張偉然 ，林雪峰，李 鑫，張 浩，王 猛，孫 偉，韓興鵬，孫大強

1. 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2. 天津市胸科醫(yī)院胸外科，天津 300222；3. 天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護理系，天津300222；4. 天津市南開醫(yī)院胸外科，天津 300100

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率均排第一位的惡性腫瘤。據(jù)最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020 年全世界肺癌新發(fā)患者228 820 例，死亡病例135 720 例[1]。非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌病例的85%[2]。肺腺癌是一種常見的NSCLC，約占NSCLC 的50%[3]。近年來，肺腺癌機制的研究得到了廣泛的開展，研究人員發(fā)現(xiàn)遺傳因素影響了肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。其中有研究[4]發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中最常出現(xiàn)的是ALK、ROS1 和RET 重排，另外還有80 多種基因易位。此外，還有很多常見的基因突變影響肺腺癌，包括TP53（46%）、EGFR（20%）、HER2（2%）、KRAS（1%）、ALK（1%）、BRAF（1%）和PIK3CA（1%）等[5]。這些發(fā)現(xiàn)對肺腺癌的靶向治療具有重要意義。例如，克唑替尼對ALK 或ROS1 融合的腫瘤有效，而吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼可用于EGFR 突變的腫瘤患者[6]。但目前臨床應(yīng)用的藥物很少，肺腺癌患者的死亡率很高，患者很難獲得長期生存[7]。因此，肺腺癌的分子機制亟待進一步探索。

目前，很多研究通過基因芯片數(shù)據(jù)分析揭示了一些與肺腺癌相關(guān)的基因。Tian 等[8]鑒定出9 個lncRNA 和6 個mRNA，它們可能是診斷或預(yù)測人類肺腺癌細胞對紫杉醇耐藥性的有效標志物。Liu 等[9]通過分析miRNA 基因芯片表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-136、miR-376a 和miR-31 在小鼠肺癌中均顯著過表達，同時miR-31 作為致癌miRNA 在肺癌中靶向抑制特異性的腫瘤抑制因子。Zhu 等[10]報道了hsa_circ_0013958（一種環(huán)狀RNA）可以作為一種潛在的非侵入性生物標志物用于肺腺癌的早期檢測和篩查。另一項微陣列圖譜研究[11]表明，hsa_circ_0007385 在NSCLC 腫瘤的形成中起重要作用，為NSCLC 的治療提供了一個潛在的靶點。本研究綜合分析了肺腺癌組織的基因、miRNA和circRNA 表達譜，以探索肺腺癌的潛在生物標志物，并通過癌癥基因圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）對關(guān)鍵基因進行驗證。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)

芯 片 數(shù) 據(jù)GSE104854[12]、GSE102511、GSE85716、GSE83527 和GSE101586[13]從 基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 中 下 載。GSE104854、GSE102511 和GSE85716 是基因表達譜，分別包括3、16和6 個肺腺癌組織及其癌旁組織，測序平臺分別是Ion Torrent Proton（Homo sapiens）、Ion Torrent Proton（Homo sapiens）和Agilent-062918 OE Human lncRNA Microarray V4.0 028004。GSE83527 是一個基于Illumina Hiseq 2000（Homo sapiens）平臺的miRNA 表達譜，包含36 個肺腺癌樣本及其癌旁樣本。circRNA 表達譜芯片編號為GSE101586，有10 例樣本，包括5 例正常樣本及5 例癌癥樣本，芯片平臺為Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1。

1.2 差異表達分析

對所有的GEO 數(shù)據(jù)進行處理后，通過Limma V3.34.8函數(shù)包（http://www.bioconductor.org/packages/3.6/bioc/html/limma.html）進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）、差異表達miRNAs（differentially expressed miRNAs，DEMs） 和 差 異 表 達circRNAs（differentially expressed circRNAs，DECs）分析。GSE104854、GSE102511和GSE85716 的分析參數(shù)分別為|Log_FC|>3、|Log_FC|>2、|Log_FC|>2，均P<0.05。進一步篩選出上述3 組表達譜的重疊DEGs。此外，DEMs 和DECs 的納入標準均為|Log_FC|>1 和P<0.05。采用circBase（http://www.circbase.org/）進一步對DEGs 與DECs 的關(guān)系進行分析。

1.3 功能富集分析

用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（David，https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp，6.7 版）、京 都 基 因 和 基因組百科全書（KEGG PATHWAY，http://www.genome.jp/kegg）和Reactome（http://www.reactome.org）對 重 疊DEGs 進行功能富集分析，得到P<0.05 的基因本體（gene ontology，GO）和重疊DEGs 所涉及的重要生物過程和 通路。

1.4 miRNA 靶向基因的篩選

為了探索肺腺癌樣本中DEMs 的調(diào)控機制，利用miRWall v3.0 數(shù) 據(jù) 庫（http://129.206.7.150/）獲 得DEMs的分子靶標和miRNA-基因關(guān)系對，進一步篩選出負調(diào)控的miRNA-基因關(guān)系對。

1.5 綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String V10.5（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫獲得重疊DEGs 的高置信（>400 分）的蛋白-蛋白對，基于蛋白-蛋白對和上述負調(diào)控的miRNA-基因關(guān)系對建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并用CytoCope V3.5.1 軟件（http://wwwyCytoCAPE.org/Sudio.php）進行可視化。

1.6 關(guān)鍵基因的驗證

從TCGA（https://cancer genome.nih.gov/）中下載15例肺腺癌患者的癌組織樣本及其癌旁組織進行DEGs 篩選。TCGA 數(shù)據(jù)篩選參照中國臨床腫瘤學(xué)會腫瘤標志物專家委員會和中國腫瘤驅(qū)動基因協(xié)會的專家共識及相關(guān)文獻，由2 位病理學(xué)教授對每例樣本進行病理定量和質(zhì)量控制分析。DEGs 以|Log_FC|>2、P<0.05 為閾值，記為DEGs-TCGA。將DEGs-TCGA 與上述基因表達譜的3 組DEGs 進行比較。此外，采用聚類算法對癌組織樣本和癌旁組織進行分離，比較關(guān)鍵基因表達與患者總生存期和腫瘤分期間的相關(guān)性。

收集8 例2018 年1 月—10 月在天津市胸科醫(yī)院就診的肺腺癌患者的癌組織和癌旁組織，提取總RNA。使用SYBR?Premix Ex Taq ? Kit 試劑盒（TaKaRa，日本）進 行SFTPC、ITLN2、SLC6A4、ADRA1A 以 及EGFR 的實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 采 用All-in-One ? miRNA qPCR Kit 試 劑盒（GeneCopoeia Inc.，美國）檢測。所有引物均由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司設(shè)計合成，如表1 所示。β-actin 和U6 為內(nèi)參。收集患者的外周血樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清中腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達水平。

表1 SFTPC、ITLN2、SLC6A4、ADRA1A、hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 的引物序列Tab 1 Primer sequences of SFTPC, ITLN2, SLC6A4, ADRA1A, hsa-mir-141-5p and hsa-mir-191-3p

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEGs、DEMs 和DECs 篩選

在GSE104854、GSE102511 和GSE85716 中， 與 癌旁組織相比，肺腺癌組織分別檢測到412 個（180 個上調(diào)和232 個下調(diào)）、201 個（71 個上調(diào)和130 個下調(diào)）和709 個（166 個上調(diào)和543 個下調(diào)）DEGs，圖1 顯示了3組DEGs 的Venn 圖。此外，3 組DEG 中包含61 個重疊DEGs（表2），其中P 值較小的重疊DEGs 包括SFTPC、SLC6A4、CA4、TMEM100 和ITLn2。這些重疊DEGs 具有相同的調(diào)節(jié)趨勢，即同時上調(diào)或下調(diào)。

圖1 GSE104854、GSE102511 和GSE85716 基 因 表 達 譜 中3 組DEGs 的Venn 圖Fig 1 Venn diagram of 3 sets of DEGs in gene expression profiles of GSE104854, GSE102511 and GSE85716

表2 GSE104854、GSE102511 和GSE85716 基因表達譜中的重疊DEGsTab 2 Overlapped DEGs in gene expression profiles of GSE104854, GSE102511 and GSE85716

Continued Tab

Continued Tab

在GSE83527 中，與癌旁組織相比，肺腺癌組織僅發(fā)現(xiàn)24 個DEMs，其中11 個上調(diào)，13 個下調(diào)（表3）。所有DEMs 在2 組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表3 肺腺癌組織相對于癌旁組織的DEMsTab 3 DEMs in lung adenocarcinoma tissues compared with their paracancerous tissues

Continued Tab

在GSE101586 中，肺腺癌組織和癌旁組織發(fā)現(xiàn)92 個DECs，包括10 個上調(diào)DECs 和82 個下調(diào)DECs。進一步確定這些DECs 的位置，其中70 個位于編碼區(qū)的外顯子區(qū)，18 個位于編碼區(qū)的內(nèi)含子區(qū)，3 個位于內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，1 個位于非編碼區(qū)的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）。此外，篩選出與DECs 有關(guān)系的基因中，在上述3 組DEGs 中出現(xiàn)過的基因只有LDB2 和PREX1，而重疊DEGs 中沒有篩選出與DECs 相關(guān)的基因。前30 個差異最顯著的DECs 的位置和相應(yīng)的基因見表4。

表4 根據(jù)P 值排列的前30 個最顯著的DECs 及其位置Tab 4 Top 30 most significant DECs according to P value and their position and corresponding genes

2.2 功能通路富集

對DEGs 進行功能和通路富集分析，共得到32 個通路，包括23 個生物過程、6 個細胞組分、1 個分子功能、1 個KEGG 通路和1 個RACTOME 通路（圖2）。從結(jié)果中可以看出大部分DEGs 顯著富集于系統(tǒng)發(fā)育、遷移調(diào)控、心率調(diào)控、血壓調(diào)控等生物學(xué)過程，主要富集于GPCR 及刺激神經(jīng)組織的受體配體相互作用信號通路。此外，富集到通路中最多的基因分別為S1PR1、EDN1 和ACVRL1，分別富集在24、24 和23 個通路中。

圖2 重疊DEGs 富集的GO 和通路Fig 2 Enriched GO and pathway terms of the overlapped DEGs

2.3 DEMs 的靶標預(yù)測

根據(jù)芯片數(shù)據(jù)得到了24 個DEMs，并篩選出DEMs的靶基因，僅保留為DEGs 關(guān)系對的靶向基因。由此篩選出612 對miRNA-基因關(guān)系對，其中303 對為負調(diào)控。

2.4 重疊DEGs 與DEMs 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)過String 數(shù)據(jù)庫分析，共鑒定出得分在400 分以上的19 對蛋白-蛋白相互作用對，涉及19 個重疊DEGs，EDNRB-EDN1、RAMP2-VIPR1 和RAMP3-VIPR1 是 打 分最高的3 個關(guān)系對（分別為997、947 和947 分）?；?9 個蛋白-蛋白對和以上303 個負調(diào)控的miRNA-基因?qū)?gòu)建了調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖3），其中，hsa-mir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和ADRA1A 的節(jié)點度最高，被認為是潛在的生物標志物。

2.5 DEGs 的驗證

在TCGA 數(shù)據(jù)庫中共篩選出1 175 個DEGs，并與癌旁組織進行比較，其中412 例上調(diào)，763 例下調(diào)。這些基因中有55 個基因（10 個上調(diào)，45 個下調(diào)）與上述的重疊DEGs（表2）相同并具有同樣的表達趨勢。其余6 個未鑒定的基因分別為TOX3、EDN1、SPDEF、FAM83A、FGFBP2 和COMP，說明本研究所鑒定的DEGs 是可靠的。此外，SFTPC、ITLN2 和SLC6A4 的表達量較高，且在2 組DEGs 中均具有顯著差異。因此，選擇SFTPC、ITLN2 和SLC6A4 作為潛在的標志物。

關(guān)鍵基因SFTPC、ITLN2、SLC6A4、hsa-mir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和ADRA1A 的表達水平與患者總生存期和腫瘤分期間的相關(guān)性見表5。相關(guān)系數(shù)用來衡量2 個數(shù)據(jù)集合的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)的絕對值越大，相關(guān)性越強。

圖3 重疊DEGs 和DEMs 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Regulated network of overlapped DEGs and DEMs

經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，上述6 個基因中hsa-mir-191-3p 的表達與患者的腫瘤分期顯著相關(guān)（P=0.005），其相關(guān)系數(shù)為正，說明基因的表達水平與腫瘤分期呈正相關(guān)；其他基因的表達與患者的總生存期和腫瘤分期間均無相關(guān)性（P>0.05）。

表5 SFTPC、ITLN2、SLC6A4、ADRA1A、hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 表達與總生存期和腫瘤分期的相關(guān)性Tab 5 Correlation of SFTPC, ITLN2, SLC6A4, ADRA1A, hsa-mir-141-5p and hsamir-191-3p expression with overall survival and tumor stage

RT-qPCR 結(jié) 果 如 圖4 所 示。癌 組 織 中SFTPC 和SLC6A4 的表達水平明顯低于癌旁組織，而hsa-mir-141-5p和hsa-mir-191-3p 的表達水平明顯升高（P<0.05）。ITLN2和ADRA1A 在癌組織中的表達水平雖然與癌旁組織存在差異，但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。EGFR 在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，血清中CEA 和NSE 的表達水平分別為5.36 μg/L 和14.69 U/mL。

圖4 肺腺癌組織和癌旁組織中SFTPC、ITLN2、SLC6A4、ADRA1A、hsamir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和EGFR 的相對表達水平Fig 4 Relative expression levels of SFTPC, ITLN2, SLC6A4, ADRA1A, hsa-mir-141-5p, hsa-mir-191-3p and EGFR in lung adenocarcinoma tissues and paracancer tissues

3 討論

GEO 數(shù)據(jù)庫是由美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建并維護的基因表達數(shù)據(jù)庫，其中收錄了世界各國研究機構(gòu)提交的高通量基因表達數(shù)據(jù)。GEO 數(shù)據(jù)庫的設(shè)計初衷是為了收集整理各種基因表達芯片數(shù)據(jù)，后來陸續(xù)加入了甲基化芯片、lncRNA、miRNA、CNV 芯片等各種芯片，甚至高通量測序數(shù)據(jù)。在本研究中，從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載了3 個基因表達譜、1 個miRNA 表達譜和1 個circRNA表達譜，通過差異表達分析、功能富集分析、miRNA-基因關(guān)系對篩選以及綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，最終篩選出hsamiR-141-5p、hsa-miR-191-3p、ADRA1A、SFTPC、ITLN2和SLC6A4 為肺腺癌潛在的標志物。

hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 在肺癌中的作用尚不清楚，只有少數(shù)研究揭示了它們在其他癌癥中的潛在作 用。Wang 等[14]確 定 了10 個mRNA（hsa-mir-141-5p、hsa-mir-1271-5p、hsa-mir-574-3p 等），對 人 類 卵 巢 癌 組織和正常組織的敏感度和特異度分別為97%和92%。Plieskatt 等[15]報道了hsa-mir-141-5p 和其他miRNA 結(jié)合與viverrini 感染的膽管癌亞型有關(guān)。Wu 等[16]發(fā)現(xiàn)與非侵襲性垂體腺瘤相比，hsa-mir-191-3p 在侵襲性垂體腺瘤中的表達上調(diào)。ADRA1A 在精神分裂癥患者中受到廣泛關(guān)注，它是導(dǎo)致更嚴重代謝異常的危險因素[17]。在腫瘤中，ADRA1A 是一種抑癌基因；與老年肝癌患者相比，年輕肝癌患者中ADRA1A 含量較少[18]。此外，ADRA1A 在子宮內(nèi)膜癌患者外周血中高表達，ADRA1A 的表達與國際婦產(chǎn)科協(xié)會（FIGO）分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，血清ADRA1A 的表達可用于評估生存率，并可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-mir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和ADRA1A 可能在肺腺癌中發(fā)揮一定的作用，并且調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進一步提供了可能的調(diào)控對，例如hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 可能通過靶向ADRA1A 發(fā)揮作用。

表面活性蛋白C（surfactant protein C，SFTPC）在肺癌中的研究已經(jīng)取得了一定的成果。它是肺表面活性物質(zhì)蛋白之一，與肺細胞的分化有關(guān)[19]。Saintigny 等[20]認為SFTPC 在肺腺癌組織中下調(diào)，與本研究結(jié)果一致。2014年的一項研究[21]表明，SFTPC 的表達與NSCLC 較短的總生存期顯著相關(guān)。SLC6A4 是5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因，其表達或甲基化與抑郁癥的發(fā)生、表型及預(yù)后密切相關(guān)[22-23]。同時，SLC6A4 變異與結(jié)直腸癌患者的低生存率相關(guān)[24]。此外，SLC6A4 變異是慢性阻塞性肺病合并肺癌的風(fēng)險因素[25]。然而，并沒有發(fā)現(xiàn)另一潛在標志物ITLN2 在肺癌中的作用。在本研究中，與正常組織相比，SFTPC、ITLN2和SLC6A4 在肺組織中的表達有顯著變化，提示它們可能在肺腺癌中起一定作用，但尚需實驗室和臨床證實，這也是我們下一步要開展的工作。

我們也試圖從circRNA 表達水平揭示肺腺癌的相關(guān)機制，并獲得了一些DECs。然而，只鑒定了3 組DECs中2 個相應(yīng)的基因LDB2 和PREX1，而沒有發(fā)現(xiàn)重疊的DECs。因此，推測circRNAs 的表達可能具時空特異性，可能與肺腺癌無關(guān)，具體原因尚需進一步研究。

在本研究中，對于從GEO 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的重疊DEGs，通過TCGA 數(shù)據(jù)庫進行了驗證。TCGA 數(shù)據(jù)庫是由美國國家癌癥研究所和美國人類基因組研究所聯(lián)合啟動的一個項目。作為目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，TCGA 收錄了各種人類癌癥的臨床數(shù)據(jù)、基因組變異、mRNA 和miRNA 表達以及甲基化等數(shù)據(jù)，是腫瘤研究中資源最豐富、數(shù)據(jù)最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫[26]。本研究得到的61 個重疊DEGs 中，大多數(shù)都在TCGA 數(shù)據(jù)庫中得到了驗證，因此被認為是準確和可信的。只有6 個基因，即TOX3、EDN1、SPDEF、FAM83A、FGFBP2 和COMP 未被證實，它們在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中沒有起到關(guān)鍵作用。此外，我們 對TCGA 數(shù) 據(jù) 中SFTPC、ITLN2、SLC6A4、hsa-mir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和ADRA1A 的表達水平與患者總生存期和腫瘤分期進行了相關(guān)性研究，其中hsa-mir-191-3p與患者的分期間存在顯著相關(guān)性。這種相關(guān)性很可能反映了hsa-mir-191-3p 對腫瘤進展和細胞遷移的影響，有必要進行更多的研究，以進一步闡釋hsa-mir-191-3p 作為腫瘤分期標志物的有效性及其在腫瘤細胞行為中的作用。其他基因的表達水平與患者的總生存期和腫瘤分期間均無相關(guān)性，但在癌組織和癌旁組織中的表達存在顯著差異，說明這些基因在肺腺癌中的差異表達與患者的發(fā)病情況相關(guān)，與生存和預(yù)后無關(guān)。因此，這些基因在肺腺癌的臨床診斷和治療中可能具有潛在的應(yīng)用價值。

在對選定的分子標志物SFTPC、ITLN2、SLC6A4、hsa-mir-141-5p、hsa-mir-191-3p 和ADRA1A 進行驗證時，癌組織中SFTPC 和SLC6A4 的表達水平明顯高于癌旁組織，hsa-mir-141-5p 和hsa-mir-191-3p 的表達水平明顯降低，這些結(jié)果與上述生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。而ITLN2和ADRA1A 在癌組織中的表達水平雖然低于癌旁組織，但兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。芯片中的樣本來自各個國家和地區(qū)，包括白種人、亞洲人和非裔人群等，而本研究收集的病例大部分為本市患者，這種個體差異可能導(dǎo)致不同人群中基因表達水平的差異。因此，后續(xù)需要進一步進行臨床試驗，對所選的標志物進行驗證。此外，癌組織中EGFR 的表達水平明顯高于癌旁組織，這與以往的研究結(jié)果一致[27]。EGFR 是表皮生長因子受體家族成員之一，EGFR 信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用，EGFR 陽性肺癌患者的生存期明顯短于EGFR 陰性患者[28]。CEA 和NSE 是肺癌中常用的腫瘤標志物，在正常人體中的水平分別低于5.0 μg/L 和12.5 U/mL，在臨床中經(jīng)常可以發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血清CEA 及NSE水平升高[29]。本研究中檢測結(jié)果顯示CEA 和NSE 在肺腺癌患者中的表達水平分別為5.36 μg/L 和14.69 U/mL，這與以往的研究結(jié)果一致。

在本研究中，轉(zhuǎn)錄組測序和分析應(yīng)用于識別重要的miRNA 和與轉(zhuǎn)錄組測序相關(guān)的基因。ADRA1A、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-191-3p、SFTPC、ITLN2 和SLC6A4 可能是肺腺癌的潛在標志物。此外，以上6 個基因組合在臨床檢測中可能具有更高的準確度、敏感度及特異度，為肺腺癌的早期診斷和靶向治療提供了理論依據(jù)和潛在的研究方向。然而，這些生物標志物的篩選僅僅是通過生物信息學(xué)分析，還需要更多的臨床試驗和更直接的證據(jù)進行驗證。

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