39個(gè)木槿品種親緣關(guān)系SRAP分析

趙藝璇，王 鑫，田 琳，李明陽，劉易超，劉冬云*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北保定 071000；2.河北潤豐林業(yè)科技有限公司，石家莊 050000）

木槿（Hibiscus syriacus）是我國北方園林綠化常用的灌木或小喬木。木槿花色花型豐富，按顏色分有白色、粉色、藍(lán)色和紫色木槿，按花型分可分為單瓣木槿、半重瓣木槿和重瓣木槿。木槿花期極長，6—10 月可連續(xù)開花，彌補(bǔ)了我國北方園林綠化中夏秋缺少開花木本植物的不足。木槿原產(chǎn)于中國，可適應(yīng)我國大部分地區(qū)的環(huán)境條件，在全球范圍內(nèi)也有廣泛應(yīng)用[1]。木槿適應(yīng)性很強(qiáng)，可抵抗洪澇、干旱等各種惡劣環(huán)境。此外，木槿還可對抗SO2、Cl2等有毒氣體，阻滯塵埃，是園林綠化的優(yōu)良樹種[2]。木槿品種繁多，韓國、美國、比利時(shí)等國家已培育出了200 多個(gè)新品種。長時(shí)間以來，由于不斷的人工雜交和自然選擇，使得木槿品種關(guān)系混亂，來源不明。因此，今后引種、育種過程特別應(yīng)該在弄清品種來源的前提下有目的地進(jìn)行。序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR 反應(yīng)，獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對開放閱讀框（ORFs，open readings frames）進(jìn)行擴(kuò)增的分子標(biāo)記，因各個(gè)品種ORF 序列不同而產(chǎn)生不同的譜帶，相較于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記（RAPD）法，可產(chǎn)生大量且清晰的多態(tài)性譜帶[3]。目前，SRAP 已廣泛應(yīng)用于石斛蘭（Dendronbium nobile）[4]、杜鵑（Rhododendron simisii）[5]、杜仲（Eucommia ulmoides）[6]、高丹草（Sorghum sudanense）[7]、三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）[8]等多種植物種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性研究中。目前，針對木槿分子標(biāo)記的研究較少，J.H.KIM等人使用RAPD 法分析了26 個(gè)木槿品種的遺傳關(guān)系[9]；肖芬從100 條ISSR 引物中篩選出6 對適用于木槿，可擴(kuò)增條帶多且清晰的引物[10]，H.AN 等人使用AFLP 法研究了華木槿、廬山木槿和不同品種木槿之間的親緣關(guān)系，認(rèn)為AFLP 法可以區(qū)分不同品種木槿[11]。但利用RAPD 和AFLP 對木槿遺傳多樣性檢測效率較低且操作步驟繁瑣。因此，需要開發(fā)新的分子標(biāo)記方法對木槿遺傳多樣性進(jìn)行研究。

本研究利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳對39 個(gè)木槿品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期從分子水平確定其親緣關(guān)系，為木槿品種鑒定、品種保護(hù)及雜交育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用39 個(gè)木槿品種見表1。

1.2 DNA提取方法

每個(gè)品種從5 個(gè)單株中各取2 張幼嫩葉片，混合取樣 2 g，試驗(yàn)使用 CTAB 法提取 39 個(gè)木槿（Hibiscus syriacus）品種 DNA。

CTAB 法提取木槿DNA 具體方法如下：

取2 g 幼嫩木槿葉片加入液氮充分研磨，加入預(yù)熱30 min 的 65 ℃ 1000 μL CTAB 提取液，然后加入100 μL 巰基乙醇，加入預(yù)熱的CTAB 提取液補(bǔ)滿離心管；65 ℃溫水浴30 min，每5 min 震蕩1次，取出晾至室溫后10 000 rpm 離心4 min 后取上清液 750 μL 至 1.5 mL 離心管，加入 750 μL 氯仿：異戊醇（24∶1）充分混勻，10 000 rpm 離心 15 min，重復(fù)此步驟3 次；取上清液600 μL 至1.5 mL 離心管，加入 400 μL 預(yù)冷異丙醇和 300 μL 5mmol/L NaCl，輕輕搖勻后-20 ℃放置 3～5 h 后 12 000 rpm 離心20 min 收集沉淀，去上清，70%乙醇 400 μL 10 000 rpm離心3 min 2 次；無水乙醇400 μL 洗1 次，棄上清，吸走多余溶液，37 ℃開蓋干燥10 min 然后加入50 μL ddH2O 和 2 μL rNase 酶放入-20 ℃冰箱保存。

表1 供試木槿品種的編號(hào)、品種名稱Table l The number, genotype name of Hibiscus syriacus

最后用Thermo 微量紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)其濃度和純度，然后稀釋到20 ng/μL 備用。

1.3 SRAP引物和篩選

根據(jù)Li G.提出的SRAP 引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物[12]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)上游引物及下游引物各16 條，配對為256 對引物。選取歐洲花葉木槿（H.s'Argenteovariegata'）、長苞重瓣木槿（H.s.var.longibracteatus）、雅致木槿（H.s.f.elegantissimus）和木槿（Hibiscus syriacus）作為DNA 模板，進(jìn)行SRAP 分子標(biāo)記引物組合的篩選。從256 對SRAP 引物組合中篩選擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性條帶較多、重復(fù)性好的引物進(jìn)行39 個(gè)木槿品種親緣關(guān)系分析。SRAP 引物序列信息見表2。

25 μL PCR 反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 12.5 μL；DNA 1 μL（20 ng/μL）；上游引物、下游引物各 1 μL；ddH2O 9.5 μL。

表2 SRAP 引物序列信息Table 2 The name and base sequence of SRAP primers

PCR擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃1min，37℃1min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR 反應(yīng)在 BIO-RAD 基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Thermo 微量紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量和濃度，1% 瓊脂糖凝膠電泳（1× TAE 緩沖液，100 V，0.5 h）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，6× SuperStain染色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將瓊脂糖凝膠電泳圖中清晰、無拖帶、易分辨的條帶記為“1”，反之則記為“0”。根據(jù)人工讀帶結(jié)果，在Excel 表格中，將引物名稱作為縱坐標(biāo)，木槿名稱作為縱坐標(biāo)建立矩陣[12]。利用NTsys 2.10 軟件，使用UPGMA 法繪制聚類分析圖。使用POPGENE軟件計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon's 信息指數(shù)（I）、Nei's 基因多態(tài)性（H）等指標(biāo)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

選取歐洲花葉木槿、長苞重瓣木槿、雅致木槿和木槿4 個(gè)品種對256 對SRAP 引物進(jìn)行初步篩選。然后，利用39 個(gè)木槿品種DNA 樣本進(jìn)行SRAP引物的進(jìn)一步篩選。結(jié)果表明，在26 對初篩選引物中，有10 對引物的擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性豐富，部分結(jié)果如圖1 所示。

2.2 SRAP標(biāo)記多態(tài)性分析

從256 對中篩選出的10 對SRAP 組合可擴(kuò)增出88 條明亮，無拖帶，重復(fù)高的譜帶，其中，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶72 條，多態(tài)性百分比為81.81%（表3）。每對組合平均可擴(kuò)增條帶8.8 條，多態(tài)性條帶7.2 條。這 10 對 SRAP 引物組合可擴(kuò)增出 6～12 條數(shù)目不等的條帶，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖2、圖3。其中Em7/Me5 和Em9/Me15 產(chǎn)生條帶多態(tài)性百分比最低，均為66.67%。Em4/Me13 產(chǎn)生條帶多態(tài)性百分比最高，為100%。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)的39 份木槿樣本多態(tài)性位點(diǎn)較多，異質(zhì)性高，即這39 個(gè)木槿品種變異較為廣泛，遺傳基礎(chǔ)寬。

圖1 部分引物篩選結(jié)果Figure 1 PCR amplification of SRAP primer combinations

2.3 木槿遺傳多樣性分析

利用 POPGENE 1.32 分析39 個(gè)木槿品種DNA多樣性。結(jié)果表明，木槿等位基因數(shù)（Na）值為1.181，木槿有效等位基因數(shù)（Ne）值為 1.597 0，Nei's 基因多樣性（H）為 0.332 8，Shannon's 多樣性信息指數(shù)（I）為0.428 7，表明39 份木槿種質(zhì)資源基因組DNA 多態(tài)性較高，基因庫較為豐富有著廣泛的遺傳基礎(chǔ)。

表3 10 對SRAP 引物在木槿品種中的多態(tài)性分析Table 3 Polymorphism for Hibiscus syriacus varieties using 10 SRAP primer pairs

圖2 SRAP 引物Em7/Me13 的PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Figure 2 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by SRAP primer Em7/Me13

2.4 SRAP標(biāo)記聚類分析

利用軟件NTsys 2.10 對原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行處理，根據(jù)UPGMA 法對39 份木槿樣本SRAP 分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明在遺傳距離為0.759 處，39 個(gè)木槿品種被分為5 類，第Ⅰ類包括白花單瓣木槿、長苞重瓣木槿、雅致木槿、粉花重瓣木槿及其他木槿品種，第Ⅱ類包括‘紅心’‘粉色雪紡’‘薰衣草雪紡’3 個(gè)木槿品種，第Ⅲ類包括單瓣紫粉木槿；第Ⅳ類包括普通粉色重瓣木槿；第Ⅴ類包括牡丹和白花重瓣2 個(gè)品種（圖4）。

圖3 SRAP 引物Em12/Me4 的PCR 擴(kuò)增電泳圖譜Figure 3 The electrophoretogram of PCR amplified patterns by SRAP primer Em12/Me4

圖4 39 個(gè)木槿品種的SRAP 聚類圖Figure 4 SRAP dendrogram of 39 Hibiscus syriacus cultivars

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性即在種內(nèi)不同群體或一個(gè)種群不同個(gè)體產(chǎn)生的遺傳變異，是產(chǎn)生物種差異和生物多樣性的基礎(chǔ)。了解木槿種質(zhì)資源的遺傳多樣性，對推動(dòng)木槿資源更深層次的開發(fā)和利用，具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義[15]。SRAP 分子標(biāo)記由于操作簡單，引物擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好，具有通用性，開發(fā)成本較低，標(biāo)記位點(diǎn)中共顯性標(biāo)記比例較高，且在基因組中均勻分布等特點(diǎn)，得到很多研究者的青睞[16]。但在前人的研究中，未曾有過關(guān)于SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于木槿的報(bào)道。本研究從256 對中篩選了10 對可應(yīng)用于木槿遺傳研究的SRAP 組合，這10 對引物共擴(kuò)增出88 條譜帶，多態(tài)性百分比為81.81%，擴(kuò)增條帶多態(tài)性高且圖像清晰，無拖帶現(xiàn)象。由此可見，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可應(yīng)用于木槿種質(zhì)資源的系統(tǒng)分類、親緣及進(jìn)化關(guān)系鑒定、品種鑒別、親本選擇，為木槿種質(zhì)資源研究提供理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)利用 POPGENE 1.32 分析了39 份木槿樣本DNA 多樣性。結(jié)果表明，39 個(gè)木槿品種基因組DNA 多態(tài)性較高，基因庫較為豐富，有著廣泛的遺傳基礎(chǔ)。

Van H.等[11]使用 AFLP 法對華木槿、廬山木槿以及木槿品種之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，木槿的親緣進(jìn)化關(guān)系與其表型性狀之間無明顯聯(lián)系，但肖芬等[17]對27 個(gè)木槿品種進(jìn)行了數(shù)量分類，認(rèn)為有無丹心、花型、丹心線與丹心關(guān)系和丹心基部形狀可作為木槿形態(tài)分類的主要指標(biāo)。在本研究中，第Ⅰ類又可分為4 種花型，包括藍(lán)紫色重瓣木槿，比如‘歐洲花葉木槿’‘紫裙’‘藍(lán)莓冰沙’和‘法國紅色酒館’，且此4 個(gè)品種丹心線與丹心近等長；這4 個(gè)品種遺傳關(guān)系較近均遺傳關(guān)系較近，而藍(lán)紫色單瓣木槿‘夏威夷’‘藍(lán)色錦緞’‘細(xì)葉’和‘瑪麗娜’遺傳關(guān)系較近，且此類4 個(gè)品種丹心線均超出丹心，粉白色重瓣木槿包括‘粉色鉛筆’‘薄荷’和‘千絲絆’，丹心線與丹心近等長，粉紫色單瓣木槿‘藍(lán)鳥’‘粉紅巨人’和‘紫柱’丹心線明顯超出丹心，第Ⅱ類包括‘紅心’‘粉色雪紡’‘薰衣草雪紡’3 個(gè)木槿品種，均為粉白色木槿，第Ⅲ類包括單瓣紫粉木槿；第Ⅳ類包括普通粉色重瓣木槿，第Ⅲ類和第Ⅳ類均為粉紫色木槿，第Ⅴ類包括牡丹和白花重瓣2個(gè)品種，為粉白色木槿。因此，本研究認(rèn)為木槿的系統(tǒng)分類主要與花瓣顏色、丹心與丹心線關(guān)系、瓣型有關(guān)，與肖芬的研究存在一致性。

本研究使用UPGMA 法聚類分析了39 個(gè)木槿品種的遺傳關(guān)系。當(dāng)遺傳距離為0.759 時(shí)，39 份木槿樣本被聚為5 類。長苞重瓣木槿、雅致木槿、粉花重瓣木槿等木槿變種及其他木槿品種被分為第Ⅰ類；普通粉色重瓣這個(gè)變種單獨(dú)被分入第Ⅳ類，而牡丹木槿和白花重瓣兩個(gè)木槿變型品種被分入了第Ⅴ類。張錚等[18]人從木材解剖學(xué)角度研究了5 個(gè)品種木槿進(jìn)化關(guān)系，該研究認(rèn)為，雅致木槿屬于較原始的類群，而白花重瓣木槿和牡丹木槿2 個(gè)類群相對較為進(jìn)化。本研究中，雅致木槿和木槿在遺傳距離為0.853 處，仍可被聚為一類，兩者親緣關(guān)系較近，由此可以推斷雅致木槿較為原始，牡丹木槿和白花重瓣木槿較為進(jìn)化，與張錚和肖芬研究結(jié)果一致[10，18]。

綜上所述，本研究認(rèn)為木槿親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與其表型性狀存在一定聯(lián)系，雅致木槿進(jìn)化程度較低，而牡丹木槿和白花重瓣木槿較為進(jìn)化。本試驗(yàn)使用SRAP 分子標(biāo)記法對木槿親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，為木槿親緣關(guān)系研究及雜交育種親本選育提供了重要的理論依據(jù)。