梁桂紅, 華營鵬, 周婷, 宋海星, 張振華

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 長沙 410128)

高等植物的進(jìn)化成功，很大程度上是由于它們獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。液泡作為成熟植物細(xì)胞中最大的細(xì)胞器，約占細(xì)胞體積的 90%，在細(xì)胞生長發(fā)育和植物適應(yīng)逆境脅迫的過程中扮演著重要角色[1-2]。作為植物細(xì)胞中一個獨(dú)特的區(qū)室結(jié)構(gòu)，液泡周圍被膜包被，主要參與細(xì)胞代謝產(chǎn)物的累積、細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、有毒物質(zhì)向液泡內(nèi)的區(qū)隔以及對細(xì)胞生理行為和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控[3-4]，液泡膜上的質(zhì)子泵是參與實(shí)現(xiàn)其生理功能的關(guān)鍵因素。

植物液泡膜上有兩種功能和物理特性完全不同的質(zhì)子泵，即液泡膜 ATP 酶(vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)和液泡膜焦磷酸酶(vacuolar H+-pyrophosphatase, V-PPase)[5-6]，這兩種酶分別以 Mg·ATP 和 Mg·PPi 為底物，水解得到的 H+由胞質(zhì)進(jìn)入液泡中，形成細(xì)胞質(zhì)與液泡間的質(zhì)子電化學(xué)勢梯度，驅(qū)動各種溶質(zhì)分子的跨液泡膜主動運(yùn)輸[7-8]，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)和滲透平衡，減少對細(xì)胞的傷害。同時，大量 H+被泵入液泡中造成液泡酸化和細(xì)胞質(zhì)堿化，為細(xì)胞中各種生理生化反應(yīng)提供適宜的條件，對細(xì)胞的生長發(fā)育起著重要作用。此外，液泡作為植物細(xì)胞離子養(yǎng)分的儲存庫，在逆境脅迫條件下，定位于液泡膜上的兩種質(zhì)子泵 H+-ATPase 和 H+-PPase 能通過改變其結(jié)構(gòu)和活性來提高植物對非生物逆境脅迫的適應(yīng)能力，減少逆境脅迫對植物生長發(fā)育造成的不利影響。劉建新等[9]和 Maeshima[10]研究表明，在鹽脅迫條件下 V-ATPase 和 V-PPase 的活性均顯著增加，催化底物產(chǎn)生的 H+梯度能夠通過質(zhì)子反向運(yùn)輸機(jī)制將細(xì)胞質(zhì)中過量的 Na+向液泡內(nèi)運(yùn)輸和積累，減少有害離子對細(xì)胞的毒害作用，保護(hù)植株在鹽脅迫等逆境條件下正常生長[11-13]。由此可見，液泡膜質(zhì)子泵功能的正常發(fā)揮對植物體內(nèi)各種生理活動的正常進(jìn)行至關(guān)重要。

本文主要介紹了植物液泡膜上兩種質(zhì)子泵的結(jié)構(gòu)特征及其在植物生長發(fā)育過程中的生理功能，并對其在植物抵御非生物逆境脅迫過程中發(fā)揮的重要作用進(jìn)行闡述，為加速優(yōu)質(zhì)抗逆作物的育種提供方向。

1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的結(jié)構(gòu)特征與生理功能

1.1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的結(jié)構(gòu)

液泡膜作為區(qū)隔植物胞質(zhì)與液泡之間物質(zhì)交換的屏障，其上的兩個質(zhì)子泵發(fā)揮著重要作用。液泡膜 H+-ATPase 是一個多亞基、高度保守的蛋白質(zhì)復(fù)合體，分子質(zhì)量為 400～650 kDa，在不同植物材料中約占液泡膜蛋白的 6%～8%，最高可達(dá) 30%[14]。V-ATPase 廣泛存在于植物細(xì)胞中，迄今已發(fā)現(xiàn)的亞基有 12 種，其中大部分亞基與酵母液泡膜 H+-ATPase 有較高的同源性[6]。液泡膜 H+-ATPase 全酶結(jié)構(gòu)分為親水區(qū) V1 和疏水區(qū) V0 兩部分：其中 V1 部分由 VHA-A、VHA-B、VHA-C、VHA-D、VHA-E、VHA-F、VHA-G 和 VHA-H 亞基組成，露于胞質(zhì)一側(cè)，主要負(fù)責(zé) ATP 的水解；V0 部分由 VHA-a、VHA-c、VHA-d 和 VHA-e 等亞基組成，整合于膜中，起質(zhì)子通道的作用，同時作為 V1 亞基聚合和裝配的基點(diǎn)(圖1A)[14-16]。與液泡膜 H+-ATPase 相比，H+-PPase 的結(jié)構(gòu)簡單，由一條寡肽鏈組成，約占膜蛋白的 1%～10%[17]，廣泛存在于植物和少數(shù)藻類、原生動物以及細(xì)菌中[10]。在擬南芥中，有 3 種編碼 V-PPase 的基因，其中 1 種基因編碼 Ⅰ 型酶，叫作AtVHP1;1；另 2 種基因編碼 Ⅱ 型酶，叫作AtVHP2;1和AtVHP2;2[18]。它們分布在液泡膜上的不同區(qū)域，在細(xì)胞中參與不同的生理過程。1992 年，Sarafian等[19]第一次從擬南芥中克隆出完整的液泡膜 H+-PPase cDNA 序列，命名為AVP1(Arabidopsisvacuolar H+-pyrophosphatase)，屬于 K+激活型，對 Ca2+的抑制中度敏感；2000 年，Drozdowicz 等[20]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了另一種液泡膜 H+-PPase 類型，與AVP1不同的是，AVP2定位在高爾基體，屬于 K+遲鈍型，對 Ca2+的抑制高度敏感。研究表明AVP2與AVP1及其他植物液泡膜H+-PPase 的序列相似性只有 36%[10]，不屬于同功酶[7]。此外，2000 年，Maeshima[10]提出了植物液泡膜 H+-PPase 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)模型，在此模型中，液泡膜焦磷酸酶有 6 個液泡環(huán)、7 個胞質(zhì)環(huán)和 14 個跨膜區(qū)域，同時具有 3 個高度保守的片段(CS1、CS2、CS3)，細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的 e 環(huán)是 V-PPase 底物的結(jié)合位點(diǎn)(圖1B)。

注：A：V-ATPase。黃色部分是V1亞基，綠色部分是V0亞基。B:V-PPase。CS1、CS2 和 CS3 代表高度保守的片段；數(shù)字代表14個跨膜結(jié)構(gòu)域；字母(a、c、e、g、i、k 和 m)代表7個胞質(zhì)環(huán)，字母(b、 d、f、h、j 和 l)代表6個液泡環(huán)。Note: A：V-ATPase. Yellow shows V1 subunits and green shows V0 subunits. B:V-PPase. CS1, CS2 and CS3 all represent highly conservative fragments. The numbers represent fourteen transmembrane domains. The letters above (a, c, e, g, i, k and m) represent seven cytoplasmic rings and the letters below (b, d, f, h, j and l) represent six vacuole rings.圖1 液泡膜V-ATPase和V-PPase的結(jié)構(gòu)模型[10,16]Fig.1 Structure model of the tonoplast V-ATPase and V-PPase[10,16].

1.2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的生理功能

液泡膜質(zhì)子泵是含量豐富的液泡膜蛋白，表明其投入到液泡運(yùn)輸中的能量是巨大的[21-22]。液泡膜質(zhì)子泵通過水解底物，將產(chǎn)生的 H+泵入液泡，形成跨液泡膜的 H+梯度，為溶質(zhì)在胞質(zhì)和液泡間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供驅(qū)動力，維持胞質(zhì)中各種溶質(zhì)分子的相對恒定。同時，大量 H+被泵入液泡導(dǎo)致液泡酸化和細(xì)胞質(zhì)堿化，為細(xì)胞中各種生理生化反應(yīng)的進(jìn)行提供適宜的內(nèi)環(huán)境，保證生命活動的正常進(jìn)行(圖2A)[23]。此外，液泡膜質(zhì)子泵 V-ATPase 和 V-PPase 的活性與植物激素密切相關(guān)，能夠調(diào)控激素的分泌和在植物體內(nèi)的分布進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育。研究表明，脫落酸對 V-ATPase 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有明顯的調(diào)節(jié)作用，用 50 mmol·dm-3ABA 處理黃瓜幼苗 24 h 后，液泡膜質(zhì)子泵 V-ATPase 的活性顯著增強(qiáng)[24]。Li 等[25]研究表明，AtAVP1基因能夠調(diào)控生長素的運(yùn)輸進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育。過表達(dá)AtAVP1能夠促進(jìn)生長素的運(yùn)輸，加速細(xì)胞分裂；而缺失AtAVP1基因后，突變體中生長素運(yùn)輸減少，根和地上部的生長發(fā)育受到顯著抑制。

注：A:pH調(diào)節(jié)。已知與建立液泡pH有關(guān)的質(zhì)子泵(紅色)和轉(zhuǎn)運(yùn)子(藍(lán)色)。橙色表示參與調(diào)控質(zhì)子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)子的相關(guān)因子。CLCs是運(yùn)輸通道蛋白；NHXs是Na+、K+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)體。B：有毒重金屬效應(yīng)。已知與重金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的液泡膜質(zhì)子泵(紅色)和轉(zhuǎn)運(yùn)子(藍(lán)色)。Note: A：pH regulation. Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in establishing the vacuolar pH. Orange shows factors involved in the regulation of pumps and transporters. CLCs are Cl-, transport channel proteins and NHXs are Na+, K+/H+ antiporter. B:Toxic heavy metals transportation.Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in delivering or releasing heavy metals.圖2 液泡膜質(zhì)子泵和轉(zhuǎn)運(yùn)子參與液泡 pH 調(diào)節(jié)和有毒重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)[23]Fig.2 Vacuolar proton pumps and transporters involved in vacuolar pH regulation and toxic heavy metals transportation[23].

2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與的關(guān)系

3 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與植物生長發(fā)育的關(guān)系

液泡膜質(zhì)子泵水解底物產(chǎn)生的能量和 H+梯度，為各種溶質(zhì)分子的逆濃度梯度運(yùn)輸提供驅(qū)動力[7-8]，維持細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)等的相對恒定，為植物細(xì)胞中各種生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行提供條件，對細(xì)胞的生長發(fā)育起著重要作用。Li等[25]研究表明，液泡膜 H+-PPase 功能缺失型擬南芥突變體地上部和根的生長發(fā)育均受到顯著抑制，子葉畸形，多數(shù)植株因花芽分化和生殖器官的形成受到影響而不能正常結(jié)實(shí)，這些發(fā)育不正常的現(xiàn)象有可能是由于質(zhì)子泵發(fā)生故障導(dǎo)致植物生長激素不正常分布所引起的。當(dāng)液泡膜上編碼 H+-PPase 的基因AVP1功能增強(qiáng)時，擬南芥植株蓮座葉數(shù)目多、面積大、根系發(fā)達(dá)，且生長素運(yùn)輸減少。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AVP1與植株蓮座葉大小和鮮重沒有直接的正相關(guān)關(guān)系[32]。當(dāng) V-ATPase 的活性缺失后，液泡不能酸化，植株生長受到抑制，表現(xiàn)出植株矮小黃化的表型，且在突變體vha-a2vha-a3中過表達(dá)AVP1并不能增大蓮座葉尺寸和生物量，對葉片細(xì)胞汁液的 pH 也沒有顯著影響，即在正常生長條件下，通過增強(qiáng)液泡膜 H+-PPase 的活性不能彌補(bǔ)液泡膜 H+-ATPase 活性的缺乏[32]。

4 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 與非生物脅迫的關(guān)系

4.1 鹽脅迫

鹽脅迫是一種普遍存在的非生物逆境脅迫，對植物的生長發(fā)育造成不良影響。植物長期在鹽漬環(huán)境中生長，必須要克服由于土壤離子濃度高造成的滲透脅迫和離子自身產(chǎn)生的毒害，在長期進(jìn)化過程中就會形成一系列復(fù)雜的耐鹽機(jī)制以適應(yīng)外界環(huán)境。其中，液泡膜質(zhì)子泵作為溶質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的動力開關(guān)，在胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和植物抗鹽過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，液泡膜上的多種離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，能夠利用 H+-ATPase 和 H+-PPase 水解底物產(chǎn)生的 H+梯度，通過質(zhì)子反向運(yùn)輸機(jī)制將各種陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡內(nèi)，維持細(xì)胞中各離子平衡，有利于植物在鹽脅迫下正常生長[11-13]。

鹽脅迫條件下液泡膜上的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將胞質(zhì)中過量的 Na+區(qū)隔到液泡內(nèi)，減輕過多 Na+累積對細(xì)胞的毒害[33]，在這個過程中，液泡膜質(zhì)子泵形成的 H+梯度是 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白區(qū)隔離子的必要驅(qū)動力。鹽脅迫條件下，液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 活性的提高是植物表現(xiàn)耐鹽性的重要指標(biāo)之一[10]。劉建新等[9]用 50、100、200、400 mmol·L-1NaCl 處理駱駝蓬幼苗，發(fā)現(xiàn)其根和葉片液泡膜 H+-ATPase 活性隨 NaCl 濃度升高而增強(qiáng)，當(dāng)濃度為 400 mmol·L-1時，根和葉片液泡膜 H+-ATPase 活性為對照的 2.14 和 2.64 倍。鹽地堿蓬在 100 和 400 mmol·L-1NaCl 條件下處理 7 d，其葉片液泡膜 H+-ATPase 活性分別為對照的 2.71 和 2.57 倍[34]。Qiu 等[11]的研究也表明堿蓬在受 200 mmol·L-1NaCl 脅迫時，其液泡膜 H+-ATPase 和 Na+/H+反向運(yùn)輸體的活性增強(qiáng) 2～3 倍。徐呈祥等[35]對 4 個棗品種耐鹽性與液泡膜質(zhì)子泵活性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽性強(qiáng)的棗品種，液泡膜質(zhì)子泵的活性較高，根尖細(xì)胞向質(zhì)外體的“排鹽”功能和向液泡內(nèi)的“固鹽”功能均增強(qiáng)，葉片細(xì)胞向質(zhì)外體的“排鹽”功能基本不變，而向液泡內(nèi)的“固鹽”功能顯著增強(qiáng)，鹽脅迫下耐鹽性弱的棗品種葉片液泡膜質(zhì)子泵活性下降或略有增強(qiáng)。液泡膜質(zhì)子泵的活性對鹽脅迫的響應(yīng)也不盡相同。張敏等[36]研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹幼苗根和葉組織在低濃度 NaCl 處理下，根組織液泡膜 H+-ATPase 的活性提高，當(dāng) NaCl 濃度為 150 mmol·L-1時，H+-ATPase 活性有所下降。播種 8 d 的高粱種子用 NaCl 處理不同時間發(fā)現(xiàn)，第 1 d時根和葉鞘液泡膜 H+-ATPase 活性顯著增強(qiáng)，第 2 d時活性降至對照水平，到第 7 d時活性明顯低于對照，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢[37]。定位在液泡膜上的另一種質(zhì)子泵 V-PPase 活性同樣在鹽脅迫下有所變化。2001 年，Gaxiola 等[38]首次將AVP1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株在 250 mmol·L-1NaCl 培養(yǎng)10 d 后能正常生長，葉面積和鮮重顯著增加，抗鹽能力增強(qiáng)，同時發(fā)現(xiàn)其AVP1蛋白水平顯著高于野生型。Duan 等[39]發(fā)現(xiàn)，100～400 mmol·L-1NaCl 處理 5 min，過量表達(dá)液泡膜 H+-PPase 的轉(zhuǎn)基因煙草葉肉細(xì)胞的存活率均比野生型更高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性。Krebs 等[30]用 50 和 100 mmol·L-1NaCl 處理培養(yǎng)4 d 的擬南芥幼苗發(fā)現(xiàn)，其液泡膜上 H+-PPase 的活性均增強(qiáng)。盡管液泡膜上的兩個質(zhì)子泵在響應(yīng)鹽脅迫方面發(fā)揮著類似的功能，但H+-ATPase和 H+-PPase 的貢獻(xiàn)并不完全相同。Wang 等[40]研究表明，鹽地堿蓬受到鹽脅迫時，液泡膜 H+-ATPase 的作用更大。Yu 等[41]以耐鹽型大豆為試驗(yàn)材料，卻發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下根細(xì)胞液泡膜H+-PPase 的活性提高而 H+-ATPase 活性降低。這可能與試驗(yàn)材料的種類、所選材料的發(fā)育狀況及脅迫程度有關(guān)?？偟膩碚f，鹽脅迫條件下，較高的液泡膜質(zhì)子泵活性為 Na+區(qū)隔到液泡中提供質(zhì)子驅(qū)動力，因此，鹽脅迫下液泡質(zhì)子泵活性的變化是衡量植物耐鹽性的重要指標(biāo)之一。

4.2 干旱脅迫

干旱脅迫也是自然界中普遍存在的非生物脅迫之一，是降低農(nóng)作物產(chǎn)量和制約我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素之一。干旱脅迫容易造成植物脫水萎焉，滲透壓失衡，嚴(yán)重影響植物的正常生長發(fā)育。通過提高液泡膜質(zhì)子泵活性來增大細(xì)胞內(nèi)的 H+跨膜梯度，利用 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)胞質(zhì)中更多的 Na+泵入到液泡，提高植物對鹽的耐受力；另一方面，可利用 NaCl 作為溶質(zhì)維持滲透勢以驅(qū)動水分進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)大量 Na+被區(qū)隔到植物液泡內(nèi)，細(xì)胞為維持滲透壓平衡，就會累積大量的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和無機(jī) K+，有利于增強(qiáng)植株的保水性，提高植物的抗旱能力[7,39]。Gaxiola 等[39]研究表明過表達(dá)AVP1基因能顯著增強(qiáng)擬南芥的抗旱能力。在嚴(yán)重缺水條件下，AVP1的過表達(dá)刺激了生長素在根系中的轉(zhuǎn)運(yùn)并促進(jìn)根系生長，這有助于轉(zhuǎn)基因棉花在干旱條件下更有效地吸收水分并受到較少的損害，獲得更高的生物量[42]。此外，在番茄[43]、水稻[44]、煙草[12]和玉米[45]中也證實(shí)了提高液泡膜質(zhì)子泵活性能增強(qiáng)植物對干旱的適應(yīng)能力。由此可見，液泡膜質(zhì)子泵活性的高低在植物應(yīng)對干旱脅迫方面扮演著重要角色，對于我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

4.3 金屬陽離子脅迫

液泡膜質(zhì)子泵作為胞質(zhì)和液泡間物質(zhì)交換屏障的動力開關(guān)，在區(qū)隔有害離子到液泡內(nèi)，從而減少過量離子對細(xì)胞產(chǎn)生毒害方面發(fā)揮著重要作用。液泡膜上有大量金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠依賴液泡膜質(zhì)子泵水解產(chǎn)生的能量和 H+梯度轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子(圖2B)[23]。鎘是一種非必需的毒性很強(qiáng)的重金屬，被認(rèn)為是“五毒”重金屬元素之一，可以通過與膜蛋白的競爭性結(jié)合進(jìn)入植物或動物細(xì)胞體內(nèi)累積[46-48]，對植物的生長發(fā)育和細(xì)胞的新陳代謝具有嚴(yán)重?fù)p害[49]。鎘脅迫條件下植株會通過一系列的生理反應(yīng)來減輕鎘毒害，其中陽離子交換體(cation exchangers, CAXs)和 HMA 家族在這個過程中發(fā)揮著重要作用。CAX2編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多定位于植物液泡，主要利用兩個質(zhì)子泵水解產(chǎn)生的 H+梯度促進(jìn)植物胞質(zhì)中的鎘向液泡累積[50]。HMA 家族主要利用質(zhì)子泵水解釋放的能量將 Cd2+轉(zhuǎn)入液泡中，其中 HMA2 和 HMA4 負(fù)責(zé)鎘向木質(zhì)部的轉(zhuǎn)運(yùn)，而 HMA3 定位在根部液泡膜上，負(fù)責(zé)將鎘轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡[51-53]。Ren 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)4周的小麥用1 mmol·L-1鎘處理7 d時，葉片液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的活性均顯著提高 1.5～2.5 倍，增強(qiáng)了植株對鎘脅迫的耐受性。液泡膜 H+-ATPase 或 H+-PPase 活性降低后，水解底物產(chǎn)生的 H+梯度減弱，Cd2+向液泡中的儲存減少，更多的Cd2+滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，表現(xiàn)出對鎘脅迫敏感的表型，植株的生長發(fā)育受到顯著抑制。此外，液泡膜上的 Zn2+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對植物抵抗鋅毒害具有重要作用[55-56]。當(dāng)培養(yǎng) 13 d 的擬南芥幼苗用50 和150 μmol·L-1ZnCl2處理時，野生型的根長減少 15% 和 25%，而突變體vha-a2vha-a3的根長生長受到更嚴(yán)重的抑制，分別減少 35% 和 65%[32]。因此，提高植物液泡膜質(zhì)子泵的活性有利于植物將過多的金屬陽離子區(qū)隔到液泡中，提高植物在逆境脅迫中的耐性。

4.4 其他非生物脅迫

5 展望