李 剛， 籍胤璽， 高 毅， 馮彥冰

(南陽市中心醫(yī)院骨科， 河南 南陽 473000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 是骨科疾病的一種，隨著年齡的增長，患病人數(shù)不斷增加，該病在中老年人群中出現(xiàn)概率較大[1]。骨關(guān)節(jié)炎主要因局部灶軟骨的退行性變使軟骨及關(guān)節(jié)周圍肌肉損害而引起的進展性關(guān)節(jié)疾病[2-3]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理是：關(guān)節(jié)內(nèi)部的軟骨組織出現(xiàn)病變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部結(jié)構(gòu)性破壞及病變[4]，前期表現(xiàn)不是十分明顯，主要癥狀為關(guān)節(jié)內(nèi)部病變、持續(xù)鈍痛等。骨關(guān)節(jié)炎主要在人的手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等部位發(fā)病，主要表現(xiàn)為行動不便、腫脹等[5-6]。發(fā)病原因有多種因素，其中包括年齡、性別等。隨著病情的發(fā)展，逐漸會出現(xiàn)病變關(guān)節(jié)的夜間休息痛，半月板損傷等，由于疼痛，關(guān)節(jié)的正?；顒訒艿较拗芠7]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)等炎性因子主要由T 細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，主要來源于患病機體中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展[8]。帕瑞昔布是一種環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)特異性抑制劑，屬于抗關(guān)節(jié)炎藥中的昔布類鎮(zhèn)痛藥。本文探討帕瑞昔布對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞的影響及TNF-α/NF-κB在其中的作用，為臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

在廣東省醫(yī)學(xué)SD大鼠中心購買15只雄性SD大鼠，體重231～289 g，鼠齡接近。

1.2 模型制備與分組

將所選取的大鼠隨機分組，第一組，模型組(MO組)：該組大鼠制作骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型；第二組，假手術(shù)組(SS組)：該組大鼠在骨關(guān)節(jié)做切口后不做任何處理；第三組，治療組(TR組)：該組大鼠制作骨關(guān)節(jié)炎模型后給予帕瑞昔布進行治療，每組5只。

分別給予MO組、TR組大鼠骨關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶溶液，劑量為0.15 ml，濃度為4%，3天一次，連續(xù)3次，制備骨關(guān)節(jié)炎模型。同時，給予SS組大鼠0.15 ml生理鹽水。造模成功依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)確定[9]，7 d后，給予TR組大鼠40 mg帕瑞昔布與生理鹽水的混合液進行治療，每兩周1次，通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的方式，MO組、SS組大鼠給予等體積的生理鹽水，持續(xù)治療1個月。在此期間，所有大鼠在相同環(huán)境下生活。實驗完成后，將三組大鼠分別殺死并選取關(guān)節(jié)軟骨組織，檢測病變程度，再常規(guī)制成軟骨細(xì)胞并進行保存，用于后續(xù)實驗。

1.3 儀器與試劑

CCK-8試劑盒購自美侖生物公司(大連)；全自動生化儀購自格利特科技公司(濟南)。

1.4 cck-8法對大鼠軟骨細(xì)胞增殖數(shù)量進行檢測

取出軟骨細(xì)胞，稀釋為1×105cells/ml，培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)好的軟骨細(xì)胞平鋪到16孔板中，并培養(yǎng)。培養(yǎng)到一定數(shù)量后，加入CCK-8 10 μl。常溫放置30 min，利用讀板器檢測450 nm光密度值(OD值)。

1.5 HE染色法檢測大鼠軟骨組織病變程度

取三組大鼠軟骨組織,固定15 min, 石蠟包埋, 5 μm切片,用山羊血清進行封閉處理,蘇木精染色液復(fù)染分別為6～8 min, 觀察軟骨組織形態(tài)。

1.6 軟骨病變程度判定標(biāo)準(zhǔn)

采用OARSI評分[10]對大鼠軟骨病變程度進行判定。0分：軟骨表面光滑無明顯炎癥，0～2分：可見明顯水腫或纖維變性，表面出現(xiàn)磨損情況，2～4分：軟骨淺層區(qū)域脫層，出現(xiàn)潰瘍，4～6：關(guān)節(jié)表面外形變性，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成。

1.7 Western blot法檢測大鼠軟骨細(xì)胞中TNF-α/NF-κB的蛋白表達量

取軟骨細(xì)胞50 μg，洗凈烘干電泳槽及其它部件，制備12%分離膠，制作1 cm的水層。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。90 V電泳，溴酚藍倒入分離膠，取出凝膠，放入PVDF膜5～10 s。加進轉(zhuǎn)膜液，冰浴。4℃過夜(雜交液稀釋一抗，GAPDH: 1∶1 000)。清洗3次，把膜放入對應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h，輕輕晃動。加入ECL A和B混合液約1 min，PVDF膜檢測采用自動化學(xué)發(fā)光成像分析。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠軟骨細(xì)胞中TNF-α/NF-κB mRNA的表達量

在大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，4℃ 1 200 r/min離心，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存?？俁NA提取反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照說明書進行實驗，內(nèi)參采用GAPDH，60°C，10 min、95℃、72°C，各 30 s 、95℃，5 min，循環(huán)次數(shù)以40為準(zhǔn)，實驗次數(shù)至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算TNF-α/NF-κB表達(表1)。

Tab. 1 Primer sequences

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 帕瑞昔布對大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果表明，MO組和TR組軟骨細(xì)胞增殖OD值分別為0.36±0.12和0.67±0.34，顯著低于SS組OD值1.12±0.45(P<0.05)，但TR組的OD值卻顯著高于MO組(P<0.05)。

2.2 帕瑞昔布對大鼠軟骨組織病變程度的影響

結(jié)果表明，SS組大鼠軟骨組織表面光滑，MO組大鼠軟骨組織體積縮小，表層結(jié)構(gòu)細(xì)胞明顯減少；TR組大鼠軟骨組織結(jié)構(gòu)基本完整(圖1)。

Fig. 1 Degree of chondrocyte lesions (Hematoxylin staining× 400)

2.3 帕瑞昔布對大鼠軟骨細(xì)胞OARSI評分的影響

結(jié)果表明，在7 d時，模型制備成功。TR組、MO組大鼠OARSI評分相近，但隨著時間的延長，于18 d和30 d時，TR組的OARSI評分顯著低于MO組(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of OARSI scores of chondrocytes in three groups of

2.4 帕瑞昔布對大鼠軟骨細(xì)胞中TNF-α/NF-κB的蛋白的影響

結(jié)果表明，MO組和TR組TNF-α和NF-κB的蛋白表達水平均顯著高于SS組(P<0.05)，但TR組TNF-α和NF-κB的蛋白表達水平卻顯著低于MO組(P<0.05，圖2，表3)

Fig. 2 The contents of TNF-α / NF-κB protein in rat chondrocytes

Tab. 3 The contents of TNF-α / NF-κB protein in rat n=5)

2.5 帕瑞昔布對大鼠軟骨細(xì)胞中TNF-α/NF-κB mRNA的表達量的影響

結(jié)果表明，MO組和TR組TNF-α和NF-κB mRNA表達水平顯著高于SS組(P<0.05)，但TR組TNF-α和NF-κB mRNA表達水平卻顯著低于MO組(P<0.05，表4)。

Tab. 4 The expression levels of TNF-α / NF-κB mRNA in chondrocytes of three groups of n=5)

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種比較常見的關(guān)節(jié)性病變，在年輕時，普通人的骨關(guān)節(jié)就有可能有炎癥，但多數(shù)無明顯癥狀。骨關(guān)節(jié)炎在人的手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱中膝關(guān)節(jié)最易發(fā)生退變，因此膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病也最廣泛[11]。隨著病情的發(fā)展，逐漸會出現(xiàn)病變關(guān)節(jié)的夜間休息痛，關(guān)節(jié)間隙變窄等，最終患者出現(xiàn)肢體障礙、最終影響正常生活[12]。隨著社會的不斷發(fā)展，膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也在迅速增加，膝關(guān)節(jié)炎是一種比較常見的關(guān)節(jié)性病變，很多人在青年時期就患有該病，但多數(shù)無明顯癥狀。一旦發(fā)展嚴(yán)重則會嚴(yán)重影響患者的正常生活，因此，找到有效的治療方案為醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注重點[13]。

本研究結(jié)果表明，SS組、TR組細(xì)胞增殖OD值比MO組高，TR組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖情況比SS組相比明顯減少。隨著時間的增加，TR組大鼠骨關(guān)節(jié)炎情況逐漸好轉(zhuǎn)，而未服用藥物的MO組大鼠病情逐漸惡化。這說明帕瑞昔布作用于機體后，消除軟骨部位的炎性因子，促進軟骨細(xì)胞生長。改善軟骨病變程度，進而達到治療的目的。

灰度顯示，MO組TNF-α/NF-κB蛋白表達水平顯著上升，TR組蛋白表達水平明顯比SS組高。MO組信號通路mRNA表達量最高，SS組最低，TR組mRNA表達量明顯比SS組高。研究結(jié)果顯示，帕瑞昔布在骨關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)顯著，能夠明顯降低TNF-α/NF-κB信號通路的表達水平，抑制其凋亡[14]。動物實驗研究檢測到骨關(guān)節(jié)炎大鼠存在高濃度的TNF-α mRNA表達，在正常細(xì)胞中檢測出TNF-α mRNA呈低表達。因此，可以得出TNF-α在軟骨退變和骨關(guān)節(jié)炎癥中起重要作用[15]。研究證實，TNF-α是骨關(guān)節(jié)炎疾病進程中重要的炎癥遞質(zhì)，可促進軟骨細(xì)胞產(chǎn)生過氧化反應(yīng)[16]。有研究表明，TNF-α/NF-κB信號通路參與機體內(nèi)多種細(xì)胞的增殖、凋亡過程，在健康生物體內(nèi)TNF-α/NF-κB信號通路呈現(xiàn)低表達，在患病生物體內(nèi)TNF-α/NF-κB信號通路呈現(xiàn)高表達，表明其高表達能明顯促進細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞壽命，因此，TNF-α/NF-κB信號通路的表達水平對細(xì)胞的生長、凋亡具有重要作用[17]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布作用于模型大鼠時，大鼠體內(nèi)TNF-α/NF-κB的表達水平隨之下降。據(jù)報道，帕瑞昔布用藥時間與TNF-α/NF-κB的表達水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即帕瑞昔布用藥時間越長，TNF-α/NF-κB的表達水平越低[18]。帕瑞昔布與TNF-α/NF-κB信號通路的關(guān)系為骨關(guān)節(jié)炎的診斷和治療提供新的研究思路[19-20]。本研究與上述研究結(jié)論相近，有關(guān)帕瑞昔布能改善骨關(guān)節(jié)炎疾病的機制可能與帕瑞昔布抑制TNF-α/NF-κB信號通路的表達來達有關(guān)。但由于此次本實驗僅使用5只大鼠，樣本量較少，實驗結(jié)果可能存在一定誤差，因此，本次實驗結(jié)果僅為初步結(jié)果，尚有待增加樣本量進行進一步研究。

綜上所述：帕瑞昔布可能通過抑制TNF-α/NF-κB信號通路的表達對骨關(guān)節(jié)炎大鼠起到治療作用。