青藤堿對腦出血大鼠腦水腫及炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響#

雷皓尹 楊菲 殷曉珮 何毅 章卓

·基礎(chǔ)論著·

青藤堿對腦出血大鼠腦水腫及炎癥因子IL-1β和TNF-α的影響#

雷皓尹*1楊菲2殷曉珮何毅4章卓5△

（1. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2016級中藥學(xué)，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2016級藥學(xué)，四川 瀘州 646000；3. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院2017級藥學(xué)，四川 瀘州 646000；4. 西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科，四川 瀘州 646000；5. 西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州 646000）

研究青藤堿對腦出血大鼠模型腦水腫及炎癥因子表達影響。將60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，腦出血模型組，青藤堿低劑量組、中劑量組、高劑量組以及陽性對照組（n=10）。除假手術(shù)組外，各組大鼠均腦內(nèi)尾狀核注射凝血酶Ⅶ 0.5 U誘發(fā)腦出血模型。假手術(shù)組和腦出血模型組給予生理鹽水灌胃2 ml?次-1，青藤堿各劑量組分別按青藤堿50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1灌胃，陽性對照組給予地塞米松0.75 mg?kg-1灌胃，各組大鼠在造模前和造模后各連續(xù)給藥3 d，一天一次。采用改良Longa分級法在造模后24 h和72 h測評大鼠神經(jīng)功能，術(shù)后78 h處死大鼠。采用干濕重法檢測腦組織含水量，ELISA法檢測腦組織和血清中白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α水平。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評分，腦組織含水量以及IL-1β和TNF-α表達均明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，青藤堿各劑量組可顯著降低大鼠神經(jīng)功能評分，腦組織含水量和IL-1β和TNF-α表達（P<0.05）。青藤堿明顯減輕腦出血大鼠腦水腫，其可能與減少炎癥因子IL-1β和TNF-α表達有關(guān)。

青藤堿；腦水腫；炎癥因子

腦出血急性期病死率高達30%～40%，是威脅人類健康的腦血管疾病之一。腦出血后引起腦組織明顯的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血腦屏障嚴重破壞進而形成腦水腫，因此如何消除腦出血患者腦水腫和炎癥反應(yīng)一直是研究熱點[1]。

白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）是一種具有多向性生物功能的炎癥介質(zhì)，血清中IL-1β水平顯著升高是腦出血后炎癥反應(yīng)重要標志之一。IL-1β與腦出血后腦水腫程度呈正相關(guān)，其機制可能與通過刺激膠質(zhì)細胞釋放其他細胞因子和黏附因子、直接破壞血腦屏障，增加其通透性有關(guān)，加重外周白細胞浸潤等有關(guān)[2,3]。腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）是一種多肽類細胞因子，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，正常水平的TNF-α維持多種細胞的分化和成活，而病理情況是機體炎癥及免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，與腦出血后繼發(fā)性腦損害密切相關(guān)[4]。阻斷或抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的大量釋放，可有效控制腦出血后炎癥反應(yīng)，以達到減輕腦水腫，進而減輕腦出血后病理損傷的目的，為臨床提供可行治療策略。

青風(fēng)藤為防己科植物青藤或毛青藤的藤莖，有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、活血、利水的功效。青藤堿是從青風(fēng)藤提取出的生物堿單體，可降低IL-1β，TNF-α等炎癥因子的含量，已被廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]，但青風(fēng)藤是否通過抑制IL-1β，TNF-α等炎癥因子表達減輕腦出血導(dǎo)致的腦水腫或其他繼發(fā)性損傷尚不清楚。

本研究通過觀察青藤堿對腦出血大鼠模型腦水腫及相關(guān)炎癥因子表達影響，為青藤堿防治腦出血水腫提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒（購自武漢艾美捷科技有限公司）；SD大鼠（購自西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-17），凝血酶Ⅶ（購自Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 腦出血模型制備

采用腦內(nèi)尾狀核注射凝血酶Ⅶ誘發(fā)尾殼核出血建立大鼠腦出血模型。SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛2 mg?kg-1麻醉后，以腦立體定位儀定位前囟后約1 mm，矢狀線右側(cè)3 mm處，勻速注射膠原酶Ⅶ 0.5 U（5 μl，進針深度6 mm，推注時間5 min，留針10 min，出針5 min）。

1.2.2 分組

60只SD大鼠，雌雄各半，隨機分為假手術(shù)組，腦出血模型組，青藤堿低劑量組（50 mg?kg-1，灌胃），青藤堿中劑量組（100 mg?kg-1，灌胃），青藤堿高劑量組（200 mg?kg-1，灌胃）、陽性對照組（地塞米松0.75 mg?kg-1，灌胃）。

除假手術(shù)組外，各組大鼠均采用1.2.1的方法建立腦出血模型；假手術(shù)組大鼠操作同腦出血模型組，但僅注射等量無菌生理鹽水。造模前各藥物處理組大鼠分別連續(xù)給予相應(yīng)藥物3 d，并于造模后12 h繼續(xù)給藥3 d[6]。假手術(shù)組和腦出血模型組則每天給予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3 神經(jīng)功能評定

神經(jīng)功能評定采用改良Longa分級法。0分為無神經(jīng)缺陷癥狀；1分為不能伸展手術(shù)對側(cè)前肢；2分為手術(shù)對側(cè)前肢屈曲；3分為輕度向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分為嚴重向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈；5分為向手術(shù)對側(cè)跌倒。2分以上模型成功。術(shù)后24 h和72 h評分。

1.2.4 腦組織含水量測定

造模后第3 d和最后一次給藥后6 h（術(shù)后78 h），通過頸椎脫臼處死大鼠，采用干濕重法測定腦出血灶周圍腦組織含水量：去除額極后，取病變側(cè)2 mm×2 mm厚腦組織測定其含水量。腦組織濕重表示為A；將腦組織用錫紙包裹，放入烤箱內(nèi)100℃烘干24 h后取出，稱出干重為B；腦組織含水量=（A-B）/A×100％。

1.2.5 ELISA法檢測腦組織和血漿中IL-1β、TNF-α含量

處死前取大鼠腹主動脈血2 ml，3000轉(zhuǎn)?min-1離心3min后放于4℃冷藏備用。之后頸椎脫臼法處死大鼠，剝?nèi)∽⑸洳课恢車X組織50 mg置于4℃冷藏備用。按ELISA說明書操作，以酶標儀測定腦組織和血漿樣本在波長為450 nm 時的OD值，繪制標準曲線，計算IL-1β和TNF-α含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠模型神經(jīng)功能評定

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能未見異常，評分為0；腦出血模型組大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能障礙，Longa評分與假手術(shù)組相比明顯增高（P<0.01）。青藤堿各劑量組和陽性對照組大鼠在術(shù)后24 h以及72 h的Longa評分均明顯低于腦出血模型組（P<0.01），具有明顯降低神經(jīng)功能損傷的作用，見圖1。

圖1 術(shù)后24 h、72 h大鼠Longa神經(jīng)功能評分

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

2.2 青藤堿干預(yù)后腦組織含水量測定

模型組大鼠腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），青藤堿各劑量組和陽性對照組腦組織含水量則明顯低于模型組（P<0.05），見圖2。

2.3 青藤堿干預(yù)后腦組織與血漿IL-1β和TNF-α含量測定

模型組大鼠腦組織和血漿中IL-1β和TNF-α含量均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05），而青藤堿各劑量和陽性藥均可明顯降低模型大鼠腦組織和血漿中IL-1β和TNF-α含量（P<0.01），具有抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α表達作用，見圖3。

3 討論

腦出血是一種嚴重的致死性疾病，腦水腫以及繼發(fā)性損傷是其致死原因之一。炎癥反應(yīng)癥致使血腦屏障被破壞，形成嚴重腦水腫以及繼發(fā)性損傷。炎癥本身是對各種損傷因子刺激所發(fā)生的防御性病理過程，但炎癥反應(yīng)除了防御外，對機體也會產(chǎn)生破壞作用，比如釋放多種酶及炎癥介質(zhì)就會加重局部組織的水腫和神經(jīng)細胞的破壞[7]。腦出血后血腫及其周圍腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展是造成繼發(fā)性腦損傷的主要原因之一[8]。因此在腦出血急性期, 采用抗炎治療可明顯減輕腦水腫的產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)中IL-1β和TNF-α是重要的炎癥因子和炎癥反應(yīng)重要標志之一，腦出血后IL-1β和TNF-α釋放增多，刺激膠質(zhì)細胞釋放其他細胞因子和黏附因子促進炎癥反應(yīng)，破壞血腦屏障，增加其通透性，促進腦損傷的發(fā)展[9]。

圖2 青藤堿干預(yù)后大鼠腦組織含水量比較

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，# P＜0.05。

圖3 青藤堿對腦出血大鼠腦組織與血漿IL-1β和TNF-α含量影響（pg·mL-1）

注：A. 腦組織IL-1β；B. 腦組織TNF-α；C. 血漿IL-1β；D. 血漿TNF-α。*與假手術(shù)組相比， P＜0.05；#與模型組相比， P＜0.05；##與模型組相比P＜0.01。

青藤堿可被用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，具有降低TNF-α等炎癥因子含量，降低發(fā)病率的功效[10]，本研究通過尾狀核內(nèi)內(nèi)注射膠原酶Ⅶ0.5 U建立大鼠腦出血模型，結(jié)果顯示模型組大鼠在模型建立后3 d，神經(jīng)功能明顯下降，Longa評分均在4分以上，提示造模成功。地塞米松因具有強大的抗炎作用，能緩解腦水腫，故作為陽性對照藥物用于本次研究。另外本次研究發(fā)現(xiàn)，采用灌胃方式給予大鼠不同劑量青風(fēng)藤治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦干濕比重明顯低于模型組，提示此藥物具有減輕腦水腫的作用。同時，模型組大鼠腦組織和血漿中炎癥因子TNF-α與IL-1β水平明顯增加，青藤堿各劑量組大鼠腦組織和血漿中TNF-α與IL-1β水平均顯著下降，提示青藤堿有減少炎癥因子釋放作用。

綜上，青藤堿具有抑制腦出血模型大鼠腦水腫，減少炎癥因子釋放的作用，但本研究僅分析了青藤堿對炎癥因子影響，對于具體的藥物作用機制和信號通路值得進一步研究。

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Effects of sinomenine on cerebral edema and levels of IL-1β and TNF-α in rat with cerebral hemorrhage#

Lei Hao-yin*1, Yang Fei2, Yin Xiao-bei3, He Yi4, Zhang Zhuo5△

(1. Chinese Pharmacy Major of 2016 Grade, Pharmacy College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan; 2. Pharmaceutical Major of 2016 Grade, Pharmacy College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan; 3. Pharmaceutical Major of 2017 Grade, Pharmacy College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan; 4. Department of Urology, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan; 5. Department of Pharmacology, Pharmacy College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan)

To evaluate the effects of sinomenine (SIN) on cerebral edema and inflammation cytokines levels in rats with cerebral hemorrhage.Sixty SD rats were randomly divided into the sham-operatedgroup, cerebral hemorrhage model group, SIN low dose group, SIN medium dose group, SIN high dose group, and the positive control group (n=10). Besides sham-operated group, cerebral hemorrhage were induced by injecting 0.5 U thrombin Ⅶ into the caudate nucleus of rats.. Rats in SIN treatment groups and positive control group were orally administrated SIN (50 mg?kg-1, 100 mg?kg-1and 200 mg?kg-1) and dexamethasone (0.75 mg?kg-1) once a day for six days, respectively. And rats in control group and cerebral hemorrhage model group were orally administrated the same volume of saline. After 24 h and 72 h of cerebral hemorrhage, the neurological function was evaluated by the modified Longa grading method and the water content of brain was measured by wet and dry ratio. The levels of interleukin-1 beta (IL-1β) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in brain tissue and serum were measured by ELISA.Compared with the sham-operated group, the score of neurological functions, water content of brain tissues and IL-1β and TNF-α levels of rats in model group were significantly increased (P<0.05), which were significantly decreased by SIN (P<0.05).SIN can alleviate cerebral edema in rats with cerebral hemorrhage via decreasing the IL-1β and TNF-α level.

Sinomenine; Brain edema; Inflammatory cytokines

（2019-11-7）

瀘州市-西南醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合項目（編號：2017LZXNYD-J32）；西南醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科研項目（編號：201816032056）

雷皓尹，男，西南醫(yī)科大學(xué)2016級中藥學(xué)專業(yè)學(xué)生，Email：354699170@qq. com；

章卓，男，教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究，Email：363041626@qq. com。