韓爍 陶曉莎 黃鵬 劉慶偉 姜亮

【摘要】目的：優(yōu)化靈桿菌核酸酶（NU）工程菌pET3c-NU/BL21STAR（DE3）pLysS 30L發(fā)酵罐培養(yǎng)及表達條件。方法：上罐發(fā)酵采用M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo);通過還原SDS-PAGE法測定目標(biāo)蛋白表達量，RP-HPLC法測定乙酸殘留量，以確定表達溫度、時間等參數(shù)。結(jié)果：與討論]NU重組菌誘導(dǎo)溫度為30℃、加入終濃度0.2M IPTG誘導(dǎo)，維持誘導(dǎo)時間4hr，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rNU融合蛋白純化奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】靈桿菌核酸酶;重組表達;發(fā)酵條件優(yōu)化

【中圖分類號】R543

【文獻標(biāo)識碼】B

【文章編號】2095-6851（2020）02-045-01

中國分類號 Q786?文獻標(biāo)識碼 A

在人用預(yù)防及治療類生物制品的質(zhì)量標(biāo)準中，核酸殘留量是重要指標(biāo)，直接關(guān)系到產(chǎn)品的安全性。在疫苗工業(yè)及蛋白質(zhì)和多糖類工業(yè)中，應(yīng)用靈桿菌核酸酶可將產(chǎn)品中的核酸污染降低至皮克級，目前，該方法已成為通用做法。我國是疫苗使用和生產(chǎn)大國，故靈桿菌核酸酶在生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)特別是疫苗生產(chǎn)中具有非常廣闊的應(yīng)用市場[1]。

靈桿菌核酸酶是來源于粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens，又稱靈桿菌）的非限制性廣譜核酸酶，可在核酸鏈內(nèi)的任意核苷酸間進行切割，并可切割任意形式的核酸。其酶切效率遠高于其它核酸酶，活性是牛胰DNase I的34倍，是金黃葡萄球菌核酸酶的6倍[2]。

然而，靈桿菌是一種致病菌，對其大規(guī)模培養(yǎng)存在較大風(fēng)險。目前市場上的主導(dǎo)產(chǎn)品為Merk公司生產(chǎn)的商品名為Benzonase的靈桿菌核酸酶，該產(chǎn)品已通過美國FDA的使用許可，廣泛用于除去生物制品中的核酸，但產(chǎn)量低價格昂貴。國內(nèi)生產(chǎn)廠家較少，探索靈桿菌核酸酶的規(guī)模化生產(chǎn)工藝以滿足醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)要求[3]。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株?pET3c-NU/BL21STAR（DE3）pLysS工程菌由臨沂大學(xué)藥學(xué)院構(gòu)建。

1.1.2?培養(yǎng)基?（1）LB液體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，pH 7.0;（2）LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中補加1.0%瓊脂;（3）含氨芐青霉素的LB（LA）液體（或固體）培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基加入氨芐青霉素（100 μg/mL）;（4） M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%胰蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.06%NaCl， 0.5%KH2PO4，3%Na2HPO412H2O，1%葡萄糖，0.1%MgSO4，0.1%NH4Cl;（5）補料培養(yǎng)基：30%葡萄糖，5%胰蛋白胨，3%酵母提取物。

1.1.3?主要試劑?胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司，中分子量蛋白質(zhì)Marker購自天根生化科技有限公司，IPTG購自索萊寶，無機鹽、葡萄糖等購自上海生工。

1.1.4?主要儀器設(shè)備?HSX-150恒溫恒濕箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠; HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司;ChampGel 5000數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;TU-1810紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LC-10AT高效液相色譜儀，日本島津儀器有限公司。

1.2?方法

1.2.1?菌密度測定?用紫外可見光光度法測定發(fā)酵液600nm波長時光吸收值，以未接種培養(yǎng)基作參比。

1.2.2?目標(biāo)蛋白表達水平的測定?采用還原SDS-PAGE電泳考馬斯亮蘭染色法，電泳凝膠經(jīng)掃描后分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。

1.2.3?質(zhì)粒丟失率的檢測方法?將待測發(fā)酵液測OD600值，以無菌水稀釋，使培養(yǎng)液均達到OD600為0.2。然后取200μl涂LB平板，37℃培養(yǎng)48hr。從培養(yǎng)好的LB平板上挑一單菌落同時轉(zhuǎn)接到LB和LA（含100μg/ml氨芐青霉素）平板上，37℃培養(yǎng)48hr。計算菌落數(shù)，LB平板上的菌落數(shù)為M，LA平板上的菌落數(shù)為N，則丟失率計算方法為（M-N）/M×100%。

1.2.4?乙酸含量測定?（1）乙酸含量測定方法：將待測發(fā)酵液離心，收集上清，取500μl上清溶液加入200μl 50%的硫酸溶液，混勻后再加入500μl乙醚溶液，搖勻，離心。取上層溶液10μl通過C18（4.6×250mm）柱，用高效液相色譜法測定其含量，流動相為98% 50mM KH2PO4，2%甲醇，pH2.5;檢測波長210nm;流速1ml/min;時間15min。通過計算乙酸特異吸收峰的峰面積計算待測樣品的乙酸含量。（2）標(biāo)準曲線的繪制：以冰醋酸溶液為標(biāo)準，配制0.1mg/ml，0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml，2.0mg/ml，2.5mg/ml六個濃度。分別取500μl上述溶液加入200μl 50%的硫酸溶液，混勻后再加入500μl乙醚溶液，搖勻，離心。取上層溶液10μl 進行含量測定，并制作標(biāo)準曲線。

1.2.5?工程菌的培養(yǎng)方法（30升發(fā)酵罐規(guī)格）

（1）種子菌的活化：取-80℃，12.5%甘油保存的生產(chǎn)種子庫菌種，劃線接種于含氨芐（100μg/ml）的LB斜面，37℃培養(yǎng)過夜，挑菌苔于含氨芐（100μg/ml）LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)至OD600 為0.4-0.5時，作為活化種子4℃保存。（2）種子液培養(yǎng)：取活化種子，以1：100接種于400ml LB培養(yǎng)基中，30℃，150rpm ，培養(yǎng)15hr，作為一級種子液。再以1：10接種于2L LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，250rpm ，培養(yǎng)2hr，作為上罐種子液。（3）發(fā)酵工藝：發(fā)酵上罐培養(yǎng)基18L，培養(yǎng)基配方為 M9-YT-Glu。取種子液2000ml，加入發(fā)酵罐中，使終體積為20L。調(diào)整工藝參數(shù)：設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)速300rpm，pH用50%氨水自動調(diào)至7.0。當(dāng)發(fā)酵至3-4hr，開始流加營養(yǎng)液。待菌體OD600達到8-12，溶氧值開始上升時，降溫至30℃，以不同IPTG終濃度（0.1M、0.2M、0.3M ）進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間2-6小時，每1小時取1次樣品。樣品離心、作SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?誘導(dǎo)溫度對蛋白表達的影響

溫度在發(fā)酵過程中的影響一方面表現(xiàn)在工程菌產(chǎn)物合成的數(shù)量，另一方面表現(xiàn)在工程菌自身數(shù)量的增長。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，是使比生長率達到最大值的溫度。將種子液以1：10接入發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)至菌體OD600達到10-12，加入終濃度為0.2M IPTG誘導(dǎo)，同時控制溫度至25℃、30℃、37℃，誘導(dǎo)時間4hr，收集菌體進行SDS-PAGE分析。

如圖1所示，三個溫度均可見明顯目標(biāo)蛋白表達條帶，其中30℃和25℃對菌體數(shù)量增值及表達量明顯優(yōu)于37℃時表達量;30℃時菌體生長迅速，培養(yǎng)周期短，效率高，綜上，選擇誘導(dǎo)溫度為30℃。

2.2?不同誘導(dǎo)時間對蛋白表達的影響

按上述篩選的發(fā)酵工藝進行發(fā)酵一次，在不同發(fā)酵時間分別取樣測定乙酸含量變化、質(zhì)粒丟失率以及目的蛋白表達量的關(guān)系。

2.2.1?乙酸含量測定方法學(xué)研究

如下圖2所示：乙酸還原到發(fā)酵液上清后，其保留時間（5.090）與標(biāo)準品溶液（5.090）完全一致，主峰前后未有明顯雜質(zhì)峰出現(xiàn)，峰面積回收率98.2%，該方法可用于發(fā)酵液上清乙酸殘留量測定

如表1所示，乙酸含量在0.1-2.5mg/ml之間時，含量值與210nm響應(yīng)值之間線性范圍良好（R2=0.9996），在此范圍可準確測定發(fā)酵液上清乙酸殘留量。

2.2.2?不同誘導(dǎo)時間乙酸殘留量及質(zhì)粒丟失率測定

分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后1hr-6hr取發(fā)酵液測定發(fā)酵液上清中乙酸的含量，并通過平板培養(yǎng)法計算不同誘導(dǎo)時間的質(zhì)粒的丟失率。結(jié)果如下圖3所示，隨誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)酵液中乙酸含量呈增加趨勢。在加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2小時后，開始漸有質(zhì)粒丟失，當(dāng)誘導(dǎo)時間維持至5小時后，質(zhì)粒丟失率顯著增加。乙酸含量增加嚴重影響質(zhì)粒穩(wěn)定性。

3?結(jié)論與討論

rNU工程菌的發(fā)酵，選擇M9-YT-Glu鹽培養(yǎng)基作為生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，降低溫度為30℃并加入終濃度0.2M IPTG誘導(dǎo)，維持誘導(dǎo)時間4hr，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rNU融合蛋白純化奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]?Yang Zhu，et al.The Smart Solution for DNA Removal in Biopharmaceutical Production by Benzonase Endonuclease[J].Applied Virology， 2013， 2（1）：25-33.

[2]?Andrea Balan， et al. A conditional suicide system for Saccharomyces cerevisiae relying on the intracellular production of the Serratia marcescens nuclease [J]. Yeast，2005，22：203-212.

[3]?Shuli Liang， et al. Endogenous signal peptides efficiently mediate the secretion of recombinant proteins in Pichia pastoris [J]. Biotechnol Lett， 2013， 35：97–105.