell damage and viabilityby FDA/PI staining

圖8 不同處理下細(xì)胞內(nèi)H2O2水平Fig.8 The level of H2O2 under different treatments

2.3 Pb(NO3)2脅迫對(duì)細(xì)胞外及胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的影響

如圖5顯示，隨Pb(NO3)2脅迫濃度的增大，細(xì)胞外三磷酸腺苷含量不斷降低。較之對(duì)照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2分別使細(xì)胞外三磷酸腺苷含量降低了24.8%、44.1%、52.6%、77.7%(圖5)。而胞內(nèi)三磷酸腺苷的含量則因Pb(NO3)2處理而有所增加：較于對(duì)照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理分別使細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷含量升高了0.297、2.73、2.02、2.84倍(圖6)。

2.4 外源三磷酸腺苷對(duì)Pb脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和H2O2積累的影響

如圖1～4的結(jié)果所示，在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下，細(xì)胞的H2O2含量達(dá)到了最大值，提示了該濃度Pb(NO3)2的處理使得細(xì)胞處于最大的氧化壓力。因此，本研究選擇了在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理的細(xì)胞中以探究鉛脅迫下胞外三磷酸腺苷對(duì)細(xì)胞損傷和H2O2以及H2O2清除酶的可能影響。

結(jié)果表明，對(duì)未經(jīng)過Pb(NO3)2脅迫的細(xì)胞加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷未引起細(xì)胞損傷和H2O2含量的顯著性變化(圖7～8)。較之200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理的細(xì)胞，在Pb(NO3)2處理的細(xì)胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷明顯緩解了細(xì)胞損傷和H2O2含量的上升。PI和FDA的雙染實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果和伊文思藍(lán)法檢測(cè)結(jié)果基本一致。

2.5 外源三磷酸腺苷對(duì)Pb(NO3)2脅迫下CAT酶和POD酶活性的影響

由圖9可知，對(duì)未經(jīng)過Pb(NO3)2脅迫處理的懸浮細(xì)胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性略有上升，但沒有達(dá)到顯著性水平；相似的，對(duì)未經(jīng)過Pb(NO3)2脅迫處理的懸浮細(xì)胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷也沒有顯著改變POD酶的活性。

相較于200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理的細(xì)胞，在Pb(NO3)2處理的細(xì)胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性顯著性下降，并使得POD酶活性顯著性升高(圖9～10)，表明外源三磷酸腺苷對(duì)鉛處理下H2O2清除酶活性具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

圖9 不同處理下CAT酶活性的變化Fig.9 The level of CAT activity under different treatments

圖10 不同處理下POD酶活性的變化Fig.10 The level of POD activity under different treatments

3 討論

目前，鉛離子對(duì)植物造成的毒害作用是植物生理與生態(tài)學(xué)研究的重點(diǎn)問題之一[1～4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Pb(NO3)2處理下，細(xì)胞損傷水平隨鉛離子脅迫濃度的增大而上升(圖1)；同時(shí)，細(xì)胞H2O2的含量也呈現(xiàn)出增大的趨勢(shì)(圖2)。已有研究表明，鉛等重金屬脅迫會(huì)引發(fā)植物細(xì)胞活性氧水平的上升，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，以及影響核酸、蛋白質(zhì)等大分子受損，并進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[4]。而在細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧當(dāng)中，H2O2具有最長(zhǎng)的半衰期以及穿膜的功能，因而對(duì)植物產(chǎn)生的氧化壓力具有范圍廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，其過量產(chǎn)生是許多生物性和非生物性脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞損傷的重要原因[22～24]。所以推測(cè)在鉛脅迫下細(xì)胞損傷程度的上升也和H2O2積累密切相關(guān)。

CAT和POD是細(xì)胞內(nèi)主要的H2O2脫毒酶類:CAT能夠在過氧化物酶體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中將H2O2分解為水和氧氣分子[25]；而POD則通過H2O2為電子受體催化酚類等物質(zhì)氧化從而減少了細(xì)胞H2O2的水平[26]。本文通過檢測(cè)上述兩種酶的活性變化發(fā)現(xiàn)，隨Pb(NO3)2處理濃度增加，CAT酶活性呈現(xiàn)出和H2O2含量變化相同的趨勢(shì)；而POD則呈現(xiàn)出不斷減小的趨勢(shì)。這與黃金秋等[27]在外源H2O2處理下水稻懸浮細(xì)胞中CAT和POD活性變化規(guī)律相似。一方面，這表明了在Pb脅迫下，H2O2清除酶的活性發(fā)生了明顯的變化，不同的H2O2清除酶對(duì)于氧化壓力的敏感程度和響應(yīng)規(guī)律有所不同；另一方面，在Pb脅迫下CAT酶活性和H2O2含量變化的相似性提示了CAT較之POD在細(xì)胞調(diào)節(jié)H2O2水平中可能扮演著更為主要的角色。此外，有研究表明，當(dāng)植物體內(nèi)由重金屬及其所誘導(dǎo)的ROS含量達(dá)到一定水平時(shí)可引起抗氧化酶失活，酶合成減少或者酶亞基裝配發(fā)生改變[28～29]。因此，在Pb脅迫下CAT和POD酶活性變化的不同也可能反應(yīng)了兩種酶對(duì)于鉛及其所誘導(dǎo)的氧化壓力的耐受度有所不同。

以前的諸多工作報(bào)道，當(dāng)植物細(xì)胞遭受鉛等重金屬脅迫時(shí)，植物需要產(chǎn)生更多的能量以增加離子的轉(zhuǎn)運(yùn)并產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合重金屬的多肽以緩解重金屬的毒性[30]。本研究也觀察到Pb(NO3)2脅迫導(dǎo)致了胞內(nèi)三磷酸腺苷水平的升高(圖6)。然而有趣的是，盡管細(xì)胞外三磷酸腺苷來自于細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷，但Pb(NO3)2脅迫下胞外三磷酸腺苷水平則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)(圖5)。這表明，細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷的水平至少在Pb脅迫下是被細(xì)胞獨(dú)立調(diào)控的。推測(cè)Pb可能是通過影響通道蛋白或是囊泡運(yùn)輸?shù)确绞浇档土税馊姿嵯佘諒募?xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的輸送所致。

由于在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下細(xì)胞處于最大的氧化壓力，我們繼而選擇了在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理的細(xì)胞中探究了Pb脅迫下胞外三磷酸腺苷水平的變化是否能影響細(xì)胞損傷、H2O2含量及H2O2清除酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在無Pb離子處理下，對(duì)細(xì)胞施加30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷時(shí)，沒有引起細(xì)胞損傷、H2O2含量以及CAT、POD酶活性的顯著性變化。而對(duì)Pb離子處理的細(xì)胞中施加該濃度的外源三磷酸腺苷則明顯緩解了Pb脅迫所引起的細(xì)胞損傷、H2O2含量的積累以及CAT活性的上升；同時(shí)，Pb脅迫所引起的POD酶活性的減弱也因外源三磷酸腺苷的加入而有所恢復(fù)(圖10)。從上述的變化趨勢(shì)和生理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析，在Pb離子脅迫下，細(xì)胞外三磷酸腺苷的增加能夠明顯的降低植物細(xì)胞的氧化壓力以及細(xì)胞損傷，這可能是由于胞外三磷酸腺苷能夠刺激POD酶活性的上升或調(diào)動(dòng)了細(xì)胞中其他減少H2O2產(chǎn)生的生理學(xué)機(jī)制。盡管其具體原因尚需進(jìn)一步查實(shí)，但上述結(jié)果表明，胞外三磷酸腺苷水平的變化在鉛離子脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和氧化壓力中扮演著重要的角色。

Chivasa等[31]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外三磷酸腺苷的增加能夠有效緩解fumonisin(一種真菌毒素)引起的植物細(xì)胞活力的下降。因此，在一些生物性或是非生物性脅迫下胞外三磷酸腺苷對(duì)于植物細(xì)胞損傷或是活力的調(diào)控作用很可能具有一定的廣譜性。期望胞外三磷酸腺苷這種功能將在未來更多學(xué)者的工作中得以證實(shí)。