納米卟啉金屬有機(jī)骨架對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用*

王亞潔， 袁 博,2， 劉 偉， 李玉皓， 苑曉勇△

(1. 天津市眼科醫(yī)院， 天津 300020； 2. 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 天津 300071； 3. 天津大學(xué)理學(xué)院， 天津 300072)

金屬有機(jī)骨架(metal-organic frameworks，MOFs)，是一種由金屬離子與有機(jī)配體形成的新型雜化多孔材料，兼具有無(wú)機(jī)材料和有機(jī)材料的特性[1]。納米級(jí)MOFs(nMOFs)，是納米技術(shù)與MOFs的結(jié)合，不僅應(yīng)用于催化、分離、儲(chǔ)能、傳感、光學(xué)等領(lǐng)域，而且在藥物遞送、生物成像和生物治療等方面的作用也日益受到重視[2]。nMOFs作為一種載藥體系，可以實(shí)現(xiàn)靶向分布，提高治療效果[3]。此外，由于nMOFs有很好的生物相容性、化學(xué)和熱穩(wěn)定性，其組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也可以自由調(diào)節(jié)，通過(guò)控制合成或合成后修飾等方法，nMOFs不僅能應(yīng)用于光動(dòng)力-化療，光熱-化療和免疫療法中[4,5]，同時(shí)還可以被磁共振成像(MRI)和正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)(PET)等醫(yī)學(xué)成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[6]。隨著越來(lái)越多的證據(jù)表明nMOFs在疾病的診斷和治療上具有良好的應(yīng)用前景[7]，明確nMOFs對(duì)有機(jī)體是否有診療外的作用成為目前亟需解決的問(wèn)題。

斑馬魚(yú)具有產(chǎn)卵量多、繁殖周期短、胚胎透明、發(fā)育快和階段特征明顯等優(yōu)勢(shì)，是研究神經(jīng)發(fā)育和藥物篩選的重要模式生物。此外，斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和發(fā)育過(guò)程與哺乳動(dòng)物高度相似[8]，適用于作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象以評(píng)估各類藥物對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響。

本研究以卟啉為主要原料合成納米卟啉金屬有機(jī)骨架(zirconium-porphyrin metal-organic framework，NPMOF)。經(jīng)NPMOF暴露后，斑馬魚(yú)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育情況、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)以及運(yùn)動(dòng)能力被用于評(píng)價(jià)其對(duì)脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用。本研究將為NPMOF在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供進(jìn)一步的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與NPMOF的制備

NPMOF經(jīng)過(guò)調(diào)整的溶劑熱法制備[9]。主要成分為：10 mg 四羧基苯卟啉(5,10,15,20-tetrakis(4-carboxyl)-21H,23H-porphine，TCPP；TCI化工發(fā)展有限公司中國(guó)部)，30 mg 四氯化鋯(zirconium chloride，ZrCl4；阿爾法-亞沙)，200 mg 苯甲酸(Benzoic acid，BA，98.5%；天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，100 mg十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB；福晨試劑有限公司)，200 mg 聚乙二醇 (polyethylene glycol M.W. 6000，PEG-6000；福晨試劑有限公司)和10 ml N,N-二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF；康科德試劑有限公司)。

NPMOF的形貌和微觀結(jié)構(gòu)通過(guò)透射電鏡(TEM，Tecnai G2 F20，加速電壓200 kV；FEI，Hillsboro，USA)測(cè)定。其光學(xué)特性由紫外分光光度計(jì)(UV-3900-visible spectrophotometer，UV-Vis；Shimadzu，Japan)和熒光光譜儀(FL-4600 Fluorescence Spectrometer；Hitachi，Japan)測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用斑馬魚(yú)為野生AB型和轉(zhuǎn)基因型Tg (mbp:nfsB-EGFP)。養(yǎng)殖條件為28.5℃，10/14 h亮/暗循環(huán)照明[10]。收集胚胎，孵化于E3培養(yǎng)液(60 mmol/L NaCl，0.67 mmol/L KCl，0.3 mmol/L NaHCO3，0.9 mmol/L CaCl2，pH 7.2)，以時(shí)齡(hpf)標(biāo)記發(fā)育階段。所有操作均符合南開(kāi)大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)規(guī)定。

1.3 水體暴露

收集6 hpf正常發(fā)育的胚胎，放置于六孔板中，每孔50枚卵，每組重復(fù)10孔。使其持續(xù)暴露在濃度為100 mg/L的 NPMOF-E3溶液中，該組為暴露組(實(shí)驗(yàn)組)。另取相同數(shù)目的胚胎孵化于E3溶液中作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和暴露組每12 h更換一次相應(yīng)的新鮮溶液。從6 hpf開(kāi)始，斑馬魚(yú)胚胎持續(xù)暴露于E3或NPMOF-E3溶液中，在28、48、72、96和120 hpf，每組分別取60條魚(yú)用于RT-PCR；在120 hpf，每組取20條魚(yú)用于整體胚胎原位雜交，150條用于免疫熒光染色，30條用于行為學(xué)測(cè)試。

1.4 熒光定量PCR

在28、48、72、96和120 hpf分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以β-actin為內(nèi)參，相關(guān)基因表達(dá)水平的計(jì)算采用2-△△Ct法。生物學(xué)重復(fù)三次。引物序列見(jiàn)表1。

Tab. 1 Primers of quantitative real-time polymerase chain reaction

1.5 整體原位雜交

為了消除色素的影響，以0.003% 1-phenyl-2-thiourea(PTU, Sigma)處理胚胎至120 hpf。斑馬魚(yú)幼魚(yú)用1×三卡因(tricaine methanesulfonate，0.1% MS-222；Sigma)麻醉，待安樂(lè)死后固定在4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)中。神經(jīng)元可被activatedleukocytecelladhesionmoleculea(alcama, GeneBank NM_131000) mRNA 探針特異性標(biāo)記，用于擴(kuò)增alcama的引物序列為forward 5′-TCGGTGCCTTCATAG-3′ 和reverse 5′-CCTTCTCAGTGGGATAG-3′，編碼alcama的cDNA用SacII線性化，用Sp6聚合酶合成。原位雜交方法如文獻(xiàn)[11]。alcama探針的濃度為2 ng/μl。每組處理二十個(gè)樣本。

1.6 免疫熒光染色

120 hpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)用0.1% MS-222麻醉后固定在4% PFA中，免疫熒光染色采用標(biāo)準(zhǔn)程序[12]。冰凍切片厚度為12 μm。其中一抗有3種，分別為Zn-12(稀釋濃度為1∶200；Zebrafish International Resource Center，ZIRC；USA)、Zrf-1(1∶200；ZIRC)和EGFP(1∶500；ab6556，Abcam)。熒光二抗為Cy3(1∶500；Millipore)和Alexa Fluor 488 (1∶1 000；ab150077，Abcam)。細(xì)胞核以DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole，1∶1 000；Sigma)襯染。

1.7 行為學(xué)測(cè)試

行為學(xué)測(cè)試通過(guò)斑馬魚(yú)行為軌跡跟蹤系統(tǒng)(DVOL-0040，Noldus Information Technology，The Netherlands)同時(shí)對(duì)120 hpf對(duì)照組和100 mg/L NPMOF暴露組的幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估。幼魚(yú)收集后放置于24孔板中，每孔放1條魚(yú)，8魚(yú)每組。靜止15 min，待斑馬魚(yú)對(duì)新環(huán)境完全適應(yīng)后持續(xù)監(jiān)測(cè)20 min。Ethovision XT軟件(Noldus Information Technology)用于導(dǎo)出熱圖以及運(yùn)動(dòng)軌跡分析，其中包含9個(gè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)：總運(yùn)動(dòng)距離、總運(yùn)動(dòng)時(shí)間、總靜止時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(速度<7.5 mm/s)、中速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(≥7.5 mm/s，≤15 mm/s)、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(>15 mm/s)、運(yùn)動(dòng)速度、角速度和加速度。上述運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)被重復(fù)3次。

1.8 圖像采集與分析

免疫熒光染色的圖像由FV 1000共聚焦顯微鏡采集(Olympus，Japan)，原位雜交的圖像由SXZ10體式顯微鏡(Olympus)采集。Image J軟件(1.49X，NIH，http://rsb.info.nih.gov/ij/)用于將熒光圖轉(zhuǎn)化為8-bit的灰度圖像，設(shè)定閾值，得出每組中Zn-12，Zrf-1和EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞的面積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NPMOF的光學(xué)與物理性質(zhì)

TEM結(jié)果顯示制備出的NPMOF的形貌為長(zhǎng)徑335 nm和短徑90 nm的紡錘體(圖1A)。高分辨率透射電子顯微鏡(HR-TEM)顯示其表面是無(wú)定形的(圖1B)。NPMOF的光學(xué)特性由紫外吸收光譜法和穩(wěn)態(tài)熒光法測(cè)定。圖1C顯示，NPMOF的紫外吸收具有卟啉的獨(dú)特類型，S帶在414.5 nm處有一個(gè)強(qiáng)吸收峰，Q帶在500 nm到700 nm之間有四個(gè)較弱的吸收峰。在三維熒光圖像(圖1D)中，縱然激發(fā)波長(zhǎng)各異，但熒光發(fā)射范圍大都聚集在660 nm附近，這表明NPMOF與其主要成分卟啉具有相同的能級(jí)躍遷特性，經(jīng)一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后可發(fā)射出紅色熒光。

Fig. 1 Physical and chemical characterizations of NPMOF

2.2 NPMOF暴露后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與腦中神經(jīng)元的發(fā)育

為了評(píng)價(jià)NPMOF暴露后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的改變，在28 hpf，6個(gè)調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的基因(msi1、ngn1、neurod1、atoh7、brn3b和sox10)的表達(dá)被驗(yàn)證(表2)。相比于對(duì)照組，NPMOF暴露組中除了neurod1，其他5個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平都有明顯的提高(P<0.05，表2)。

Tab. 2 The mRNA expression levels of neurodevelopment-related genes at 28 n=3)

本研究選用神經(jīng)元相關(guān)基因(alcama、reln和map2)的表達(dá)作為評(píng)價(jià)神經(jīng)元發(fā)育情況的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)組中，在48 hpf，alcama的表達(dá)開(kāi)始顯著上調(diào)，而reln和map2表達(dá)的上調(diào)則分別始于72 hpf和96 hpf(P<0.05，表3)。alcamamRNA探針和Zn-12抗體可以特異性識(shí)別位于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和位于腦中的神經(jīng)元。原位雜交和染色結(jié)果顯示，在120 hpf，NPMOF暴露組和非暴露組都在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer，GCL)檢測(cè)到了alcama的表達(dá)(圖2A，箭頭)，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞與腦中的神經(jīng)元分化成熟(圖2A)。分別對(duì)視網(wǎng)膜和腦中Zn-12陽(yáng)性細(xì)胞的面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，NPMOF暴露組和非暴露組的結(jié)果并未顯示出差異(P>0.05，圖2B)。以上結(jié)果表明，NPMOF的暴露對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的促進(jìn)作用不明顯。

Fig. 2 Neurodevelopment and neuron development following NPMOF exposure

2.3 NPMOF暴露后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育

經(jīng)NPMOF暴露后，gfap的表達(dá)從72 hpf至120 hpf出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，而s100b則在48 hpf到120 hpf上調(diào)顯著(P<0.05，表3)。在120 hpf，可特異性識(shí)別星形膠質(zhì)細(xì)胞和müller細(xì)胞的Zrf-1抗體被用于檢測(cè)此類膠質(zhì)細(xì)胞的分布和形態(tài)改變，Zrf-1陽(yáng)性細(xì)胞大量分布于斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜、前腦與后腦中，細(xì)胞的分布和形態(tài)在NPMOF暴露組和非暴露組中并未有明顯不同(圖3A)。然而，在Zrf-1陽(yáng)性細(xì)胞面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，NPMOF暴露組視網(wǎng)膜中的müller細(xì)胞和前腦中的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多(P<0.05，圖3B)，后腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞的面積在兩組中未顯示出差異(P>0.05，圖3B)。

Mbp和Olig2特異性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中。本研究不僅對(duì)mbp和olig2的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，還利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg (mbp:nfsB-EGFP)和EGFP抗體指示少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。相比于對(duì)照組，暴露組的mbp在48、96和120 hpf表達(dá)明顯上調(diào)，olig2的表達(dá)則在受精后72到120 h有明顯上調(diào)(P<0.05，表3)。NPMOF暴露組和對(duì)照組中，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞(少突膠質(zhì)細(xì)胞)主要分布在腦和脊髓中(圖3C，箭頭)。不論在腦還是脊髓中，髓鞘圍繞軸突成同心圓狀(圖3C，箭頭)。為了對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行量化，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的面積同樣被計(jì)數(shù)分析，然而兩組對(duì)比并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P>0.05，圖3D)。以上結(jié)果表明，NPMOF暴露可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，特別是müller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。

Tab. 3 The mRNA expression levels of neuron-related and neuroglia-related n=3)

Fig. 3 Neuroglia cell development following NPMOF exposure

2.4 NPMOF暴露后斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)能力的改變

為了進(jìn)一步明確NPMOF暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用是否會(huì)體現(xiàn)在功能上，我們對(duì)120 hpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)進(jìn)行了行為學(xué)測(cè)試。圖4A為運(yùn)動(dòng)的軌跡圖和熱圖。應(yīng)用行為學(xué)分析軟件Ethovision XT，對(duì)軌跡圖中的9項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別為：總運(yùn)動(dòng)距離、總運(yùn)動(dòng)時(shí)間、總靜止時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(速度<7.5 mm/s)、中速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(≥7.5 mm/s，≤15 mm/s)、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(>15 mm/s)、運(yùn)動(dòng)速度、角速度和加速度。與對(duì)照組相比，100 mg/L NPMOF暴露組的斑馬魚(yú)總運(yùn)動(dòng)距離更長(zhǎng)、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間更久以及運(yùn)動(dòng)速度更快，而且總靜止時(shí)間較少(P<0.05，圖4B)。然而，兩組在總運(yùn)動(dòng)時(shí)間、慢速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、角速度和加速度上無(wú)顯著差異(P> 0.05，圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)NPMOF暴露后，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)能力有所提高。

Fig. 4 Locomotor behavior following NPMOF exposure

3 討論

神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)不可或缺的組成部分[13]。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)和功能單位，在神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)中起著重要作用，而星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞不僅可以對(duì)神經(jīng)元起到支持、保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)等作用，還對(duì)腦的生理和病理過(guò)程有重要影響[14]。這些神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一旦損傷或功能障礙將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，比如運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病和癲癇等[15]。近年來(lái)，大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明NPMOF在生物醫(yī)學(xué)的診斷與治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。然而, NPMOF的持續(xù)暴露是否會(huì)改變神經(jīng)組織的發(fā)育仍舊未知?；诖?，本研究著重探討了NPMOF對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用，并發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的NPMOF暴露可以促進(jìn)斑馬魚(yú)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育并改善斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)能力。

在本研究中，斑馬魚(yú)幼魚(yú)經(jīng)100 mg/L NPMOF暴露后，神經(jīng)元與少突膠質(zhì)細(xì)胞顯示出相似的生物學(xué)行為：發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)都有所上調(diào)，而在細(xì)胞分布、形態(tài)以及指征發(fā)育成熟的蛋白(Zn-12和Mbp)的表達(dá)上卻未見(jiàn)明顯差異。不同的是，與對(duì)照組相比，NPMOF實(shí)驗(yàn)組中不僅星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，而且在視網(wǎng)膜和前腦中有更多的Zrf-1陽(yáng)性細(xì)胞。造成這種結(jié)果的原因可能是NPMOF的主要組成部分為卟啉。卟啉作為血紅蛋白和細(xì)胞色素的主要成分之一，參與到許多的生命過(guò)程中，例如紅細(xì)胞生成和氧的運(yùn)輸[16]。NPMOF對(duì)神經(jīng)發(fā)育的積極作用或可歸因于卟啉能夠促進(jìn)血紅蛋白的合成、保障供氧而起到營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞的提前分化可以誘導(dǎo)神經(jīng)元的遷移[17]。在實(shí)驗(yàn)組中，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的改變或許會(huì)隨著NPMOF暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)，這需要進(jìn)一步的研究。

運(yùn)動(dòng)能力是評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)神經(jīng)發(fā)育的功能指標(biāo)。NPMOF暴露組中的斑馬魚(yú)在總運(yùn)動(dòng)距離、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和速度上有所提高，而且靜止時(shí)間減少，表明實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為比對(duì)照組更為活躍，運(yùn)動(dòng)能力更強(qiáng)，這和形態(tài)學(xué)的結(jié)果一致，兩者共同說(shuō)明了NPMOF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的促進(jìn)作用。對(duì)神經(jīng)元的促進(jìn)作用有利于神經(jīng)肌肉間的傳導(dǎo)，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的促進(jìn)作用則可進(jìn)一步保證內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和沖動(dòng)傳導(dǎo)的有效進(jìn)行[18]。