吉米斯 敖日格樂* 王純潔 斯木吉德 高瑞娟 阿日查 超 克 張 劍

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018)

細(xì)菌性疾病暴發(fā)對人類健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅。細(xì)菌引起的感染性腹瀉會導(dǎo)致機(jī)體生長速度緩慢、精神萎縮、免疫力下降甚至?xí)滤?。為預(yù)防或治療細(xì)菌性疾病，抗生素被廣泛應(yīng)用。然而，由于生產(chǎn)中抗生素的不當(dāng)使用，導(dǎo)致細(xì)菌病原對抗生素產(chǎn)生耐藥性，在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌種中出現(xiàn)多重耐藥性細(xì)菌，引起公共衛(wèi)生危機(jī)。因此，尋求抗生素的替代品，用于預(yù)防和治療致病性大腸桿菌所致腹瀉病，比如益生菌、益生元、植物提取物和有機(jī)酸等天然促生長劑(Nature growth promoters, NGPs)，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得以廣泛應(yīng)用[1]。益生菌食品因其含有微生物，食用后可維持腸道菌群的平衡，對某些疾病起到治療或預(yù)防的作用[2]。酸馬奶中含有豐富的微生物資源，其中最主要是乳酸菌和酵母菌。研究表明許多乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)具有益生菌特性，LAB是公認(rèn)的食品安全級(GRAS)益生菌之一，具有降血壓、抗感染、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防糖尿病、抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡、降低血清膽固醇和降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等效果[3-7]。LAB可提高小鼠免疫力，改善動物腸道結(jié)構(gòu)，同時可以促進(jìn)機(jī)體膽汁酸的腸肝循環(huán)和脂質(zhì)代謝功能[8]。飼料中添加適量的德氏乳酸菌能夠提高黃河鯉皮膚的抗氧化能力和免疫調(diào)節(jié)功能，同時能上調(diào)抗菌肽基因的表達(dá)，進(jìn)而對機(jī)體免疫性能和生長性能具有一定的調(diào)節(jié)作用[9]。益生菌可刺激白細(xì)胞介素-10(IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達(dá)，IL-10和TGF-β是腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)，二者之間具有協(xié)同作用[10-11]。大鼠灌胃植物乳桿菌XM5能有效緩解D-半乳糖對腦組織的氧化損傷，能顯著提高衰老模型組大鼠血清中的T-AOC、GSH-Px和SOD活力，肝臟中的GSH-Px活力[12]。酸馬奶中乳酸菌主要為戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌類堅(jiān)韌亞種、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和馬乳酒乳桿菌等。然而，關(guān)于副干酪乳桿菌類堅(jiān)韌亞種(Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans)對致病菌所致腹瀉小鼠血清免疫和抗氧化功能方面影響的相關(guān)研究尚少，因此，本試驗(yàn)擬以EscherichiacoliO8腹瀉小鼠模型組作為研究對象，灌胃不同濃度的乳酸菌和抗生素進(jìn)行腹瀉治療，通過評價副干酪乳桿菌類堅(jiān)韌亞種對腹瀉小鼠生長性能、免疫功能和抗氧化性能的改善作用，以期為進(jìn)一步深入開發(fā)研究益生菌類功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇SPF級昆明小鼠(KM鼠)60 只，雌雄各半，體重一致，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。為了適應(yīng)環(huán)境，先飼養(yǎng)(飼料主成分為玉米、豆粕、魚粉、多種維生素等，不含抗生素)5 d后稱重，選取體重(20±2) g的個體，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，試驗(yàn)期為7 d，分組情況及給藥方式見表1。

1.2 菌株、培養(yǎng)基及試劑

菌株為從酸馬奶中篩選的副干酪乳桿菌類堅(jiān)韌亞種。致病菌為從荷斯坦奶牛糞便中分離純化的致病性E.coliO8菌株，-80 ℃保存；Nisin購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；MRS固體和液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鹽酸環(huán)丙沙星購自廣州白云山制藥股份有限公司；小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)ELISA試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)試劑盒、小鼠γ干擾素(IFN-γ)試劑盒、小鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)試劑盒、小鼠過氧化氫酶(CAT)試劑盒、小鼠總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、小鼠過氧化氫酶(CAT)試劑盒、小鼠超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、小鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒和小鼠丙二醛(MDA)試劑盒，均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；大小鼠維持飼料購自北京科澳協(xié)力有限公司。

表1 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)分組情況及給藥方案Table 1 Grouping and dosage scheme of the antibacterial test in vivo

注： MLD為最低致死量。

Note: MLD is the minimal lethal dose.

1.3 儀器及設(shè)備

LDZM-40KCS立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠；ZXSD-B1090生化培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺購自蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī)購自德國Sigma公司；酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)菌株活化及菌懸液的制備

將20%(V/V)的甘油中-80 ℃保存的乳酸菌和大腸桿菌置37 ℃水浴融化，再分別劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種好的乳酸菌置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，大腸桿菌置于37 ℃有氧培養(yǎng)18～24 h，再挑取單個菌落分別接種到MRS液體培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯中，乳酸菌培養(yǎng)時間24 h。用酶標(biāo)儀測定600 nm OD值來確定菌密度，調(diào)整至制備所需濃度的菌懸液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1小鼠臨床癥狀的觀察

試驗(yàn)期間觀察并記錄小鼠精神狀態(tài)、飲食量、毛色、腹瀉和死亡情況。

1.5.2體重和采食量的測定

在試驗(yàn)第1 天、第3 天、第5 天和第7 天清晨分別進(jìn)行空腹稱重每只小鼠并記錄各組小鼠的采食量，分析體重和采食量的變化。

1.5.3免疫器官指數(shù)的測定

各組小鼠于末次灌藥禁食24 h(自由飲水)后稱重，腹腔注射0.3%的戊巴比妥鈉溶液(10～20 μL/g)麻醉每只小鼠心臟穿刺采血后，無菌取出脾臟和胸腺，稱重并計(jì)算免疫器官指數(shù)，計(jì)算公式如下：

脾臟指數(shù)=脾臟重/小鼠活體重 胸腺指數(shù)=胸腺重/小鼠活體重

1.5.4血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)的測定

小鼠心臟穿刺采集的全血室溫靜置2 h后3 000～4 000 r/min離心10 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中細(xì)胞因子水平、免疫球蛋白含量和抗氧化酶活性，每組做6個重復(fù)。測定標(biāo)本A450值，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，A450值為橫坐標(biāo)，在Excel上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本的A450值由標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)的濃度。

血清中細(xì)胞因子水平的測定：采用ELISA試劑盒按照操作說明書進(jìn)行檢測血清γ干擾素(IFN-γ)、IL-6、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)水平。

血清中抗氧化指標(biāo)的測定：采用ELISA試劑盒按照操作說明書進(jìn)行檢測小鼠血清過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

原始數(shù)據(jù)先用Excel 2016做簡單的處理，再應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA, LSD)，差異顯著時進(jìn)行Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著,P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠臨床癥狀變化

分別連續(xù)灌胃LAB高、中、低組和抗生素組不同劑量的LAB和抗生素7 d，在第4 天給小鼠腹腔注射E.coliO8，隨后幾天觀察該4組，包括正常對照組和陰性對照組，小鼠的外部體征和器官形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)：試驗(yàn)前3 天各組小鼠未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)和死亡現(xiàn)象；在試驗(yàn)第4 天陰性對照組死亡2 只，除正常對照組外，其他組小鼠具有精神萎靡，飲食量減少，被毛逆立，伏地不動，蜷縮一起，畏冷等癥狀(圖1(a)-I和(b)-I)；在試驗(yàn)第5 天陰性對照組和抗生素組各死亡1 只，除正常組外其他組均出現(xiàn)明顯的腹瀉，帶有黏液，精神狀態(tài)較差，腸道充血膨脹，眼瞼紅腫有分泌物等癥狀(圖1(a)-Ⅱ～Ⅳ和(b)-Ⅱ～Ⅳ)，平均各組2至3 只小鼠有拉血癥狀，采食量和飲水量明顯下降，表明腹瀉模型造模成功；在試驗(yàn)第6 天陰性對照組和LAB低劑量組各死亡1 只，LAB中劑量組死亡2 只，各組小鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，飲食量逐漸增加，陰性對照組中20%的小鼠出現(xiàn)便秘現(xiàn)象，可能是炎癥導(dǎo)致的便秘；在試驗(yàn)第7 天各組小鼠腹瀉癥狀輕微，陰性對照組眼瞼病變減輕，其他組眼瞼癥狀基本消失，飲食情況也基本恢復(fù)正常。

(a)正常對照組；(b)陰性對照組。Ⅰ精神狀態(tài)；Ⅱ腸道變化；Ⅲ糞便性狀；Ⅳ眼睛狀態(tài)。(a) Normal control group； (b) Negative control group. Ⅰ Mental states； Ⅱ Intestinal changes； Ⅲ Fecal traits； Ⅳ Eye condition.
圖1 各組小鼠臨床癥狀變化
Fig.1 Clinical symptoms of mice in different groups

2.2 各組小鼠體重和采食量的變化

將不同處理中腹瀉模型小鼠體重變化進(jìn)行組間比較：在試驗(yàn)前3 天隨飼養(yǎng)時間的延長各組小鼠體重均呈上升趨勢，但未產(chǎn)生顯著性影響(P>0.05)，LAB低、中、高劑量組、抗生素組、陰性對照組和正常對照組小鼠體重分別增長了0.68、0.08、0.23、0.79、0.81、1.35、0.84 g。在試驗(yàn)第5 天，與正常對照組相比，LAB低、高劑量組、抗生素組小鼠體重顯著降低(P<0.05)，LAB中劑量組差異不顯著(P>0.05)，陰性對照組極顯著降低(P<0.01)。試驗(yàn)第7 天，與陰性對照組相比，其他組小鼠體重顯著提高(P<0.05)，表明LAB能夠穩(wěn)定腹瀉小鼠體重變化，腹腔注射E.coliO8后，致使小鼠體重減輕(表2)。

表2 試驗(yàn)期間各組小鼠體重變化Table 2 Changes of body weight of mice in different groups during the whole experimental period g

注：同列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Note: Within the same column, different letters represent significant differences (P<0.05), while the same letters represent no significant differences (P>0.05). The same below.

將不同處理中腹瀉模型小鼠平均采食量的變化進(jìn)行組間比較：試驗(yàn)第1天和第3天各組小鼠平均采食量相對平穩(wěn)。試驗(yàn)第5天與正常對照組相比，其他組小鼠平均采食量明顯下降，試驗(yàn)第7天除陰性對照組外，其他試驗(yàn)組采食量基本處于恢復(fù)狀態(tài)，總體表現(xiàn)為除正常對照組外，陰性對照組的平均采食量最低，LAB高劑量組的平均采食量最高(表3)。

表3 試驗(yàn)期間各組小鼠平均采食量的變化

Table 3 Change of ADFI of mice from different groups during the whole experimental period g

組別Group第1天Day 1第3天Day 3第5天Day 5第7天Day 7LAB低劑量組 LAB low dose group5.624.942.253.79LAB中劑量組 LAB middle dose group5.693.932.013.89LAB高劑量組 LAB high dose group5.284.792.833.96抗生素組 Antibiotic group5.555.171.593.53陰性對照組 Negative control group5.604.650.912.58正常對照組 Normal group5.114.194.474.28

2.3 LAB對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

將不同處理中腹瀉模型小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)進(jìn)行組間比較： LAB高劑量組的小鼠脾臟指數(shù)顯著高于陰性對照組(P<0.05)，其他組有所提高，但未至顯著程度(P>0.05)；正常對照組的小鼠胸腺指數(shù)顯著高于陰性對照組(P<0.05)，其他組有所提高，但不具有顯著性(P>0.05)(表4)。

2.4 LAB對小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

將不同處理中腹瀉模型小鼠血清細(xì)胞因子進(jìn)行組間比較：與正常對照組相比，陰性對照組IL-4、IL-10 和 TGF-β水平明顯降低，而促炎細(xì)胞因子IL-6和IFN-γ水平明顯提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表5)。

表4 LAB對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

Table 4 Effect of LAB on spleen index and thymus index of mice mg/g

組別Group脾臟指數(shù)Spleen index胸腺指數(shù)Thymus indexLAB低劑量組 LAB low dose group4.28±0.53 ab1.33±0.06 abLAB中劑量組 LAB middle dose group4.62±0.13 ab1.40±0.07 abLAB高劑量組 LAB high dose group5.32±0.30 a1.53±0.11 ab抗生素組 Antibiotic group4.18±0.37 ab1.49±0.09 ab陰性對照組 Negative control group3.46±0.14 b1.24±0.10 b正常對照組 Normal group4.21±0.59 ab1.61±0.12 a

表5 LAB對小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響Table 5 Effect of LAB on the serum cytokine levels of mice pg/mL

與陰性對照組相比：LAB低、中劑量組IL-4和 TGF-β均顯著提高(P<0.05)，LAB高劑量組 IL-10極顯著提高(P<0.01)，抗生素組IL-4、IL-10顯著提高(P<0.05)，TGF-β極顯著提高(P<0.01)；與抗生素組相比，LAB高劑量組IL-4無顯著性差異(P>0.05)，IL-10顯著降低(P<0.05)，TGF-β顯著提高(P<0.05)。與陰性對照組相比：LAB低劑量組IL-6顯著降低(P<0.05)，LAB低、中劑量組IFN-γ顯著降低(P<0.05)，LAB中、高劑量組和抗生素組IL-6極顯著降低(P<0.01)，LAB高劑量組和抗生素組IFN-γ極顯著降低(P<0.01)；與抗生素組相比，LAB高劑量組IL-6顯著提高(P<0.05)，IFN-γ無顯著性差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明：LAB對腹瀉小鼠血清中IL-4、IL-10和TGF-β水平影響是隨著劑量的增大而提高，IL-6和IFN-γ水平隨著劑量的增大而降低；LAB高劑量組可極顯著提高IL-4、IL-10、TGF-β(P<0.01)，極顯著降低IL-6、IFN-γ(P<0.01)，較陰性對照組分別提高了51.53%、41.78%、50.47%，分別降低了27.83%、47.12%。因此，LAB對腹瀉小鼠血清免疫水平起調(diào)節(jié)作用。

2.5 LAB對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

將不同處理中腹瀉模型小鼠血清抗氧化能力進(jìn)行組間比較，LAB對小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響見表6。由表6可知，與正常對照組相比，陰性對照組小鼠血清中CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活力明顯下降，MDA含量明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與陰性對照組相比：LAB低、中劑量組CAT、SOD和GSH-Px均顯著提高(P<0.05)，LAB高劑量組極顯著提高(P<0.01)；不同劑量LAB組 T-AOC 顯著提高(P<0.05)，抗生素組CAT和GSH-Px顯著提高(P<0.05)，T-AOC和SOD極顯著提高(P<0.01)。與抗生素組相比：LAB高劑量組CAT、T-AOC和SOD無顯著性差異(P>0.05)；GSH-Px顯著提高(P<0.05)。

與陰性對照組相比：不同劑量LAB組MDA顯著降低(P<0.05)，抗生素組極顯著降低(P<0.01)；LAB高劑量組與抗生素組無顯著性差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明，致病性E.coliO8所致腹瀉小鼠灌胃LAB對血清CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活力起到了提高的作用，對MDA含量起到了降低作用。LAB高劑量組可極顯著提高CAT、T-AOC、SOD和GSH-Px活力(P<0.01)，顯著降低MDA含量(P<0.05)，較陰性對照組分別提高了44.43%、24.69%、39.57%、53.24%，MDA含量下降了24.78%。

表6 LAB對小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effect of LAB on serum antioxidant index of mice

3 討 論

3.1 LAB對腹瀉小鼠生長性能的影響

已有研究表明使用發(fā)酵乳可降低犢牛的死亡率和腹瀉發(fā)病率，并改善了其生長特性、體內(nèi)微生物及血液的指標(biāo)表現(xiàn)[13]。飼糧中添加1 000 mg/kg LAB能夠顯著提高肉雞的增重并降低死亡率， LAB改善了肉雞腸道健康狀況，導(dǎo)致犢牛采食量增大，體重增加[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：試驗(yàn)前期或預(yù)防期(處理后的前3 d)，各組小鼠體重均有緩慢增加，但組間差異不顯著；在試驗(yàn)第5天，LAB中劑量組小鼠體重與正常對照組相比差異不顯著，其他組顯著降低，陰性對照組極顯著降低；試驗(yàn)第7天，與陰性對照組相比，其他組顯著提高(P<0.05)，說明LAB對腹瀉小鼠的生長性能具有恢復(fù)作用。另外，注射致病性大腸桿菌可能導(dǎo)致小鼠腸道菌群失調(diào)，引致小鼠采食量下降。

3.2 LAB對腹瀉小鼠免疫器官指數(shù)的影響

動物免疫器官包括外周免疫器官和中樞免疫器官2類：外周免疫器官包括脾臟、淋巴結(jié)和黏膜相關(guān)淋巴組織；中樞免疫器官包括胸腺和骨髓等，其中胸腺是生物體最重要的中樞免疫器官[15]。哺乳動物免疫細(xì)胞主要分布在脾臟和胸腺，脾臟是成年動物最大的免疫器官，在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；胸腺是誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖分化成免疫活性細(xì)胞的場所，是構(gòu)建細(xì)胞免疫功能的車間[16]。因此，以脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)作為基本的免疫指標(biāo)可在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能。當(dāng)免疫功能受到抑制或激發(fā)時，脾臟細(xì)胞和胸腺細(xì)胞會相應(yīng)萎縮或增殖[17]。已有研究表明LAB對免疫器官發(fā)育存在著一定促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞和器官的生長發(fā)育，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的作用，從而加強(qiáng)腸道與其他組織對病原體的抵抗力，提高動物免疫機(jī)能[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃0.3 mL活菌數(shù)為1×1010CFU/mL的LAB可顯著提高脾臟指數(shù)，對腹瀉小鼠胸腺指數(shù)具有隨著LAB劑量的增加而提高趨勢。因此，推斷LAB可能是促進(jìn)腹瀉小鼠脾臟內(nèi)組織細(xì)胞和胸腺中淋巴細(xì)胞的生長發(fā)育，進(jìn)而提高細(xì)胞數(shù)目，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

3.3 LAB對腹瀉小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響

益生菌可不同程度地誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[19]。某些益生菌可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的分化，引起抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-4和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的表達(dá)[20]。LAB對抗炎細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子具有不同調(diào)節(jié)能力以及輔助性T細(xì)胞Th1和Th2平衡的能力[21]：Th1的免疫應(yīng)答產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，并參與對細(xì)胞內(nèi)感染的細(xì)胞免疫；Th2型的免疫應(yīng)答產(chǎn)生多種抗炎細(xì)胞因子并促進(jìn)對細(xì)胞外病原體的體液免疫[22]；益生菌與美沙拉嗪聯(lián)合應(yīng)用時大鼠血清中IL-6和IFN-γ等促炎因子顯著降低[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對照組相比，正常組血清中IFN-γ和IL-6水平極顯著降低，LAB各劑量組相對于正常對照組上升，但極顯著低于陰性對照組，說明LAB各劑量組腹瀉小鼠的免疫功能有所提高。di Giacinto等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型試驗(yàn)中，益生菌通過誘導(dǎo)固有層單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-10來改善結(jié)腸炎。IL-10是重要的抗炎性細(xì)胞因子，能抑制T細(xì)胞過量產(chǎn)生IFN-γ、IL-6等促炎性細(xì)胞因子，因而防止過度免疫應(yīng)答對機(jī)體引起的危害。本試驗(yàn)中，與陰性對照組相比，正常對照組組小鼠血清中IL-4、IL-10和TGF-β水平極顯著提高，LAB各劑量組相對于正常對照組下降，但顯著高于陰性對照組，說明LAB可以減少IL-4、IL-10和TGF-β水平的下降，與di Giacinto研究發(fā)現(xiàn)益生菌促進(jìn)血清IL-10水平的提高相一致。因此，E.coliO8腹瀉模型紊亂了小鼠Th1和Th2細(xì)胞的平衡，通過LAB干預(yù)治療可抑制Th1類細(xì)胞生成過量的炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞生成大量抗炎細(xì)胞因子，從而維持腹瀉小鼠體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)。

3.4 LAB對腹瀉小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響

近年來，LAB抗氧化性能的研究引起廣泛重視，但相關(guān)研究報(bào)道并不多。LAB抗氧化性能的研究包括體內(nèi)和體外抗氧化試驗(yàn)，體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)主要是飼喂抗氧化劑，檢測其組織和血清中的抗氧化酶。體外抗氧化試驗(yàn)主要通過檢測LAB的自由基清除能力等試驗(yàn)來評價LAB的抗氧化活性。T-AOC 抗氧化能力包括酶促與非酶促2 個體系，這2 個體系之間相互協(xié)同，發(fā)揮抗氧化的作用[25]。SOD、GSH-Px和CAT是抵抗氧化應(yīng)激的第一道防線，可以抑制自由基的形成，防止活性氧(ROS)的氧化損傷[26]。SOD能夠?qū)⒊踝杂苫D(zhuǎn)化為H2O2，H2O2可被CAT和GSH-Px分解為O2[27]。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，可以反映脂質(zhì)過氧化水平，是引起氧化應(yīng)激的最重要機(jī)制之一，MDA作為有毒脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物一直被認(rèn)為是檢測脂質(zhì)過氧化水平的指標(biāo)[28]。因此，MDA含量可以反映氧化損傷最為經(jīng)典也是最為有效的指標(biāo)。因此，本試驗(yàn)分別測定了LAB對腹瀉小鼠血清中T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性和MDA含量的影響，結(jié)果表明：與正常對照組相比，腹腔注射致病性E.coliO8后小鼠血清中T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性極顯著降低，MDA含量極顯著上升；LAB可顯著減少T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性的降低，顯著減少M(fèi)DA含量的上升。LAB水解蛋白質(zhì)主要原理是它在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酶類，使底物蛋白等大分子得以降解，從而可以改善品質(zhì)、營養(yǎng)、抗氧化性能[29]。黃珊珊等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與衰老模型對照組相比，灌胃LAB及正常組的小鼠血清和肝臟中T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性明顯升高，MDA含量明顯降低，表明LAB可能通過提高小鼠抗氧化能力而改善機(jī)體健康狀況，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。另有研究顯示飼糧中添加0.1%的LAB和酵母菌復(fù)合制劑可顯著提高肉仔雞的抗氧化能力[31]。本試驗(yàn)LAB組腹瀉小鼠體內(nèi)抗氧化效果明顯優(yōu)于抗生素組，因此，推測LAB可通過小鼠的氧化還原狀態(tài)，維持良好的健康狀況。此外，LAB顯著降低了血清中MDA含量，說明小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度降低，因而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用LAB灌胃E.coliO8所致腹瀉小鼠，探討了LAB對腹瀉小鼠生長性能、免疫機(jī)能及抗氧化能力的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃0.3 mL活菌數(shù)為1×1010CFU/mL的LAB菌液對腹瀉小鼠生長性能具有恢復(fù)作用，且可顯著提高脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù)有增加趨勢，并通過維持Th1和Th2細(xì)胞的平衡來調(diào)節(jié)血清免疫指標(biāo)，還能緩解致病菌引起的機(jī)體氧化損傷。