劉濤 劉偉欣 賀明 楊玉姣 吳珍 胡旭光

1廣東藥科大學(xué)（廣州510006）；2 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司（廣州510515）；3 廣東藥科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州新海醫(yī)院）（廣州510300）

在膿毒癥發(fā)病過程中，有將近50%的患者會(huì)出現(xiàn)急性肺損傷的癥狀，該并發(fā)癥是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要原因之一[1-2]。臨床上，對(duì)于膿毒癥伴隨急性肺損傷的治療手段有限，因此，發(fā)展新型的治療方法及治療藥物對(duì)該病的治療極為重要。

高遷移率組蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種極為保守的，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一種類組蛋白[3]。研究[4-8]發(fā)現(xiàn)，在炎癥情況下，被免疫細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的HMGB1是一種晚期致死性炎癥因子，會(huì)反向促進(jìn)更多的炎癥因子分泌，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。HMGB1 特異性的抗體和HMGB1 受體抑制劑的使用相繼被證明可以有效緩解急性炎癥反應(yīng)[9]。在相應(yīng)的藥物治療開發(fā)方面，中醫(yī)藥的是一個(gè)巨大的寶庫，中藥抗炎治療將會(huì)是臨床上一項(xiàng)重要的方法。本研究即對(duì)中藥丹參的提取物丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉的抗炎效果進(jìn)行了研究。

丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉有諸多的功能，如降低心肌梗死范圍，減少氧自由基，提高心肌耐缺氧能力等[10-13]。然而，多數(shù)的研究都集中于丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)于心臟疾病，血液疾病的效果上，對(duì)于炎癥反應(yīng)的治療卻少有提及，僅有部分研究表明它對(duì)于急性肺纖維化有較好的療效。因此，本研究從膿毒癥所致急性肺損傷著手，觀察丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)于急性炎癥的療效，為臨床治療急性炎癥提供一種新的備選藥物。

1 材料與方法

1.1 材料脂多糖（LPS）（貨號(hào)：L2880），地塞米松（貨號(hào)：D4902）從美國Sigma公司購得，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H31022558），從廣東省中醫(yī)院購得。

1.2 動(dòng)物SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（粵）2017-0021。所有動(dòng)物都飼養(yǎng)在溫度22℃和濕度55%的環(huán)境中，飲水與食物充足供應(yīng)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 病死率觀察將大鼠隨機(jī)分為正常組（Control 組），模型組（LPS 組），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉低劑量組（LD 組），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉高劑量組（HD組）及陽性對(duì)照組（地塞米松，Positive Control）各10只。Control 組腹腔注射生理鹽水，其余各組均腹腔注射LPS（15 mg/kg），之后，LD 組和HD 組分別給予丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉腹腔注射8 mg/kg和16 mg/kg，陽性對(duì)照組給予地塞米松（1 mg/kg）腹腔注射，分別在6、12、24、48和72 h 這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠的死亡數(shù)量，以此來推測(cè)丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉的療效。

1.3.2 血清及肺組織提取50只SD 雄性大鼠，分組及治療同上。藥物注射24 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 mL，離心后取上清，-80℃凍存（Elisa 備用）。取大鼠右側(cè)肺組織，切塊后一半甲醛固定（病理切片備用），另一半-80℃凍存（Western Blot及qPCR 備用）

1.4 病理切片制備經(jīng)甲醛固定的肺組織經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后切成3 μm的薄片，利用二甲苯及不同濃度的酒精和水進(jìn)行脫蠟，采用蘇木精和伊紅進(jìn)行染色，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，封片后采用顯微鏡進(jìn)行拍照，通過對(duì)圖片進(jìn)行評(píng)分觀察其病理狀態(tài)的改變[14]。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Elisa）血清中HMGB1、血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的濃度均采用Elisa 試劑盒（英杰公司，美國）進(jìn)行測(cè)定。將100 μL的血清加入包被有上述蛋白抗體的微孔中，室溫孵育1 h后清洗3 遍，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗體并孵育1 h，清洗后加入TMP 基質(zhì)，室溫孵育1 h后加入終止液，采用450 nm 波長(zhǎng)的光測(cè)定其吸光值。

1.6 蛋白免疫印記分析（Western Blot）肺組織研磨后加入RIPA 裂解液（賽默飛，貨號(hào)：89900）和蛋白酶抑制劑（賽默飛，貨號(hào)：78425B）的混合液（100∶1）。12 500轉(zhuǎn)離心15 min后，取上清即得肺組織的總蛋白。采用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行跑膠分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，7%牛奶封閉后，采用anti-HMGB1（1∶1 000，貨號(hào)ab79823，Abcam），Anti-TNF-α（1∶1 000，貨號(hào)：ab1793，Abcam），anti-β-actin（1∶1 000，貨號(hào)：ab8226，Abcam），Anti-IL-1β（1∶1 000，貨號(hào)：YT5201，ImmunoWay）進(jìn)行孵育，4℃過夜?；厥找豢购?，用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的抗IgG 抗體進(jìn)行孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）取肺組織，研磨后利用trizol 提取方法提取RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明對(duì)各組的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件如表1所示。然后進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)，引物如表2所示，PCR 反應(yīng)條件如表3所示。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Tab.1 Reverse transcription reaction system

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

表3 Real Time PCR 反應(yīng)體系Tab.3 Real time PCR reaction system

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，圖片采用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行制作。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，組間比較采用方差分析進(jìn)行比較，存活率采用Kaplan-Meier 方法進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉提高LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的存活率動(dòng)物的生存情況是判斷藥物是否有效的重要標(biāo)準(zhǔn)，如圖1所示，使用LPS 刺激后的大鼠在72 h內(nèi)有80%的病死率（P＜0.001），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉治療后，有效提升了大鼠的存活率，其中LD 組與陽性對(duì)照組更加接近。

圖1 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉提高LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的存活率Fig.1 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the survival rate of lps-induced acute lung injury in rats

2.2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的病理損傷經(jīng)LPS 刺激后，大鼠肺組織出現(xiàn)了典型的炎癥病理反應(yīng)，如肺泡間隔增厚，出血，水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉組及陽性對(duì)照組的相關(guān)癥狀均被有效緩解（圖2A）。經(jīng)LPS 刺激后，LPS 組肺組織的病理學(xué)評(píng)分也顯著高于Control 組，而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉組及陽性對(duì)照組也顯著低于LPS 組（圖2B，表4），說明丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)急性肺損傷的有效性。

2.3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低膿毒癥大鼠血清炎性因子的分泌水平LPS 刺激導(dǎo)致大鼠血清中炎性因子HMGB1，TNF-α和IL-1β的水平顯著增高（P＜0.05），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可有效降低血清中炎性因子的分泌水平，與陽性對(duì)照藥物地塞米松效果相似（圖3，表5）。

2.4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低肺組織中HMGB1和NF-κB的水平LPS 刺激誘導(dǎo)肺組織中HMGB1及NF-κB P65的蛋白表達(dá)水平及mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（圖4D、4E，P＜0.05），丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉有效抑制了HMGB1和NF-κB P65的轉(zhuǎn)錄，并且降低了組織中的蛋白表達(dá)水平（圖4A～C，P＜0.05）。

3 討論

急性肺損傷是一種常見的膿毒癥并發(fā)癥，該損傷主要是由于急性的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的。在臨床上，雖然已經(jīng)有一些治療方案用于針對(duì)急性肺損傷，然而該病的預(yù)后仍不容樂觀。鑒于此，研究者針對(duì)該病也制作出了不同的動(dòng)物模型，用于深一步的研究[15-16]。本次研究使用了最常用的LPS誘導(dǎo)來建立膿毒癥伴隨急性肺損傷的模型，用于探究丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)于急性肺損傷的療效。因地塞米松可抑制炎癥細(xì)胞的集聚，并抑制炎癥化學(xué)中介物的合成和釋放，故本研究使用地塞米松作為陽性對(duì)照藥物。研究結(jié)果顯示，丹皮酚可以有效提高膿毒癥伴隨急性肺損傷大鼠的存活率，同時(shí)，降低因LPS 刺激所導(dǎo)致的肺組織充血，水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及炎性因子的分泌。這些結(jié)果都表明丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可作為臨床治療急性肺損傷的另一種備選方案。

圖2 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的病理損傷Fig.2 Tanshinone IIA sodium sulfonate improves the pathological damage of LPS induced acute lung injury

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的病理損傷評(píng)分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

表4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷的病理損傷評(píng)分表Fig.4 Therapeutic effect of tanshinone Ⅱ-a sulfonate on LPS induced acute lung injury±s

組別例數(shù)評(píng)分Control 組10 1.3±0.13 LPS 組5 5.5±0.15 LD 組7 2.5±0.11 HD 組8 0.4±0.09陽性對(duì)照組8 2.2±0.11

圖3 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Fig.3 Tanshinone IIA sodium sulfonate reduces the level of inflammatory factors in serum of virulent rats

表5 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

表5 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低毒癥大鼠血清中炎性因子的分泌水平Tab.5 Tanshinone Ⅱ-a sulfonate reduces the secretion of inflammatory factors in serum of toxic rats ±s

組別例數(shù)HMGB1 IL-1β TNF-α Control 組10 237±6.89 367±16.05 154±6.87 LPS 組5 1 561±117.8 1 925±92.47 834±67.64 LD 組7 398±55.19 705±64.99 315±13.21 HD 組8 498±52.55 592±51.68 350±19.61陽性對(duì)照組8 435±52.31 561±33.46 239±14.62

圖4 丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉降低肺組織中HMGB1和NF-κB的水平Fig.4 Tanshinone IIA sodium sulfonate decrease the level of HMGB1 and NF-kappa B in lung tissue

HMGB1在正常情況下多集中于細(xì)胞核內(nèi)，一旦受到LPS的刺激，即會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)出核并分泌至細(xì)胞外，細(xì)胞外的HMGB1 則會(huì)成為一個(gè)致死性的炎癥因子。因此，血清中HMGB1的含量對(duì)于炎癥嚴(yán)重程度是一個(gè)重要的影響[17-19]。HMGB1的提高會(huì)導(dǎo)致其受體RAGE 也隨之升高，進(jìn)而激活其下游包括NF-κB在內(nèi)的炎癥相關(guān)通路[20]。因此，對(duì)于急性肺損傷的患者，抑制HMGB1的過度表達(dá)及分泌或者其下游的炎癥通路至關(guān)重要。目前，應(yīng)用HMGB1的抗體及抑制劑可降低血清中HMGB1的含量，并提高膿毒癥休克小鼠的生存率。本次研究結(jié)果表明，LPS 刺激后可顯著提升大鼠肺組織中HMGB1的分泌量，而丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可降低炎性肺損傷大鼠肺部HMGB1的分泌，這可能是其發(fā)揮抗炎功效的關(guān)鍵點(diǎn)。

NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是膿毒癥反應(yīng)中重要的一部分。抑制狀態(tài)下的NF-κB 主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并和其抑制物IκBα 相結(jié)合。在炎癥反應(yīng)中，IκBα 會(huì)被降解，NF-κB 則會(huì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)多種炎癥因子（如細(xì)胞因子，趨化因子，黏附因子）的轉(zhuǎn)錄[21-22]。本次研究也表明了丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉可抑制NF-κB的表達(dá)，并抑制在LPS 刺激下其下游的TNF-α和IL-1β的表達(dá)。

本次研究表明，丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉通過抑制HMGB1的表達(dá)和分泌，降低NF-κB的激活并抑制炎性因子的分泌來提高LPS 刺激的膿毒癥伴急性肺損傷大鼠的存活率。低劑量和高劑量的丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)炎癥反應(yīng)的緩解能力并無差異，最佳用藥劑量仍需進(jìn)一步探討。另外，本次研究雖證明了丹參酮Ⅱ-A磺酸鈉對(duì)大鼠急性肺損傷是通過抑制HMGB1和NF-κB 來實(shí)現(xiàn)的，但仍缺乏有力的反向驗(yàn)證，同時(shí)，HMGB1和NF-κB在細(xì)胞內(nèi)的定位很大程度上決定了其功能，而其定位則主要受到其本身的乙酰化和磷酸化修飾的影響，這兩者都是本項(xiàng)目下一步研究的重點(diǎn)方向。