喬勤勤 文 芳 鄭 楠 王加啟 程建波 薛秀恒

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，合肥 230036； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點試驗室/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估試驗室(北京)，北京 100193； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，合肥 230036)

在奶牛養(yǎng)殖過程中使用獸藥可預(yù)防和治療奶牛疾病，提高養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)率[1-3]。然而，獸藥使用不當(dāng)或休藥時間不足可能會導(dǎo)致牛奶中出現(xiàn)獸藥殘留，危害消費(fèi)者健康，如引起過敏反應(yīng)、導(dǎo)致耐藥性增強(qiáng)和致癌等[4-8]。一般獸藥在熱處理下具有高穩(wěn)定性，獸藥殘留很容易從生鮮乳中轉(zhuǎn)移到超高溫滅菌乳(UHT乳)和巴氏殺菌乳中[9-11]。因此，歐盟(The European Union)、食品法典委員會(The Codex Alimentarius Commission)和我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部分別對牛奶中獸藥的最大殘留限量(Maximum residue limits)作出了明確的規(guī)定[12-14]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部235公告中明確規(guī)定牛奶中氟喹諾酮(Quinolones)、四環(huán)素(Tetracyclines)、鏈霉素(Streptomycin)和林可霉素(Lincomycin)的最高殘留限量分別為100、100、200和150 μg/kg[14]。

以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)為基礎(chǔ)的可視化微陣列檢測技術(shù)作為一種快速、高特異性的分析牛奶中獸藥殘留方法，與傳統(tǒng)檢測方法如液相色譜法(LC)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)和ELISA等相比較，具有操作簡便、特異性強(qiáng)、檢測速度快、檢測通量大，可同時檢測牛奶中多種殘留物等優(yōu)點[15-18]。該檢測技術(shù)已成功應(yīng)用于檢測多種目標(biāo)物分析中，如抗生素殘留、硝基呋喃代謝物和乳鐵蛋白等[19-21]。

目前，對我國市場上牛奶中四環(huán)素和喹諾酮的殘留進(jìn)行風(fēng)險評估的報道較少[22-23]，缺乏對于牛奶中鏈霉素和林可霉素的殘留分析的相關(guān)研究。因此，本研究擬以從我國25 個省(市)中采集的150 份UHT滅菌乳樣品和50 份巴氏殺菌乳樣品為研究對象，采用ELISA可視化微陣列芯片檢測試劑盒檢測我國奶牛養(yǎng)殖過程中常用的氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素類等4 種獸藥殘留并進(jìn)行分析，以檢測我國市場上UHT滅菌乳樣品和巴氏殺菌乳樣品中獸藥殘留并分析風(fēng)險水平。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3—9月，本課題組分別從我國北京、天津、河北、上海、山東、山西、陜西、湖北、河南、江蘇、江西、浙江、安徽、四川、重慶、甘肅、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏、新疆、福建、廣東、廣西和云南等25 個省(市)的超市共收集了150 份UHT滅菌乳樣品和50 份巴氏殺菌乳樣品。在分析之前，將UHT滅菌乳樣品在室溫下儲存，巴氏殺菌乳樣品在4 ℃下儲存。所有分析均在樣品保質(zhì)期到期之前完成。

1.2 試劑及儀器

芯片掃描儀(MRS-4800QA，上海中晶科技有限公司，中國)，氮吹濃縮儀(N1-Automatic Nitrogen Concentrator，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司，中國)，渦旋振蕩器(Vortex- Genie 2，Scientific Industries，美國)，恒溫震蕩孵育器(MTS-2，南京祥中生物科技有限公司，中國)，ELISA可視化微陣列芯片檢測試劑盒(南京祥中生物科技有限公司，中國)。

氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素混合標(biāo)準(zhǔn)液、抗體工作液、二抗工作液、顯色液A、顯色液B、終止液、10×濃縮復(fù)溶液、20×濃縮洗滌液、10×濃縮標(biāo)準(zhǔn)液，均購自南京祥中生物科技有限公司。乙酸乙酯(分析純)和正己烷(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1)配制洗滌工作液：去離子水20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進(jìn)行稀釋用于芯片板的洗滌，于 4 ℃ 儲存。

2)配制復(fù)溶工作液：去離子水10×濃縮復(fù)溶液按1∶9體積比進(jìn)行稀釋用于芯片板的洗滌，于4 ℃儲存。

3)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液：復(fù)溶工作液按照1∶9的體積比例稀釋10×濃縮標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

分析成像結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，異常出現(xiàn)在兩個球體中央靠近左側(cè)質(zhì)量比較小的球體，這就說明該成像技術(shù)在比較淺的地層中異常越明顯，和單個球體成像結(jié)果相同。但這種模型對小質(zhì)量異常體表現(xiàn)得更加明顯，總而言之，這樣的成像技術(shù)適合淺源礦體勘探。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品前處理

移取1.00±0.05 mL牛奶樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，2 500 r/m轉(zhuǎn)速下渦旋振蕩，5 000 r/m轉(zhuǎn)速下離心10 min。離心后，移取3 mL乙酸乙酯至10 mL干凈干燥的玻璃試管中，于50 ℃下用氮吹儀吹干。加入1 mL正己烷，用振蕩儀(2 000 r/m)振蕩1 min。再加入500 μL復(fù)溶工作液，用振蕩儀(2 000 r/m)振蕩3 min。移入2 mL聚苯乙烯于離心管中，在 5 000 r/m 轉(zhuǎn)速條件下離心10 min。去除上層有機(jī)相，取下層水相25 μL用于分析。

1.3.2檢測牛奶中四種獸藥殘留

采用ELISA可視化微陣列芯片試劑盒同時檢測牛奶中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素殘留。本試驗檢測方法按照試劑盒的說明書進(jìn)行。方法概要如下：

1)使用前，將試劑盒置于室溫(20～25 ℃)下平衡30 min以上，搖勻所有液體試劑并避光儲存。

2)在微孔支架中插入足夠數(shù)量的芯片微孔條，以容納所有標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品。并按照對應(yīng)微孔按序編號，每個標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品均做雙孔平行。

3)加樣：依次加入25 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和 25 μL 抗體工作液到各自的微孔中，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，25 ℃ 600 r/m 振蕩反應(yīng)30 min。

4)洗板：將液體從孔中倒出，然后將微孔支架上下顛倒3 次，放在吸水紙上以完全除去液體。用250～300 μL洗滌緩沖液填充所有微孔，并如上步驟中所述倒出液體，重復(fù)洗滌3 次。

5)向每個孔中加入50 μL二抗溶液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻，37 ℃ 600 r/m振蕩速度下反應(yīng)30 min。取出并重復(fù)洗板操作。

6)顯色：將顯色液A和顯色液B以1∶1混合均勻。每孔加入混合液50 μL，37 ℃ 600r/m避光孵育12 min。重復(fù)洗板操作。

7)測定：對于比色成像和信號采集，使用微陣列定制的芯片掃描儀(灰度從0到65,535任意單位，分辨率為3 200 dpi)掃描和分析96 孔板，同時進(jìn)行成像和數(shù)據(jù)采集，檢測結(jié)果報告將自動生成。

本試驗所采用的試劑盒對牛奶中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素殘留的檢測限(Limit of detection，LOD)分別為5.00、10.00、10.00和10.00 μg/L，低于檢測限則判定為未檢出。本試驗首先對試劑盒的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行驗證分析，以確保試驗的準(zhǔn)確性。試驗中4 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度見表1，試劑盒相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 四種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度Table 1 Standard concentrations of four different veterinary drugs μg/L

1.3.3試劑盒相關(guān)參數(shù)驗證試驗

氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1 000 μg/L，向1 mL牛奶樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為20 μL，牛奶樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素加標(biāo)濃度為20 μg/L。隨機(jī)選取24份牛奶樣品，每份樣品進(jìn)行2次平行試驗。

1.4 統(tǒng)計方法

每份牛奶樣品進(jìn)行2個平行測定，平均值用于計算獸藥的殘留水平。使用MiELISA軟件(MiELISA v 1.11，南京祥中生物科技有限公司)自動進(jìn)行圖像分析和定量分析。

表2 試劑盒相關(guān)參數(shù)Table 2 Related parameters of experiment kit used

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒的相關(guān)參數(shù)驗證

驗證試劑盒的相關(guān)參數(shù)的結(jié)果表明：氟喹諾酮測定濃度17.02～23.41 μg/L，回收率85%～117%；四環(huán)素測定濃度17.00～23.61 μg/L，回收率85%～118%；鏈霉素測定濃度16.34～25.5 μg/L，回收率82%～128%；林可霉素測定濃度17.44～21.88 μg/L，回收率87%～109%。進(jìn)一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(表3)：牛奶樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素測定濃度平均值分別為19.11、20.15、21.22和18.82 μg/L，回收率平均值分別為95.53%、94.94%、106.8%和94.11%。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27404—2008)[24]，這些數(shù)值都符合ELISA方法中限定的回收值范圍，說明該試劑盒測定結(jié)果可信。

表3 四種獸藥殘留的檢測結(jié)果(n=24)Table 3 Test results of four types of veterinary drug residues (n=24)

2.2 我國市場上UHT滅菌乳和巴氏殺菌乳中四種獸藥殘留

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的《全國奶業(yè)發(fā)展規(guī)劃》將奶業(yè)產(chǎn)區(qū)劃分為東北內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)(黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古)、華北產(chǎn)區(qū)(河北、河南、山東和山西)、西部產(chǎn)區(qū)(陜西、甘肅、青海、寧夏、新疆和西藏)、南方產(chǎn)區(qū)(湖北、湖南、江蘇、浙江、福建、安徽、江西、廣東、廣西、海南、云南、貴州和四川)和大城市周邊產(chǎn)區(qū)(北京、天津、上海和重慶)等5個區(qū)域[25]。根據(jù)奶業(yè)產(chǎn)區(qū)劃分特點，對從我國市場上收集的150 份UHT滅菌乳和50 份巴氏殺菌乳樣品進(jìn)行獸藥殘留分析。

獸藥殘留分析表明：收集的150 份UHT滅菌乳樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的檢出率分別為0%、0%、3.3%和0%，其中鏈霉素檢出值為12.49 μg/L；我國生產(chǎn)的100 份UHT滅菌乳樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的檢出率分別為0%、0%、2.0%和0%，其中鏈霉素檢出值為12.49 μg/L，檢出鏈霉素的牛奶樣品均來源于南方產(chǎn)區(qū)(2 份)；進(jìn)口的50 份UHT滅菌乳樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的檢出率分別為0%、0%、6.0%和0%，其中鏈霉素檢出值為12.09 μg/L，檢出鏈霉素的牛奶樣品分別來源于德國、法國和澳大利亞(表4)。收集的50份巴氏殺菌乳樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的檢出率分別為0%、0%、8.0%和2.0%，其中鏈霉素和林可霉素檢出值分別為21.16和16.48 μg/L；獸藥檢出樣品均來自國產(chǎn)巴氏殺菌奶，其中檢出鏈霉素的牛奶樣品分別來源于華北產(chǎn)區(qū)(2 份)、西部產(chǎn)區(qū)(1 份)和南方產(chǎn)區(qū)(1 份)，檢出林可霉素的牛奶樣品來源于南方產(chǎn)區(qū)(1 份)；進(jìn)口巴氏殺菌奶中未檢出獸藥殘留(表5)。

3 討 論

本試驗牛奶樣品中，氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素的檢出率分別為0%、0%、4.5%和0.5%，其中：鏈霉素殘留在華北產(chǎn)區(qū)、西部產(chǎn)區(qū)和南方產(chǎn)區(qū)檢出率分別為8.0%、3.2%和6.0%；林可霉素殘留在南方產(chǎn)區(qū)檢出率為2%，其他產(chǎn)區(qū)檢出率均為0%；檢測氟喹諾酮和四環(huán)素殘留量最高濃度均低于檢測限，檢測樣品均來源于UHT滅菌乳樣品；鏈霉素殘留量最高濃度為21.16 μg/L，林可霉素殘留量為16.48 μg/L，均來源于巴氏殺菌乳樣品。4 種獸藥殘留量最高濃度均低于歐盟、食品法典委員會和我國標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的最大殘留限量。已有研究相繼報道了我國市場上牛奶樣品中氟喹諾酮和四環(huán)素殘留的情況：崔海輝[26]從浙江省內(nèi)收集的140 份巴氏殺菌乳樣品中四環(huán)檢出率為2.8%；張養(yǎng)東等[22]2010年9月從我國市場上收集的94 份UHT滅菌乳樣品和26份巴氏殺菌乳樣品，UHT滅菌乳樣品中氟喹諾酮和四環(huán)素檢出率為95.7%和0%，巴氏殺菌滅菌乳樣品中氟喹諾酮和四環(huán)素檢出率為61.5%和7.7%，所有液態(tài)奶樣品中氟喹諾酮和四環(huán)素殘留量最高濃度為20.49和47.7 μg/L；Han等[23]2011年6月從我國市場上收集的180份UHT滅菌乳樣品中氟喹諾酮和四環(huán)素的檢出率為100%和0%，其中氟喹諾酮和四環(huán)素殘留量最高濃度為58.8 μg/L和<1.5。上述結(jié)果表明，液態(tài)奶中獸藥殘留量檢出率因檢測方法和檢測限不同而存在差異，但仍可明顯看出氟喹諾酮和四環(huán)素殘留在液態(tài)奶中經(jīng)常被檢出。我國市場上也發(fā)現(xiàn)牛奶中一些其他獸藥殘留物，例如磺胺類和磺胺二甲嘧啶[12-13]。因此，有必要嚴(yán)格實施有效的監(jiān)管措施，從生產(chǎn)源頭上控制原料奶中獸藥殘留，嚴(yán)格執(zhí)行牛奶質(zhì)量安全監(jiān)測體系，堅決貫徹落實食品安全有關(guān)部門的決策部署，從根本上保障牛奶的質(zhì)量安全[27-28]。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)2016下半年和2017年上半年我國市場上UHT滅菌乳和巴氏殺菌乳樣品中氟喹諾酮、四環(huán)素、鏈霉素和林可霉素殘留情況污染的發(fā)生率較低，且均未超過歐盟、食品法典委員會和我國標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的最大殘留限量。但是，由于牛奶中某些獸藥殘留仍有檢出，需要嚴(yán)格執(zhí)行有效的監(jiān)管和控制措施，殘留物控制在安全水平以內(nèi)，確保牛奶產(chǎn)品安全。