納米顆粒聯(lián)合聲動力療法的研究進展

李金林 劉小慧 周暢 劉朝奇 趙云

1三峽大學醫(yī)學院（湖北宜昌443002）；2 三峽大學第一臨床醫(yī)學院超聲科（湖北宜昌443002）

聲動力療法（sonodynamic therapy，SDT）是在光動力療法（photodynamic therapy，PDT）基礎上發(fā)展而來，由YUMITA 等[1]于1989年提出，單獨超聲波對腫瘤組織具有一定的殺傷力，口服或者靜脈注射聲敏劑后，聯(lián)合使用一定頻率的超聲輻照，殺傷效力明顯增強，能夠誘導顯著地細胞損傷。聲敏劑是SDT的關鍵環(huán)節(jié)，分為卟啉類及其衍生物、氧雜蒽類、化療藥物類、吩噻嗪類化合物等[2]，由于大部分卟啉類聲敏劑的水溶性差，且容易被機體代謝，只有小部分到達腫瘤組織，無法產(chǎn)生有效的治療活性，這極大地制約了SDT的應用。納米顆粒（nanoparticles，NPs）是利用納米技術制備的納米級微?；蛭⒛?，具有靶向性好、載藥量高及體內(nèi)留存時間長等優(yōu)點，是聲敏劑的良好載體[3]。且納米顆粒能改善聲敏劑的疏水性，優(yōu)化SDT的靶向治療、藥物轉(zhuǎn)運、多模態(tài)成像及早期診斷，將納米顆粒用于聲動力療法能發(fā)揮協(xié)同作用顯著增強其抗腫瘤效應，并有望用于臨床。

1 納米顆粒增強聲動力抗腫瘤效應的可能機制

1.1 活性氧機制SDT 治療腫瘤的機制研究中，最廣泛的學說是活性氧（ROS）機制，ROS 產(chǎn)生后可通過氧化細胞內(nèi)特異性化學簇，導致激活炎癥因子或者DNA 突變，最終導致細胞凋亡[4]。納米顆粒可以促進ROS的生成來增強SDT 治療效果。ZHANG 等[5]通過熱解和相轉(zhuǎn)移制備聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的負載二氫卟吩（Chlorin e6，Ce6）的順磁性氧化鐵納米顆粒（paramagnetic iron oxide nanoparticles@Ce6，PION@Ce6），ROS 敏感性熒光指示劑DCFH-DA 用于測定細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，在小鼠肝癌模型中觀察SDT的治療效果，結(jié)果表明PION@Ce6在水溶液中很好地分散和溶解，而且長時間沒有明顯的沉淀，與游離Ce6+超聲（ultrasound，US）組相比PION@Ce6+US 組表現(xiàn)出更高水平的ROS 產(chǎn)生且腫瘤細胞凋亡率最高。因此，納米顆粒用于SDT 使聲敏劑具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，通過增加ROS的產(chǎn)生增效SDT的抗腫瘤效應。

1.2 降低空化閾值SDT的作用機制中，超聲的空化效應也是研究的熱點[6]。在超聲波作用下液體振動而產(chǎn)生數(shù)以萬計的微小氣泡，即微氣泡空化核，這些微氣泡在超聲波傳播形成的正負壓強下壓縮和拉伸，在氣泡被壓縮直至崩潰的瞬間，產(chǎn)生巨大的瞬時壓力和高溫，釋放出大量的能量殺傷腫瘤細胞，即超聲空化效應[7]。超聲波的高空化閾值，導致治療持續(xù)時間長和超聲強度高，是SDT 亟待解決的問題[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，二氧化鈦納米顆粒（titanium dioxide nanoparticles，TiO2NPs）可以被作為空化促進劑，豐富空化成核位點降低空化閾值來增強超聲空化效應。MIYOSHI 等[10]制備了TiO2NPs，分為US 組和US＋TiO2NPs 組，使用光譜分析儀檢測空化信號，證實US＋TiO2NPs 組空化信號較US 組增加了28%，加速了靶組織的壞死，縮短了治療時間，避免損傷周圍正常組織，因此納米顆粒用于SDT 使空化效應顯著增強，治療更具安全性和有效性。

1.3 抑制腫瘤血管生成新生血管的形成是腫瘤生長和侵襲的重要因素，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可在體內(nèi)誘導血管新生，有效的促進血管及淋巴管的再生。SDT能夠通過多種機制破壞血管屏障，增加藥物轉(zhuǎn)運并明顯減少腫瘤組織血液供應，并抑制血管內(nèi)皮生長因子表達，從而抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，進而抑制血管管腔的形成[11]。聯(lián)合納米顆?？梢栽鲂б种谱饔?。CHEN 等[12]構(gòu)建了載有紫杉醇PTX/吲哚青綠ICG的PLGA NPs，在卵巢癌細胞SKOV3 模型中觀察SDT 療效，通過積分光密度（IOD）定量分析VEGF的表達，結(jié)果顯示，納米顆粒組VEGF的IOD為各組中最低的，VEGF表達明顯受到抑制。VEGF的低表達表明納米顆粒聯(lián)合SDT 處理可有效抑制腫瘤血管生成，阻止腫瘤的繼續(xù)生長介導癌細胞凋亡。

1.4 協(xié)同效應利用磁性材料制備的超順磁納米顆粒在納米醫(yī)學中得到了廣泛關注[13]。磁性納米顆?？梢詫ν饧哟艌鲎龀鲰憫a(chǎn)生熱量，提高靶區(qū)溫度而產(chǎn)生熱效應[14]。ZHOU 等[15]設計了超順磁氧化鐵納米顆粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs），用全氟羥基己烷（PFH）填充后，體內(nèi)實驗顯示，暴露于外部磁場后，腫瘤生長部位的溫度快速上升，產(chǎn)生熱效應加速了靶組織的凋亡和壞死，表現(xiàn)出高效的磁熱療作用。說明納米顆粒促進SDT 與熱療協(xié)同，對治療腫瘤提供了新的方法與思路。

2 不同納米顆粒在SDT 中的應用展望

2.1 脂質(zhì)體納米顆粒在SDT 中的應用脂質(zhì)體通常被用作主要的納米顆粒制備材料[16]。研究[17]表明，脂質(zhì)體納米顆粒具有優(yōu)異的生物相容性、可降解性和穩(wěn)定性，而被廣泛使用。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層形成的球形囊泡，由于其獨特的結(jié)構(gòu)，利用脂質(zhì)雙層將疏水性藥物捕獲在內(nèi)層，保護藥物免于降解。脂質(zhì)體的高穩(wěn)定性及在脂膜保護下藥物可以被高效運輸?shù)浇M織或靶器官。YUE 等[18]使用脂質(zhì)體作為納米載體，通過逆相蒸發(fā)法共同包封兩種疏水性分子，血卟啉單甲醚（HMME，良好的光/聲敏劑）和免疫激動劑咪喹莫特（R837），獲得的HMME-R837@Lip NPs 復合納米顆粒在水溶液中均勻分散，為粒徑均一的球體，動態(tài)光散射（DLS）測得納米顆粒動力學直徑為約157.3 nm，納米級尺寸有利于通過滲透增強效應（EPR）進入到腫瘤中，體外研究發(fā)現(xiàn)將100 μg/mL HMME-R837@Lip NPs 與小鼠乳腺癌細胞株（4T1）37℃共同孵育4 h，使用超聲輻照1 min（頻率1.0 MHz，強度1.5 W/cm2），細胞損傷率高達90%，但相同條件下單獨超聲輻照或HMME-R837@Lip NPs 給藥并未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞損傷，說明HMME-R837 NPs 聯(lián)合SDT 具有協(xié)同治療效果。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）下發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HMME-R837@Lip NPs在4 h內(nèi)被4T1細胞迅速內(nèi)化，且沒有明顯的外排（＜3%），這種有效的細胞內(nèi)攝取和低排出顯示出納米顆粒在癌細胞內(nèi)的高聚集性，為增效SDT的治療效果提供了前提。隨后，YUE 等[18]進一步研究了HMME-R837@Lip NPs和SDT 聯(lián)合治療后對免疫系統(tǒng)的改變，二者聯(lián)合可以增強腫瘤免疫治療，激活機體抗腫瘤免疫應答，從而殺傷腫瘤細胞。在腫瘤微環(huán)境中，免疫細胞對腫瘤的起始、發(fā)展和生長起關鍵作用，樹突狀細胞（DC）是已知體內(nèi)功能最強、唯一能活化靜息T細胞的專職抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。通過檢測共刺激分子CD80/CD86（樹突狀細胞成熟的代表性標志物）的上調(diào)來評價HMMER837@Lip NPs的免疫效應。該團隊給小鼠右胸皮下接種4T1細胞6 d后，采用尾靜脈給藥方式注射HMME-R837@Lip NPs，12 h后超聲輻照5 min（頻率1.0 MHz，強度1.5 W/cm2），治療3 d后發(fā)現(xiàn)單獨HMME-R837@Lip NPs 或超聲只有微量的DC細胞成熟，而在HMME-R837@Lip NPs 聯(lián)合超聲組DC成熟度達到28%，提示HMME-R837@Lip NPs 聯(lián)合SDT 能顯著促進DC 成熟，通過激活自身免疫反應，增強對腫瘤組織的殺傷力。

2.2 二氧化硅納米顆粒在SDT 中的應用隨著納米技術的發(fā)展和對納米材料的不斷研究，發(fā)現(xiàn)有些納米材料具有獨特的光/聲特性，如Silicon NPs、TiO2NPs[19]、Fe3O4NPs[20]等，能在超聲波輻照下釋放大量活性氧類物質(zhì)，產(chǎn)生聲動力治療，開創(chuàng)了無聲敏劑型聲動力療法。WANG 等[21]利用介孔二氧化硅納米顆粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN）包裹化療藥物紫杉醇（PTX），將葉酸（FA）及β-環(huán)糊精（β-CD）封裝在納米顆粒的表面，制得PTX@FA-β-CD/H-MSN 雙效納米顆粒（double effect silica nanoparticles，DESN），使用非熒光的對苯二甲酸檢測羥自由基（OH-）的產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)暴露于超聲2 min 時，含有DESN的PBS 溶液的熒光強度比不含有二氧化硅納米顆粒的PBS 溶液的熒光強度高約4倍，提示DESN 經(jīng)超聲輻照后產(chǎn)生大量活性氧羥自由基（OH-），從而發(fā)揮聲動力治療，在體外研究中將小鼠乳腺癌細胞（4T1）與DESN 共同孵育，發(fā)現(xiàn)在不同DESN 濃度（0、5、10、20、40 μg/mL）下沒有明顯的癌細胞損傷，同樣的在單獨的不同超聲強度輻照處理下（0、0.4、0.6、0.8、1.0 W/cm2）細胞存活率也沒有差異。但是當DESN（40 μg/mL）聯(lián)合超聲（0.8 W/cm2）處理時4T1細胞存活率降低至16%。說明在沒有聲敏劑的條件下，具有光/聲特性的納米顆粒聯(lián)合SDT可以產(chǎn)生明顯的細胞損傷，這無疑推動了聲動力治療的發(fā)展且對今后的聲動力治療模式提供了新的方向。

2.3 聚合物納米顆粒在SDT 中的應用聚合物納米顆粒（polymer nanoparticles，PNP）由于其超小尺寸，多功能性和靶向性，已經(jīng)越來越多地用于各種生物醫(yī)學應用。WANG 等[22]以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly（lactic-co-glycolic），PLGA]為材料，制備攜載青蒿素（ART）和5-氨基乙酰丙酸（ALA）的多功能納米顆粒HA-PLGA@ART/ALA NPs，將其與肝癌細胞（HepG2）共同孵育4 h，然后進行超聲（強度2 W/cm2）處理60 s后，發(fā)現(xiàn)單獨HA-PLGA@ART/ALA NPS 組和HA-PLGA@ART/ALA NPS+US 組的凋亡率分別為（23.1 ± 0.8）%、（39.5 ± 0.7）%，聯(lián)合治療可以顯著增強療效。聚合物納米顆粒的主要缺點是藥物突釋，在體內(nèi)藥物突然大量釋放易引起副反應[23]。為提供安全的傳遞系統(tǒng)，殼聚糖（CS）修飾的納米顆粒成為研究熱點。CS（一種天然陽離子多糖）具有高相容性，低免疫原性和低毒性，其多價正電荷使CS 有粘附性，能實現(xiàn)基因、藥物的靶向遞送[24]。LU 等[25]制備了經(jīng)CS 修飾的PLGA NPs（CS-PLGA NPs），觀察紫杉醇PTX的釋放，結(jié)果顯示：PLGA NPs的藥物包封率（EE）值為65.8%，經(jīng)修飾后的CS-PLGA NPs的EE值提高至87.1%，2 h后PLGA NPs的PTX 釋放率為66.9%，呈爆發(fā)性釋放，而CS-PLGA NPs的PTX 釋放率僅為41.9%，且隨著CS 含量增加，藥物初始釋放速度更加緩慢溫和。CS對于提高給藥安全性、降低不良反應、增加藥物包封率都有積極作用。

除了脂質(zhì)體和聚合物納米顆粒之外，金屬納米顆粒、磁性納米顆粒也是攜帶聲敏劑的有效載體。CHOI 等[26]利用具有磁性的四氧化三鐵（Fe3O4）制備磁性納米顆粒，在電鏡下看到顆粒呈圓形、大小均一、分布均勻，與葉酸FA和二氫卟吩Ce6 共價連接后，表現(xiàn)出強磁化性、靶向性和優(yōu)異的相容性。隨著顆粒尺寸變小，表面積與體積比變大，包封的藥物更接近顆粒表面，從而促進更快的藥物釋放。

3 納米顆粒增效聲動力的靶向治療

3.1 納米顆粒在SDT 主動靶向治療中的應用近年來，運用靶向納米顆粒實現(xiàn)主動靶向治療受到越來越多地關注，使用癌細胞中特定受體的配體（如抗體、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）功能化納米顆粒使其具有靶向性，減少化療毒性并增加腫瘤細胞中的藥物積累[27]。經(jīng)修飾后的納米顆粒對癌細胞表現(xiàn)出更好的靶向性、低毒性、更高的腫瘤生長抑制效力[28]。靶向納米顆粒的優(yōu)勢有：（1）改善藥物的藥代動力學和藥效學性質(zhì)而不改變其分子結(jié)構(gòu)；（2）增強組織靶向（細胞靶向和分子靶向）；（3）逃逸固有生物屏障避免吞噬與降解，達到腫瘤細胞且不損失其有效藥物負載；（4）遞送具有不同化學性質(zhì)的多種藥物協(xié)同治療[29]。iRGD是一種腫瘤歸巢肽，腫瘤識別和高效穿透腫瘤所必需的，特異性結(jié)合表達αvβ3和（或）αvβ5蛋白的腫瘤血管和腫瘤細胞。SUN 等[30]制備了經(jīng)IRGD 修飾且攜載聲卟啉鈉（DVDMS，一種良好聲敏劑）的納米顆粒（iRGD-Lipo-DVDMS NPs），建立小鼠C6 膠質(zhì)瘤模型，隨機分兩組分別注射游離DVDMS和iRGDLipo-DVDMS NPs后取腫瘤組織進行熒光檢測，顯示iRGD-Lipo-DVDMS 組腫瘤的熒光強度是游離DVDMS 組的22.12倍且熒光分布更加均勻，可見iRGD-Lipo-DVDMS NPs 具有積極的腫瘤靶向性能特異地富集在腫瘤區(qū)域。在體內(nèi)實驗中，由于測量顱內(nèi)膠質(zhì)瘤體積大小存在困難，所以采用中位生存時間和體質(zhì)量變化來評價療效，注射藥物后5 d內(nèi)SDT 治療兩次，結(jié)果顯示小鼠的中位生存時間為iRGD-Lipo-DVDMS NPs（40 d）明顯長于生理鹽水組（15 d）、游離DVDMS組（19 d），記錄小鼠體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)對照組和DVDMS-SDT 組的體質(zhì)量顯著下降，iRGD-Lipo-DVDMS NPs-SDT 組輕微下降。存活時間直接反映了iRGD-Lipo-DVDMS NPs 聯(lián)合SDT在膠質(zhì)瘤中的高效治療作用，能有效延長生存時間，改善小鼠的生存狀態(tài)。表明靶向納米顆顆粒聯(lián)合SDT可以顯著增強藥物腫瘤靶向性，優(yōu)化治療效率同時降低副反應，對提高治療安全性具有重要作用。

3.2 納米顆粒在SDT 被動靶向治療中的應用被動靶向首先取決于粒徑的大小，被巨噬細胞攝取后自然積集于肝、脾等組織中，從而發(fā)揮療效。納米顆粒分子粒徑小，通過增強滲透和滯留（EPR）效應在腫瘤中自發(fā)積累[31]，在被動靶向治療方面也具有很大潛能。SHEN 等[32]設計了二氧化鈦封裝Fe3O4的納米顆粒同時包覆化療藥物阿霉素（Fe3O4@TiO2-DOX NPs），將小鼠分為兩組分別注射DOX和Fe3O4@TiO2-DOX NPs后2、6、12、24和48 h后進行體內(nèi)成像，發(fā)現(xiàn)Fe3O4@TiO2-DOX NPs組熒光強度比游離DOX 高2.3倍，隨著時間推移越來越多的納米顆粒沉積在腫瘤部位，且無論是否有外部磁場存在，都在腫瘤部位觀察到明亮的熒光，但在外部磁場作用下，腫瘤中的熒光更亮，表明Fe3O4@TiO2-DOX NPs 具有良好的磁靶向性和持久性。在體內(nèi)實驗Fe3O4@TiO2-DOX NPs +SDT 組腫瘤抑制率最高，提示二者聯(lián)合具有協(xié)同治療效應。超聲波輻照產(chǎn)生的微射流在細胞膜上生成可逆或不可逆性小孔即超聲波的聲孔效應，導致細胞膜通透性增加，促進化療藥物的釋放和進入細胞，增強抗腫瘤效應。納米顆粒由于其復雜的納米結(jié)構(gòu)和大的表面積體積比，廣泛應用于化學偶聯(lián)或物理包埋各種化療藥物，通過被動積累或主動靶向方法靶向進入腫瘤[33]。納米顆粒促進SDT與化療聯(lián)合，具有協(xié)同效應，對于化療藥物的靶向輸送，增強靶區(qū)藥物濃度及療效，實現(xiàn)多功能化治療方面有重要作用。

SDT的治療效果通過超聲、MRI、CT進行實時監(jiān)測與評估。納米顆?？梢杂米鞒晫Ρ葎╱ltrasound contrast agents，UCA）進行對比增強成像，制備固體二氧化硅納米顆粒，可顯著提高成像對比度、精度及亮度，從而優(yōu)化治療效率[34]。MARTINEZ 等[35]將全氟碳氣體填充到中空二氧化硅納米顆粒中，可增強乳腺組織的超聲成像，納米顆粒表面偶聯(lián)曲妥珠單抗，可增強乳腺癌彩色多普勒超聲成像效果及對比度，便于早期診斷。超順磁性納米顆粒通過增強磁共振成像信號，表現(xiàn)出高度敏感的MRI對比功能，并提供實時成像，在靶向治療期間大大提高了診斷準確性。MALVINDI 等[36]制備超順磁納米顆粒包封二氧化鈦，能夠特異性聚集于靶區(qū)，進行磁共振T2 加權和超聲雙模成像，有助于定點治療和療效監(jiān)測。納米顆粒進行雙模及多模態(tài)成像用于SDT的早期診斷和精準顯影，將多種影像技術相結(jié)合，對實現(xiàn)精準醫(yī)療具有很高應用價值。

4 問題與展望

納米醫(yī)學的快速發(fā)展為臨床疾病的治療提供了更為有效的途徑，納米顆粒聯(lián)合聲動力療法，具有增強治療效改善患者預后的巨大潛力。然而，從實驗研究轉(zhuǎn)化為臨床治療仍然是一條漫長且具有挑戰(zhàn)性的道路。研發(fā)對超聲敏感的光聲納米顆粒及增加納米顆粒載藥量，保持生物持久性和相容性仍是發(fā)展的關鍵點。納米顆粒能負載治療藥物（如核素、阿霉素、紫杉醇、siRNA、DNA 等），促進SDT與放療、化療、光熱治療、基因治療相結(jié)合，實現(xiàn)協(xié)同治療。納米顆粒的多模態(tài)成像適用于個性化監(jiān)測體內(nèi)腫瘤、靶向治療和檢測治療結(jié)果等方面，綜合不同成像方式的優(yōu)勢，可以更好地了解疾病的狀態(tài)及預后。相信，納米顆粒聯(lián)合聲動力治療將在臨床診斷及治療中，具有廣闊而深遠的應用前景。