韓曉雨 張景翔 閻瀾

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員二大隊學(xué)員五隊，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院軍特藥研究中心，上海 200433)

近年來隨著大量抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開展，真菌感染日漸增多，尤其是需要重癥監(jiān)護的患者[1]。而在所有的真菌感染中，又以白念珠菌最多見。膿毒性念珠菌感染患者的死亡率超過30%[2]。真菌感染是重癥監(jiān)護人群中高發(fā)病率，高死亡率的最常見原因之一。侵襲性念珠菌病 (invasive candidiasis，IC)是實體器官移植受者 (organ transporter，OTR)死亡的常見原因，其中最常見的物種是白念珠菌 (46.3%)[3]。隨著真菌對經(jīng)典抗真菌藥物耐藥性的日漸增加，尋找新的抗真菌藥物靶點刻不容緩。白念珠菌液泡對菌絲生長和致病力至關(guān)重要，因此，研究真菌液泡功能及其發(fā)揮作用的機制有助于尋找抗真菌化合物新靶點及篩選新的化合物。

液泡是真菌細胞中類似哺乳動物細胞中溶酶體的一種細胞器，為一種較大的酸化細胞器，具有降解大分子、儲存營養(yǎng)物質(zhì)、耐受外界壓力，維持鈣和金屬離子的穩(wěn)態(tài)[4]，內(nèi)吞和分泌途徑中的膜運輸?shù)裙δ躘5]。真菌液泡是一種高度動態(tài)的細胞器，白念珠菌由無毒力的酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸玖Φ木z相時也要經(jīng)歷液泡的動態(tài)變化。液泡主要通過促進菌絲生長及提高白念珠菌對應(yīng)激的反應(yīng)能力兩方面來幫助白念珠菌發(fā)揮其毒力[6-7]。在液泡生物發(fā)生中具有嚴(yán)重缺陷的突變菌株是無侵襲力的。通過抑制液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運ATP酶 (Vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase)功能和通過V-ATP酶抑制劑酸化酵母液泡，也可以降低白念珠菌的毒力。白念珠菌的菌絲在宿主的定植和侵襲期間起著重要作用，而菌絲的生長又受到液泡的調(diào)節(jié)，因此通過抑制液泡的功能來降低白念珠菌的侵襲力是理想的抗真菌策略?，F(xiàn)對白念珠菌液泡重要功能蛋白研究進展作一綜述。

1 V-ATPase

液泡功能取決于液泡V-ATPase維持酸性pH值[8]。V-ATPase存在于液泡膜，由V0、V1亞基組成，通過將H+從細胞質(zhì)主動轉(zhuǎn)運入液泡內(nèi)從而維持液泡內(nèi)酸化，對蛋白質(zhì)加工和降解，內(nèi)吞運輸，pH驅(qū)動的胞吐作用，代謝物、離子和毒性藥物的運輸和隔離等發(fā)揮重要作用[9]，也是白念珠菌維持侵襲力所必需的蛋白之一。V-ATPase活性受損會削弱白念珠菌侵襲感染過程中許多因素：如毒力因子 (利于菌絲侵入的酶)的分泌，菌絲向宿主細胞的侵入，生物被膜形成，抵抗宿主固有免疫力和產(chǎn)生對抗真菌藥物的耐受性。VMA基因缺失菌缺乏V-ATPase活性，不能正常酸化內(nèi)膜腔，在分泌，內(nèi)體和液泡途徑中均表現(xiàn)出缺陷，在小鼠體內(nèi)無毒力[2]。

其結(jié)構(gòu)由跨膜的V0和細胞質(zhì)內(nèi)的V1兩個亞單位組成，前者為H+提供通道，后者能分解ATP，為逆濃度梯度轉(zhuǎn)運H+提供能量。V0和V1只有在聚合時，V-ATPase全酶才有功能。Voa亞基是唯一由兩種同種型VPH1和STV1編碼的真菌V-ATPase亞基，分別定位于高爾基體和分泌途徑，或定位于液泡膜。V-ATPase利用ATP水解將質(zhì)子從細胞質(zhì)驅(qū)動到液泡腔，酸化液泡并調(diào)節(jié)酵母細胞中的幾種關(guān)鍵細胞反應(yīng)系統(tǒng)。在tetRVMA3菌株中抑制VMA3可阻止V-ATPase在液泡膜上組裝，使ATP酶特異性活性和質(zhì)子轉(zhuǎn)運減少90%以上，并使康納霉素 (concanamycin)敏感性降低[10]。由V-ATPase產(chǎn)生的pH梯度是分泌途徑中許多毒力相關(guān)蛋白質(zhì) (例如天冬氨酰蛋白酶，脂肪酶，黏附和侵襲素)分泌所必需的，這有助于白念珠菌對宿主細胞的侵襲和定植[11]。此外，自噬過程需要酸性細胞腔環(huán)境來刺激負責(zé)各種降解的酶，故也需要V-ATPase。除了細胞內(nèi)pH，環(huán)境pH對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)變也有很大影響[12]。到2009年，已經(jīng)描述了8種類型的V-ATPase抑制劑[13]?？筕-ATPase藥物臨床使用可以避免使用唑類物質(zhì)產(chǎn)生多重耐藥性的問題。

2 液泡酸化

液泡酸化不僅對白念珠菌形成菌絲和建立感染的能力具有重要作用[2]，而且對于從蛋白質(zhì)分選和降解到整體離子穩(wěn)態(tài)的各種其他過程也是非常重要的[9]。微生物致病過程的關(guān)鍵是對pH的反應(yīng)。在致病性酵母如白念珠菌中，pH與真菌細胞增殖，芽殖和菌絲形態(tài)之間的二態(tài)轉(zhuǎn)換以及毒力有關(guān)[14]。釀酒酵母中V-ATPase功能的喪失導(dǎo)致1組生長缺陷，統(tǒng)稱為vma表型。vma表型的特征是不能在堿性 (pH 7.5至8.5)、含有高濃度鈣、或含有不可發(fā)酵的碳源作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，而在酸性介質(zhì)上生長 (pH 4.0到5.0)類似于野生型。因此，V-ATPase功能的阻遏會干擾各種關(guān)鍵細胞過程和可能對真菌毒力很重要的應(yīng)激反應(yīng)。VMA3編碼V0C亞基，白念珠菌VMA3是液泡酸化、V-ATP酶組裝和功能，以及菌絲形成所必需的[10,15]，并有助于蛋白酶、脂肪酶分泌和絲狀化。VMA3的缺失抑制了絲狀化并導(dǎo)致異常的液泡形態(tài)。VMA3的丟失比V0a同種型VPH1的喪失更嚴(yán)重的抑制絲狀化[10]。Johnson等[16]證實了Stv1p和Vph1p在白念珠菌中具有重疊功能及V-ATPase的重要性。VPH1是白念珠菌中毒力所必需的，Vph1的破壞可導(dǎo)致天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶的活性降低，以及絲狀缺陷，Stv1p與黏附相關(guān)蛋白的分泌有關(guān)。VMA7缺失菌株的pH耐受性喪失，鈣穩(wěn)態(tài)、細胞壁應(yīng)力和呼吸缺陷[17]。胺碘酮通過堿化液泡發(fā)揮其抗真菌作用，并且在相同濃度下，也抑制白念珠菌中菌絲的形成[18]。VMA5負責(zé)編碼V1C基，VMA5的破壞導(dǎo)致生長抑制，液泡功能障礙，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂和鈣相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制。其缺失導(dǎo)致自噬完成和菌絲發(fā)育的缺陷，并導(dǎo)致減弱的白念珠菌毒力[19]。VMA2負責(zé)編碼V1B亞基，VMA2表達的抑制導(dǎo)致氧化反應(yīng)，溫度反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)的耐受性差[8,20]，導(dǎo)致不能在堿性pH下生長，并且改變對鈣，低溫，抗真菌藥物和對不可發(fā)酵碳源的生長的抗性。此外，V-ATP酶不能在液泡膜上完全組裝，并且質(zhì)子轉(zhuǎn)運和ATP酶特異性活性受損。除異常液泡形態(tài)和生物發(fā)生外，VMA2抑制導(dǎo)致液泡堿化，毒力相關(guān)性狀，包括降解酶的細絲和分泌過程被顯著抑制[20]。哺乳動物中不存在V0c'亞基的同源蛋白。因此，這種真菌特異性亞基具有很大的潛力，使其成為抗真菌藥物發(fā)現(xiàn)的理想靶標(biāo)[10]。

Vma7p與PI 3激酶Vps34p物理相互作用，PI 3激酶Vps34p是液泡蛋白轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶[21]。研究表明vma7缺失菌和vps34缺失菌在空泡酸化和金屬離子的解毒作用方面具有相同的缺陷，提示液泡蛋白轉(zhuǎn)運功能與液泡質(zhì)子轉(zhuǎn)運和液泡酸化有關(guān)[17]。

3 液泡相關(guān)基因和蛋白

3.1 Tfp1

Tfp1Δ/Δ突變菌在菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中顯示出明顯受損的絲狀發(fā)育，并且在系統(tǒng)性念珠菌病的小鼠模型中是無致病力的。V1亞基Tfp1對于液泡功能和白念珠菌的發(fā)病機制至關(guān)重要，并且為抗真菌藥物提供了有希望的候選物[22]。

3.2 Mlt1

Mlt1是白念珠菌中的第1個被鑒定的液泡ABC轉(zhuǎn)運蛋白 (ATP-binding cassette protein)，位于液泡膜中，可以在體外將NBD-PC轉(zhuǎn)運到液泡腔中，其破壞導(dǎo)致脂質(zhì)均勻性改變[23]。Mlt1缺失不僅導(dǎo)致液泡腔中NBDPC積累的完全喪失，還可導(dǎo)致內(nèi)吞作用和毒力缺陷。Mlt1的缺失也對各種毒力相關(guān)性狀產(chǎn)生負面影響，例如菌絲形成，分泌蛋白酶活性/分泌和對氧化應(yīng)激的敏感性。ABC轉(zhuǎn)運蛋白參與內(nèi)吞作用是最近發(fā)現(xiàn)的一種新功能。白念珠菌的菌絲發(fā)育與內(nèi)吞作用有關(guān)，而且菌絲發(fā)育和毒力之間存在完全相關(guān)性。Mlt1p將PC轉(zhuǎn)運到液泡腔中，它影響脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致內(nèi)吞作用延遲，菌絲和生物膜缺陷，藥物易感性，蛋白酶活性/分泌，氧化應(yīng)激的激活，上述同時作用以達到最大減毒效果[24]。

3.3 VPS家族

白念珠菌通過Rim/Pal蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及ESCRT/液泡蛋白質(zhì)分選組分對堿性pH環(huán)境作出應(yīng)答，其中Vps28和Vps32相互作用。VPS28和VPS32的缺失[25]，使菌株對堿性pH敏感性升高，并降低了白念珠菌的毒力[26]。此外，有一致的證據(jù)表明，破壞pH的抗真菌藥物也會阻止菌絲形成。Vps11p定位于液泡膜，白念珠菌vps11Δ/Δ菌株在液泡的生物發(fā)生和功能方面存在缺陷，如對壓力的敏感性升高，蛋白水解活性降低和嚴(yán)重的菌絲形成缺陷，并且缺乏可識別的液泡結(jié)構(gòu)[27]。Vps34p與液泡H+-ATPase Vma7p的亞基物理相互作用，Vps34p蛋白是液泡酸化和堿性pH下生長所必需的。白念珠菌的vps34缺失菌的自噬作用有缺陷[28]。

4 離子穩(wěn)態(tài)

離子穩(wěn)態(tài)對于細胞基因表達，形態(tài)轉(zhuǎn)變，宿主入侵，應(yīng)激反應(yīng)，耐藥性，離子信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)均至關(guān)重要，故對于真菌存活至關(guān)重要。離子穩(wěn)態(tài)的失調(diào)迅速介導(dǎo)細胞死亡，形成了越來越多抗真菌活性的化合物的機制基礎(chǔ)。在白念珠菌中，離子可參與膜電位維持，細胞體積調(diào)節(jié)，多種酶的輔因子形成，增殖和凋亡[29]。此外，研究發(fā)現(xiàn)離子穩(wěn)態(tài)與氧化應(yīng)激反應(yīng)，形態(tài)發(fā)生，細胞壁完整性和侵襲性生長密切相關(guān)。Ccc1是位于液泡中的鐵轉(zhuǎn)運蛋白，當(dāng)培養(yǎng)基含有足夠量的鐵時，它參與鐵從胞質(zhì)溶膠到液泡的隔離[30]。還原鐵吸收系統(tǒng)在白念珠菌中與黏附，菌絲形成，抗真菌藥物抗性，細胞壁完整性和線粒體功能相協(xié)調(diào)[31-32]。破壞離子穩(wěn)態(tài)的化合物可以發(fā)揮抗真菌作用甚至逆轉(zhuǎn)白念珠菌的耐藥性。基于離子穩(wěn)態(tài)的新機制可能為尋找真菌特異性靶標(biāo)提供線索。

5 Vacuole Disrupting化學(xué)試劑 (VDA)

由于液泡的正常形態(tài)與功能對維持白念珠菌侵襲和致病力發(fā)揮重要作用，因此可以作為藥物候選靶點。液泡完整性的嚴(yán)重破壞使白念珠菌不能定殖或侵入哺乳動物組織。破壞特定的液泡膜運輸步驟也可以使白念珠菌對最廣泛使用的抗真菌藥物唑類敏感[33]。約50%的VDA化合物具有真菌選擇性，不改變哺乳動物溶酶體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。通過篩選發(fā)現(xiàn)9種唑類抗真菌藥，1種他汀類藥物和3種NSAIDs可以作為VDA顯著改變液泡數(shù)量，大小和/或形狀，這些VDA都抑制白念珠菌的菌絲形成[34-35]。9種唑類抗真菌藥物，可抑制麥角甾醇的合成。麥角甾醇是一種調(diào)節(jié)膜雙層流動性的脂質(zhì)，且是同型空泡體腔融合所必需的。麥角甾醇生物合成突變體具有異常的液泡形態(tài)[36]。他汀類藥物氟伐他汀通過抑制HMGCoA還原酶阻斷甾醇生物合成，在篩選中也被鑒定為VDA，進一步支持真菌甾醇含量在維持液泡完整性中的重要性。類似的，對唑類靶酶Erg11p的抑制也導(dǎo)致大量液泡破壞。之前曾有報道，在抑制白念珠菌生長之前，氟康唑治療的早期結(jié)果是發(fā)生嚴(yán)重的液泡破碎。很可能影響細胞脂肪酸，磷脂或鞘脂化合物的其他種類的小分子也會對液泡的形態(tài)和功能產(chǎn)生顯著影響[37]。擾亂液泡功能的化學(xué)試劑在多個水平損害真菌致病機理，破壞宿主體內(nèi)真菌活力。但并非所有觀察到的液泡異常都與真菌生長受損一致。VDA不會導(dǎo)致液泡運輸缺陷，但會影響白念珠菌菌絲生長。NSAIDs、托芬那酸和甲芬那酸導(dǎo)致酵母形式的液泡破碎，完全消除菌絲發(fā)育[33]。

Solasodine-3-o-d-葡聚糖苷通過破壞細胞內(nèi)液泡殺滅白念珠菌。SG (Solasodine-3-o-d-Glucohexaose)使白念珠菌的細胞內(nèi)液泡堿化，并引起液泡膜的超透性增加，導(dǎo)致細胞死亡。這些結(jié)果支持SG在抗真菌感染方面的潛在應(yīng)用，并揭示了1種新的殺真菌機制[38]。

丙戊酸 (VPA)改變了液泡的完整性，有助于發(fā)揮抗真菌活性。VPA也會導(dǎo)致肌醇耗盡，從而干擾液泡ATP酶功能[39-40]。白念珠菌對VPA的敏感性是pH依賴性的。與液泡運輸和組成相關(guān)的基因缺失菌對VPA敏感，比如參與液泡蛋白分選的缺失菌 (vps15、vps34、vps64和ypt72)，與逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)的基因缺失菌 (pep7和pep8)，以及液泡遺傳和組成所需的基因缺失菌 (cla4、pep12、vam6、vps41和pep12)。全基因組篩選分別證明逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和液泡ATP酶與VPA敏感性相關(guān)。VPA誘導(dǎo)的液泡表型不是內(nèi)吞作用，而是肌動蛋白絲擾動或肌醇耗竭的結(jié)果。液泡的完整性和體內(nèi)平衡取決于不同細胞過程的正常功能，包括肌動蛋白絲組織[41]，內(nèi)吞作用，以及磷脂酰肌醇磷酸鹽信號傳導(dǎo)[42]。Deranieh等[40]表明VPA導(dǎo)致細胞耗盡肌醇，其破壞液泡磷酸肌醇，磷脂酰肌醇3,5二磷酸 (PI-3,-5P2)穩(wěn)態(tài)并因此損害液泡形態(tài)。這些結(jié)果支持液泡的直接改變是VPA抗真菌活性的細胞機制。同時，真菌液泡具有獨特的蛋白質(zhì)，例如V0ATPase亞基，沒有明顯的人類同源物，可以特異性地靶向用于治療真菌感染的藥理學(xué)干預(yù)。

6 問題與展望

由VMA11編碼且缺乏哺乳動物同源物的真菌特異性V-ATPase亞基c’的存在進一步支持了V-ATPase作為藥物靶標(biāo)的潛力，未來的研究可集中在VMA11和相關(guān)的V-ATPase組分對白念珠菌細胞生物學(xué)和毒力的貢獻[10]。通過破壞液泡功能來作為減弱白念珠菌毒力的靶標(biāo)，是完全可行的且極具發(fā)展?jié)摿?。如可以①通過與液泡膜的物理作用，損害脂質(zhì)雙層的完整性；②直接抑制負責(zé)液泡內(nèi)AIR色素生物累積的ABC轉(zhuǎn)運蛋白；③改變脂質(zhì)組成，從而改變液泡膜的物理化學(xué)性質(zhì)；④破壞液泡的膜運輸途徑；⑤直接阻斷液泡的生物發(fā)生。未來的工作可以探索pH毒性的具體貢獻。