乙醇鈉預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料的組分及結(jié)構(gòu)特性*

李 想 陳 妮 齊學(xué)敏 楚 杰 張軍華 常德龍 許雅雅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 楊凌 712100；2.國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心 鄭州 450003)

近年來，利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇備受矚目(Talebniaetal.，2010；J?rgensenetal.，2007；Himmeletal.，2007；Snchezetal.，2008)。預(yù)處理是木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵步驟(Zhuetal.，2009)，其直接影響木質(zhì)纖維素的水解效率和燃料乙醇的生產(chǎn)成本，研發(fā)高效、低成本的預(yù)處理技術(shù)，能夠與其他生物煉制操作結(jié)合并降低環(huán)境污染，對于可持續(xù)生物精煉，整合生產(chǎn)食品、飼料、化學(xué)品、材料、商品和燃料的發(fā)展具有重大意義(祝其麗等，2015；亓偉等，2013；董浩亮，2015；劉芳，2015)。我國木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)量很高，但由于預(yù)處理技術(shù)尚不成熟，限制了其高值化利用(賀文明等，2010)。目前，國內(nèi)外對木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理方法主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法，其目的旨在優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化效率預(yù)處理時間、溫度以及預(yù)處理化學(xué)試劑的選擇等因素，對預(yù)處理效果具有非常大的影響。高效經(jīng)濟的預(yù)處理方法應(yīng)滿足以下六大點要求：1) 能夠打破木質(zhì)纖維素的三維結(jié)構(gòu)，降低其分子聚合度和纖維素結(jié)晶度；2) 增加材料的表面積和孔隙率；3) 產(chǎn)生高度可消化的預(yù)處理固體且在水解后促進糖產(chǎn)率(纖維素轉(zhuǎn)化產(chǎn)率大于90%)；4) 避免形成發(fā)酵抑制劑化合物(特別是乙酸)；5) 便于半纖維素和木質(zhì)素回收；6) 能源、化學(xué)品和水的投入少，并使用簡單、規(guī)模合理和低成本的反應(yīng)堆(孫宗蘋等，2012)。

本研究以3種常見木質(zhì)纖維素原料——針葉材松木(Pinus)、杉木(Cunninghamialanceolata)和闊葉材水曲柳(Fraxinusmandschurica)為研究對象，采用乙醇鈉進行預(yù)處理，并對預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料的主要化學(xué)組分變化及結(jié)構(gòu)特性進行分析，力求獲得纖維素組分含量大、除木素效果好的高效益預(yù)處理方法，以提高木質(zhì)纖維素原料的酶水解效率，為纖維素原料制備生物乙醇燃料的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

水曲柳、松木樣品購自陜西中興林產(chǎn)有限公司，杉木樣品由芬蘭LUKE公司提供。3種原料經(jīng)干燥、剪切、烘干后粉碎機粉碎，過80目篩網(wǎng)，裝入自封袋并標(biāo)記名稱日期等，冰箱冷藏待用。

試驗中使用的乙醇鈉、H2SO4、碳酸鈣、溴化鉀、乙醇等均為分析純。預(yù)處理及化學(xué)組分測定所用儀器包括水浴鍋、電子天平、真空泵、干燥箱、離心機、紫外可見分光光度計、振蕩器、粉碎機、高壓滅菌鍋等；葡萄糖、木糖含量使用高效液相色譜(HPLC)進行檢測。

1.2 原料預(yù)處理

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的乙醇鈉溶液500 mL，分別稱取松木、杉木、水曲柳3種干物質(zhì)原料10 g于燒口瓶中，加入120 mL配好的乙醇鈉溶液，擰緊瓶蓋，置于高壓滅菌鍋中進行預(yù)處理，預(yù)處理參數(shù)參考Yang等(2010)，具體反應(yīng)條件見表1。反應(yīng)完成后用蒸餾水將原料洗至中性烘干備用。

表1 原料預(yù)處理試驗方案①Tab.1 Test scheme for raw material pretreatment

①1、2、3分別代表松木、杉木、水曲柳；料液比為1∶10。1,2,3 represent separatelyPinus，CunninghamialanceolataandFraxinusmandschurica.The ratio of material to liquid is 1∶10.

1.3 主要化學(xué)組分測定

松木、杉木、水曲柳樣品三大素含量測定參照美國能源部(NREL)方法。

1.3.1 纖維素、木聚糖含量測定 精確稱取0.3 g預(yù)處理樣品(未處理樣品用苯醇進行索式抽提，以去除樹脂、色素等)于100 mL旋蓋燒口瓶中，加入3 mL 72% H2SO4，混合均勻后在(30±3) ℃水浴中保溫1 h，期間每隔10 min震蕩搖勻1次。向瓶中加入84 mL蒸餾水，即將H2SO4溶液濃度稀釋至4%，擰緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃水解1 h。水解完成后用已稱質(zhì)量的G3砂芯漏斗真空抽濾，分離殘渣和水解液。一部分水解液用于測定酸溶木質(zhì)素，另一部分用CaCO3中和至中性，采用高效液相色譜(HPLC，HITACHI L-2000)分析葡萄糖、木糖含量，分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87P，300 mm×7.8 mm(長×直徑)，保護柱為Cation-H Refill Cartridges，30 mm×4.6 mm(長×直徑)，檢測器為RID示差折光檢測器。進樣量20 μL，流動相為0.005 mmol·L-1的H2SO4，流速0.5 mL·min-1，柱溫45 ℃。儀器檢測結(jié)果為水解液單糖含量，六碳糖乘以0.9、五碳糖乘以0.88即可換算出樣品中纖維素和木聚糖含量。

1.3.2 木質(zhì)素含量測定 木質(zhì)素包括酸溶木質(zhì)素和酸不溶木質(zhì)素2部分。酸不溶木質(zhì)素測定采用稱量法，稱取樣本1 g，用72% H2SO4處理1 h后，固液分離，固體部分即為酸不溶木質(zhì)素和灰分。固體部分在(103±2) ℃下干燥后稱質(zhì)量，得到酸不溶殘渣的總質(zhì)量。采用智能干燥箱將固體殘渣在575 ℃下連續(xù)加熱4 h，稱量，得到灰分含量，酸不溶殘渣與灰分質(zhì)量之差即為酸不溶木質(zhì)素含量。

酸溶木質(zhì)素測定采用紫外光譜法(UV法)，首先制備氯化鋰/二甲基亞砜(LiCl/DMSO)溶劑，DMSO溶液中加入8%烘干的LiCl，常溫連續(xù)磁化攪拌，將1.0%的原料溶解在LiCl/DMSO溶劑中攪拌5天后，倒入紫外線石英比色皿中(尺寸45 mm×12.5 mm×12.5 mm)，在400～800 nm范圍內(nèi)，通過紫外分光光度計(吸收值)測量酸溶木質(zhì)素含量。

酸溶木質(zhì)素含量(ASL)采用下式計算：

(1)

式中：N為稀釋倍數(shù)；A為紫外吸收值(240 nm)；V為濾液吸收總體積；W為酸解前樣品絕干質(zhì)量。

1.4 FTIR紅外光譜圖像采集

紅外光譜分析采用尼高力紅外光譜儀(Nicolet FTIR IS10)，測試波長范圍400～4 000 cm-1，光譜分辨率32 cm-1，掃描次數(shù)64次，使用壓片法進行測定。

1.5 結(jié)晶區(qū)主要參數(shù)計算

由木材纖維波譜學(xué)特征可知，002峰和040峰反映的是纖維素結(jié)晶區(qū)的長度和寬度。大多數(shù)情況下，040峰不明顯，所以本研究采用002峰的衍射強度和位置計算結(jié)晶區(qū)的變化情況。利用Segal(1959)公式計算：

(2)

式中：CrI為相對結(jié)晶度(%)；I002為002 晶格衍射角(2θ)的極大強度；Iam為非結(jié)晶散射強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理前后原料的主要化學(xué)組分分析

通過NREL方法測定原料預(yù)處理前后化學(xué)組成，可得出原料中纖維素、木聚糖、木質(zhì)素的含量變化。由表2可知，經(jīng)乙醇鈉預(yù)處理后，3種原料的纖維素、木聚糖含量均有所增加，纖維素含量增加幅度較木聚糖大，而木質(zhì)素含量則相對減少。纖維素含量增加幅度最大的是預(yù)處理杉木，增加量為7.6%，其次是預(yù)處理松木，增加量為5.9%，最差的是水曲柳，增加幅度僅為3.4%，這可能是因為3種木材的軟硬材質(zhì)等不同導(dǎo)致的，杉木材質(zhì)最軟，松木次之，水曲柳最為堅硬。此外，3種原料的木聚糖含量均有所增加，但增加幅度不大。

2.2 預(yù)處理前后原料的紅外光譜特征及分析

松木、杉木和水曲柳作為生物質(zhì)原料，主要化學(xué)組分中三大素經(jīng)乙醇鈉預(yù)處理后，成分含量會發(fā)生一些變化，因此在紅外光譜上會出現(xiàn)一些吸收改變。將乙醇鈉預(yù)處理后各材料紅外吸收峰的細微變化與未處理材料進行比對，分析化學(xué)成分官能團結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果見表3。

表2 乙醇鈉預(yù)處理前后原料化學(xué)組分Tab.2 Main chemical component measurements by C2H5 ONa pretreatment conditions %

表3 紅外光譜的特征峰及歸屬Tab.3 Functional groups absorption band of infrared spectra of cellulose

圖1 預(yù)處理前后水曲柳傅里葉變換紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of pretreated and native F.mandschurica

處是苯環(huán)骨架結(jié)合C—H在平面變形伸縮振動；1 372 cm-1處屬于脂肪族在甲基中和酚羥基上的C—H伸縮振動；1 249 cm-1處是木質(zhì)素酚醚鍵C—O—C伸縮振動；1 049 cm-1處是在仲醇和脂肪醚中的C—O變形(秦特夫等，2010)。

纖維素的特征吸收峰2 921和3 412 cm-1處(黃安民等，2007)，乙醇鈉處理和未處理水曲柳得到的光譜變化明顯，表明纖維素含量發(fā)生變化，乙醇鈉預(yù)處理水曲柳纖維素含量增加，與組分分析結(jié)果一致。

乙醇鈉預(yù)處理前后杉木在1 048 cm-1處出現(xiàn)羥基的O—H伸縮振動，說明纖維素含量有所變化，通過對比分析得出，乙醇鈉預(yù)處理杉木纖維素含量明顯增多，與組分中纖維素含量增多一致。1 636 cm-1附近的吸收峰在乙醇鈉預(yù)處理后光譜變緩，木質(zhì)素含量呈減少趨勢。

圖3 預(yù)處理前后松木傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of pretreated and native Pinus

木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中含有眾多復(fù)雜的官能團，1 636 cm-1和1 420 cm-1附近，處理與未處理的波段變化趨勢不是十分明顯，說明乙醇鈉預(yù)處理對松木的木質(zhì)素脫除效果并不十分理想。纖維素的特征吸收峰3 408 cm-1處，處理與未處理原料得到的光譜有一定差異，乙醇鈉預(yù)處理的松木纖維素含量增加。

2.3 預(yù)處理前后原料的纖維素結(jié)晶度分析

針對6組不同檢測樣本，通過XRD 掃描處理后，可得到明顯的002峰位置及其衍射強度變化，如圖4所示。

由圖4可以看出，101、002和 040峰衍射角分別為16.02°、22.50°和34.76° 左右，這是典型的纖維素Ⅰ的特征。2θ的變化范圍從21.26°到 22.86°，反映出經(jīng)過預(yù)處理后002晶面衍射峰位置發(fā)生顯著變化。曲線e峰形尖銳程度較大，說明經(jīng)過預(yù)處理后結(jié)晶區(qū)晶胞參數(shù)變小，晶面間距變小，預(yù)處理后材料結(jié)晶間距變小對于提高材料的尺寸穩(wěn)定性有很強的參考利用價值。該結(jié)果與以往研究具有一致性(Nishimiyaetal.，1998)。

圖4 預(yù)處理前后樣品002峰位置變化及其衍射強度變化Fig.4 Changes of 002 peak position and diffraction intensity of samples before and after pretreatment

根據(jù)002晶面結(jié)晶指數(shù)式(2)得出結(jié)晶參數(shù)變化情況，如表4所示。

較低的結(jié)晶度指數(shù)CrI表明在總體樣品中存在較高比例的纖維素?zé)o定型物質(zhì)，如半纖維素和木質(zhì)素等。由表4可以看出，經(jīng)過一定的預(yù)處理過程，移除了部分非結(jié)晶物質(zhì)，使得纖維素含量比例相對增加。預(yù)處理杉木的相對結(jié)晶度高于松木和水曲柳，說明預(yù)處理后杉木的纖維素含量比例增加最大，松木和水曲柳次之。

表4 預(yù)處理前后樣品的結(jié)晶度變化Tab.4 Changes in crystallinity of pretreated and native material

基于以往研究中紅外光譜吸收帶的峰強比，1 428 cm-1和896 cm-1峰強之比，3 338 cm-1和1 336 cm-1峰強之比，計算結(jié)晶度指數(shù)(LOI)和氫鍵強度指數(shù)HBI(Nishimiyaetal.，1998)。一般來說，LOI變化反映晶體區(qū)域和非晶態(tài)區(qū)域量的變化，HBI變化反映纖維素內(nèi)部結(jié)晶變化。乙醇鈉預(yù)處理后樣品的LOI相對于對照樣均有所提高，說明乙醇鈉預(yù)處理提高了木質(zhì)纖維素原料的相對結(jié)晶度，與相關(guān)學(xué)者研究結(jié)果一致(Yangetal.，2010)。

結(jié)晶度變化的原因在于，經(jīng)過堿處理后，細胞壁的吸附力增強，細胞壁結(jié)晶區(qū)表面纖維素分子鏈中的低聚糖被溶出，且無定型區(qū)的活性基團裸露，半纖維素與弱堿發(fā)生剝皮反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)晶度變化，與Tamura 等(2003)的研究結(jié)果一致。

2.4預(yù)處理前后原料的酶解特性

為了進一步驗證預(yù)處理效果，分別采用10、20、30 fpu CTEC2 二代酶作為3種濃度梯度對比葡萄糖和木聚糖水解得率變化情況。由圖5可知：1) 水解處理后預(yù)處理原料的纖維素、木聚糖含量存在不同水平的變動，10、20、30 fpu的二代酶都能在72 h很好地酶解預(yù)處理原料；2) 3種濃度的二代酶都能達到酶解預(yù)處理原料的目的，30 fpu的二代酶處理對預(yù)處理原料的效果最好。此外，在30 fpu二代酶解條件下選用48 h和72 h作為酶水解的時間點，分析原料纖維素和木聚糖得率變化情況(圖6)，葡萄糖和木聚糖的水解得率由大到小依次為預(yù)處理杉木>預(yù)處理松木>預(yù)處理水曲柳。

圖5 酶梯度對比葡萄糖和木聚糖水解得率變化Fig.5 72 h，10,20,30 fpu CTEC2 two generation enzyme treatment raw materials glucose and xylan yield histogramA.10 fpu葡萄糖Glucose(10 fpu);B.20 fpu葡萄糖Glucose(20 fpu);C.30 fpu葡萄糖Glucose(30 fpu);D.10 fpu木聚糖Xylan(10 fpu);E.20 fpu木聚糖Xylan(20 fpu);F.30 fpu木聚糖Xylan(30 fpu).

圖6 時間點對比二代酶處理原料葡萄糖和木聚糖得率變化Fig.6 Histogram of yield change of glucose and xylan from raw materials treated by 48 h and 72 h 30 fpu two generation enzymesA.72 h木聚糖Xylan(72 h)；B.48 h木聚糖Xylan(48 h)；C.72 h葡萄糖Glucose(72 h)；D.48 h葡萄糖Glucose(48 h).

3 討論

乙醇鈉作為一種典型的醇鹽，具強堿性。乙醇鈉水解生成氫氧化鈉和乙醇(C2H5ONa + H2O → C2H5OH + NaOH)，經(jīng)乙醇鈉預(yù)處理后，松木、杉木、水曲柳的三大素含量均有不同程度變化，其中乙醇鈉預(yù)處理杉木纖維素含量提高最多，松木次之，水曲柳較低；從除木質(zhì)素效果看，松木的預(yù)處理效果較好，木質(zhì)素含量相對降低6.1%，針葉材的乙醇鈉預(yù)處理體系處理效果較好。本結(jié)果與以往研究結(jié)論(Talebniaetal.，2010)一致，可為后續(xù)學(xué)者進行乙醇鈉相關(guān)預(yù)處理研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

1) 經(jīng)過一定預(yù)處理過程，移除了部分非結(jié)晶物質(zhì)，使得纖維素含量比例相對增加。預(yù)處理杉木的相對結(jié)晶度高于松木和水曲柳，說明預(yù)處理后杉木的纖維素含量比例增加最大，松木和水曲柳次之。

2) 水解處理后預(yù)處理原料的纖維素、木聚糖含量都有不同水平的變動，10、20、30 fpu的二代酶都能在72 h很好地酶解預(yù)處理原料。3種含量的二代酶效果都達到酶解預(yù)處理原料的目的，但是30 fpu的二代酶處理對預(yù)處理原料的效果最好。在30 fpu二代酶解條件下選用48 h和72 h作為酶水解的時間點變化，葡萄糖和木聚糖的水解得率由大到小依次為預(yù)處理杉木>預(yù)處理松木>預(yù)處理水曲柳。