許英旭，沙偉，張梅娟，馬天意

（齊齊哈爾大學(xué) 1.生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到許多不利于生長(zhǎng)的生物脅迫因子和非生物脅迫因子的影響，如高溫、干旱、凍害、鹽堿、冷害、水澇、環(huán)境污染、病菌、病蟲(chóng)侵害等，而溫度是一種非常重要的非生物脅迫因素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響[1].在熱脅迫條件下，所有生物體都會(huì)產(chǎn)生熱休克反應(yīng)，并對(duì)溫度上升作出反應(yīng).每種植物的生長(zhǎng)發(fā)育都有特定的溫度需求，一般植物生長(zhǎng)溫度大約在0～44 ℃，其溫度的敏感度與其起源地有緊密的聯(lián)系[2].在持續(xù)惡化的情況下，深入了解植物抗逆反應(yīng)機(jī)制，為今后的植物生長(zhǎng)發(fā)育提供重要的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)意義.

高溫脅迫對(duì)植物的損害主要是通過(guò)使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)變性和失活，減緩或停止生化反應(yīng)，停止生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至死亡[3].高溫脅迫會(huì)增強(qiáng)植物的蒸騰作用，使水分流失過(guò)多，為了減小蒸騰，植物葉片氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致CO2攝入量減少，由于CO2是植物光合作用所必需的，高溫脅迫會(huì)因此影響光合作用，即有機(jī)物的積累[4].植物體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)都是由酶催化的，高溫脅迫會(huì)影響酶的活性，從而影響植物生長(zhǎng)代謝[5].

本文對(duì)高溫脅迫下幼苗期植物和成苗期植物的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行綜述，深入了解高溫脅迫下植物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對(duì)提高作物抗性，培育耐高溫新品種具有重要意義，也為今后植物在高溫脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)和重要依據(jù).

1 高溫脅迫下幼苗期植物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

Han[6]等在35，40，45 ℃條件下分別對(duì)7 日齡水稻（Oryza sativa）幼苗處理48 h，并檢測(cè)其葉片的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)在35～45 ℃時(shí)，連接木質(zhì)化相關(guān)蛋白和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶表達(dá)下調(diào)，而保護(hù)蛋白表達(dá)顯著上調(diào).不同的高溫會(huì)誘導(dǎo)植物采取不同的適應(yīng)策略，保護(hù)機(jī)制主要是使植物維持光合作用能力.當(dāng)溫度上升到40 ℃或更高時(shí)，一些抗氧化途徑被激活；當(dāng)遇到45 ℃的高溫時(shí)，各種熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）均被誘導(dǎo)表達(dá)，與熱休克蛋白相關(guān)的保護(hù)機(jī)制被激活.可以看出，隨著環(huán)境溫度的升高，植物會(huì)調(diào)用越來(lái)越多的保護(hù)機(jī)制參與和維持機(jī)體正常的生理代謝.

Mohammadi[7]等將發(fā)芽2 日齡油菜（Brassica campestris）幼苗分別置于較高的溫度（白天45 ℃，晚上34 ℃）脅迫和對(duì)照條件（白天22 ℃，晚上18 ℃）下，在生長(zhǎng)室中進(jìn)行16 h/8 h（光照/黑暗）的光周期，相對(duì)濕度為65%～70%，持續(xù)12 h.通過(guò)雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）進(jìn)行分離，鑒定出381 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中58 個(gè)蛋白質(zhì)在高溫脅迫下發(fā)生了顯著變化，27 個(gè)和31 個(gè)蛋白質(zhì)分別顯著下調(diào)和上調(diào)，超過(guò)30%的已鑒定蛋白質(zhì)屬于葉綠體，大多數(shù)剩余的蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)定位在細(xì)胞質(zhì)中.通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析表明，高溫脅迫對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平有重要影響，參與細(xì)胞運(yùn)輸、能量和代謝的蛋白質(zhì)的上調(diào)，以及參與疾病、防御、蛋白質(zhì)合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一些蛋白質(zhì)的下調(diào)可能是高溫脅迫下生理和形態(tài)反應(yīng)的主要原因.在油菜下胚軸中觀察到的抗壞血酸過(guò)氧化物酶蛋白和基因表達(dá)水平對(duì)高溫脅迫反應(yīng)的增加表明，抗壞血酸過(guò)氧化物酶是一種短期高溫脅迫反應(yīng)蛋白，該研究結(jié)果還表明，熱脅迫下參與能量和代謝的蛋白質(zhì)的上調(diào)可以利用油菜幼苗的大部分營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)備，這可能是熱脅迫條件下油菜生長(zhǎng)減緩的原因.

2 高溫脅迫下成苗期植物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.1 高溫脅迫下糧食作物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

Smruti Das[8]等使水稻（cv.N22）在開(kāi)花期經(jīng)受28 ℃/18 ℃（對(duì)照）和42 ℃/32 ℃（高溫脅迫）處理后檢測(cè)葉片蛋白質(zhì)組.在對(duì)照和受脅迫的葉片中，大約存在111 個(gè)共同的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中37 個(gè)上調(diào)，15個(gè)下調(diào)，另外還有59 個(gè)未鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)，成對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)的體積呈線性分布.從受高溫脅迫的葉蛋白質(zhì)組中，通過(guò)MALDI-TOF MS 分析鑒定，186 個(gè)蛋白質(zhì)獨(dú)特點(diǎn)中有30 個(gè)具有參與光合作用、解毒、能量代謝和蛋白質(zhì)生物合成的主要功能.在生長(zhǎng)室條件下，當(dāng)水稻在42 ℃的溫度下處理24 h 時(shí)，發(fā)現(xiàn)一組低分子量小熱休克蛋白（sHSPs）是由水稻葉片中的高溫脅迫誘導(dǎo)的，水稻葉綠體sHSP 在大腸桿菌（Escherichiacoli）中表達(dá)賦予了大腸桿菌對(duì)熱脅迫和氧化應(yīng)激更好的耐受性，即sHSP 在植物獲得的壓力耐受性中發(fā)揮重要作用；氧化還原穩(wěn)態(tài)在脅迫條件下，易于產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），其作為應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)分子會(huì)對(duì)細(xì)胞成分造成傷害.同時(shí)，受脅迫的葉蛋白質(zhì)組揭示了幾種新合成的糖酵解蛋白[9].

據(jù)報(bào)道，在一定范圍內(nèi)氣溫每升高1 ℃，小麥（Triticum aestivum）產(chǎn)量就會(huì)減少4%[10].高溫導(dǎo)致膜滲透性和穩(wěn)定性改變[11-12]，以及由熱誘導(dǎo)的細(xì)胞膜滲漏導(dǎo)致的電解質(zhì)流失均被認(rèn)為是嚴(yán)重細(xì)胞損傷的一種測(cè)量方法[13-14].高溫脅迫加速了分子在膜上的動(dòng)能和運(yùn)動(dòng)，從而使生物膜分子內(nèi)的化學(xué)鍵松動(dòng)，這使得生物膜的脂雙層通過(guò)蛋白質(zhì)變性或不飽和脂肪酸的增加而變得更具流動(dòng)性[15].Kumar[16]等對(duì)乳熟期小麥品種HD2985 分別進(jìn)行22 ℃（對(duì)照）和42 ℃（熱激）處理2 h，并對(duì)葉片樣品進(jìn)行熱響應(yīng)蛋白鑒定.使用Orbitrap質(zhì)譜，分別鑒定了47 和38 個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中19 個(gè)在對(duì)照和熱脅迫處理的樣品中有差異表達(dá)，差異表達(dá)蛋白質(zhì)包括熱休克蛋白70、氧釋放增強(qiáng)蛋白、鈣調(diào)蛋白、應(yīng)激預(yù)測(cè)蛋白、茜草素、茜草素活化酶等.使用第二代蛋白質(zhì)組學(xué)工具-軌道芯片鑒定差異表達(dá)的多肽，可以在對(duì)照和熱激處理的樣品中觀察到97 和262 個(gè)多肽.分析顯示，對(duì)照組、高溫脅迫處理組和2 個(gè)樣品中分別有25，190，72 個(gè)多肽，使用軌道阱（無(wú)標(biāo)記）分析，在擬南芥（Arabidopsisthaliana）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，在對(duì)照組中檢索到97 個(gè)多肽和60 個(gè)蛋白質(zhì)；在熱激處理組中鑒定到262 個(gè)多肽和135 個(gè)蛋白質(zhì)；類似地，使用水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了317 個(gè)多肽、164 個(gè)蛋白質(zhì)（對(duì)照）和592 個(gè)多肽、263 個(gè)蛋白質(zhì)接入組，所鑒定到的蛋白質(zhì)大多數(shù)被認(rèn)為是應(yīng)激相關(guān)蛋白，如熱休克蛋白70、三磷酸腺苷合酶、茜草小亞基等，這些蛋白質(zhì)參與各種生物途徑，如碳水化合物代謝、信號(hào)傳導(dǎo)途徑、脂質(zhì)代謝等.

2.2 高溫脅迫下蔬菜作物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

Huang W[17]等使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了不同溫度處理（4，25，38 ℃）下芹菜葉的蛋白質(zhì)，共鑒定出71 種蛋白質(zhì)，被分為14 個(gè)功能類，包括光合作用、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等.在高溫脅迫下，芹菜（Apiumgraveolens）葉中近一半蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá).鑒定的蛋白質(zhì)還參與許多代謝途徑，如光合作用、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物代謝和能量代謝，這些代謝途徑對(duì)非溫度響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)有重要影響；這些蛋白質(zhì)可能相互作用，在冷或熱脅迫下在芹菜葉片中建立溫度脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò).

Wang Y[18]等對(duì)2 種龍須菜（Gracilarialemaneiformis）株系981 和07-2 在3 個(gè)溫度（25，30，35℃）下培養(yǎng)48 h，對(duì)2 種株系在熱處理下的生理參數(shù)進(jìn)行分析.結(jié)果表明，隨著溫度的升高，2 種株系的比生長(zhǎng)速率和光化學(xué)效率均降低.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，株系981 中的藻膽蛋白和可溶性蛋白質(zhì)濃度在35 ℃下降低；株系07-2 中的藻膽蛋白和可溶性蛋白質(zhì)濃度表現(xiàn)出初始降低，然后在高溫處理（25，30，35 ℃）下恢復(fù).使用雙向電泳進(jìn)行2 種株系在35 ℃下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定了13 種蛋白質(zhì)，并將這些蛋白質(zhì)根據(jù)功能分為8 類，包括光合作用、能量代謝、蛋白質(zhì)折疊催化、轉(zhuǎn)錄、分子伴侶和未知功能.熱休克蛋白和親環(huán)蛋白樣蛋白通過(guò)雙向電泳鑒定為在35 ℃熱應(yīng)激下2 種株系中的熱響應(yīng)蛋白，并發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)型HSP70 蛋白在蛋白質(zhì)折疊中作為分子伴侶發(fā)揮關(guān)鍵作用，并有助于改善由熱脅迫引起的損傷，從而保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；HSP82蛋白可能在熱應(yīng)激下對(duì)龍須菜的保護(hù)起到支持作用，該研究認(rèn)為這種胞質(zhì)型熱休克蛋白在改善熱脅迫引起的損傷方面起到重要作用.

高溫脅迫直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、聚集和膜脂流動(dòng)性增加，但也間接導(dǎo)致葉綠體和線粒體中酶的失活，蛋白質(zhì)合成和降解的抑制以及膜完整性的損害[19-20].因此，更好地理解植物的耐熱機(jī)制對(duì)培育耐熱作物至關(guān)重要.為了抵消高溫脅迫的有害影響，植物通過(guò)改變基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和翻譯后修飾采用了多種脅迫耐受策略，這有助于在高溫下重建植物生存的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[19]3.文獻(xiàn)[21]對(duì)菠菜（Spinacia oleracea）同源自交系Sp75 進(jìn)行了高溫（37 ℃/32 ℃，光照/黑暗）處理，然后收集完全展開(kāi)的真葉，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫處理菠菜葉片，脯氨酸、可溶性糖、丙二醛和電解液相對(duì)泄漏含量均增加，表明高溫脅迫下菠菜葉片的膜完整性喪失.使用基于iTRAQ 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了菠菜葉中的熱應(yīng)激反應(yīng)蛋白豐度模式，共鑒定出葉中的2 205 種蛋白質(zhì)，其中911 個(gè)被定義為高溫脅迫響應(yīng)蛋白，這些蛋白質(zhì)在清除活性氧、脂質(zhì)信號(hào)、鈣信號(hào)傳遞、磷酸化級(jí)聯(lián)和14-3-3 介導(dǎo)的信號(hào)通路等途徑中發(fā)揮重要作用.每組中的大多數(shù)高溫脅迫反應(yīng)蛋白都增加了熱應(yīng)激，包括轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)加工和蛋白質(zhì)降解，這表明基因表達(dá)和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)在對(duì)高溫脅迫的反應(yīng)中得到增強(qiáng).雖然光合作用受到抑制，但不同的初級(jí)和次級(jí)代謝途徑被用于防御熱應(yīng)激，如糖酵解、戊糖磷酸途徑、氨基酸代謝、脂肪酸代謝、核苷酸代謝、維生素代謝和類異戊二烯生物合成，這些數(shù)據(jù)構(gòu)成了菠菜對(duì)熱應(yīng)激反應(yīng)的代謝圖譜，有助于進(jìn)一步研究植物熱適應(yīng)的復(fù)雜分子機(jī)制，并為菠菜分子育種計(jì)劃提供信息.

2.3 高溫脅迫模式下植物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

Rocco[22]等將擬南芥蓮座葉分別在黑暗中于冷脅迫（4 ℃）和高溫脅迫（42 ℃）處理后，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，2 種溫度處理下都改變了擬南芥蓮座葉細(xì)胞膜離子滲透性.共檢測(cè)到38 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，豐度隨冷或熱脅迫而變化，2 種溫度處理都影響25 個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平.分析表明，擬南芥短期低溫處理對(duì)植物光合作用的特定過(guò)程有顯著影響，導(dǎo)致了參與電子運(yùn)輸/能量產(chǎn)生和碳代謝反應(yīng)的蛋白質(zhì)的數(shù)量增加，或者至少是它們的特定同種型的數(shù)量增加.擬南芥幼苗的短期高溫脅迫處理也影響參與光合電子傳遞和碳代謝的葉蛋白豐度，表明高溫脅迫對(duì)糖酵解產(chǎn)生負(fù)面影響.

3 植物響應(yīng)高溫脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)存在的問(wèn)題

近年來(lái)，植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法并沒(méi)有受到很大的束縛，它為解釋植物繁殖發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵事件對(duì)外界環(huán)境因素響應(yīng)的分子機(jī)制提供了新的蛋白質(zhì)組學(xué)證據(jù).但是，與酵母和動(dòng)物蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)現(xiàn)相比，植物蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展相對(duì)緩慢，主要表現(xiàn)在4 個(gè)方面：

（1）受基因組背景和跨物種蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的限制，研究對(duì)象仍主要集中在苜蓿（Medicago Sativa）、菠菜[21]1-22、擬南芥[22]1257-1267、小麥[15-16，23]、大麥（Hordeum vulgare）[24]、水稻[6，8，25]、大豆（Glycine max）[26]等幾個(gè)有限的品種；

（2）更多的研究集中于環(huán)境脅迫下差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究較少；

（3）在基于2-DE 凝膠分析差異表達(dá)蛋白的表達(dá)豐度時(shí)，缺乏嚴(yán)謹(jǐn)多樣的統(tǒng)計(jì)分析，甚至基于2DE-MS技術(shù)的整體策略也缺乏標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理以及分析方案，使得比較不同研究小組報(bào)告的結(jié)果變得困難.

此外，我國(guó)植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究隊(duì)伍分散，技術(shù)平臺(tái)薄弱.與快速發(fā)展的人類蛋白質(zhì)組學(xué)相比，我國(guó)的植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對(duì)落后.植物蛋白質(zhì)組學(xué)未來(lái)的發(fā)展方向仍是精確定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和蛋白質(zhì)翻譯后修飾的深入研究.

4 植物在高溫脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)未來(lái)的發(fā)展方向

植物對(duì)高溫脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)的響應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)修飾和代謝調(diào)控等一系列細(xì)胞途徑.在未來(lái)的研究發(fā)展中，重點(diǎn)應(yīng)放在3 個(gè)方面：

（1）建立蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，全面觀察植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，深入研究信號(hào)調(diào)控.

（2）重點(diǎn)研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾.有證據(jù)表明，不同的翻譯后修飾對(duì)高溫脅迫響應(yīng)具有重要影響.

（3）從研究蛋白質(zhì)相互作用的總體策略出發(fā)，充分利用酵母單雜交、酵母雙雜交和其它新技術(shù)手段，為細(xì)胞的信號(hào)傳遞和蛋白質(zhì)相互作用提供更直接的證據(jù).

綜上所述，植物高溫脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)正處于發(fā)展階段，隨著科技創(chuàng)新和技術(shù)進(jìn)步，會(huì)有更多與植物響應(yīng)高溫脅迫相關(guān)的蛋白或基因被挖掘，對(duì)提高作物抗性，培育耐高溫新品種具有重要意義，為植物抗逆研究提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù).