韓 悅 姚 煦

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,多見于兒童,常伴食物過敏、過敏性鼻炎和哮喘,患者劇烈瘙癢,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量,是皮膚科最受關(guān)注的疾病之一[1,2]。近20年世界范圍內(nèi)特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率迅速增高,西方發(fā)達(dá)國家兒童特應(yīng)性皮炎的發(fā)病率約為10%～20%[3]。近年報(bào)道我國多城市兒童特應(yīng)性皮炎發(fā)病率為12.94%。AD的發(fā)生與多種細(xì)胞息息相關(guān)，其中，角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KC)至關(guān)重要，其活化與炎癥在AD中扮演著關(guān)鍵性的角色。目前發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，故特應(yīng)性皮炎的治療仍非常困難[4]。因此,積極探索特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。

外泌體是活細(xì)胞分泌的來源于晚期核內(nèi)體的膜性囊泡，直徑約為30～150 nm[5]。它天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等體液中[6]。外泌體1980年首次被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式，如今隨著研究深入，外泌體運(yùn)輸功能，特異靶向受體細(xì)胞，交換蛋白和脂類或引發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)參與細(xì)胞間通訊等功能逐漸被揭示[7]。不同組織細(xì)胞來源的外泌體由于攜帶的蛋白質(zhì)不同，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[8]。外泌體除含有蛋白外，還含有各種非編碼RNA，如microRNAs等，參與基因的表達(dá)調(diào)控[9]。

目前為止，外泌體關(guān)于AD方面鮮有報(bào)道。因此我們嘗試通過檢測(cè)AD患者外周血中外泌體來研究其對(duì)KC的調(diào)控作用。此文基于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法擬探討AD患者外周血外泌體調(diào)控HaCaT細(xì)胞的活化及炎癥，為AD的診斷和發(fā)病機(jī)制提供一些理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 資料概況：本次臨床研究均獲受試者及其家屬知情并簽署知情同意書。選取2017年5月至2018年5月期間中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院就診的AD患者和同期健康人的外周血標(biāo)本各30例為研究對(duì)象，并記錄患者的年齡、性別。AD患者中位數(shù)年齡為17.04歲，男/女比例為1.14，健康人年齡中位數(shù)為21.63歲，男/女比例為1.31，所有外周血標(biāo)本均于清晨空腹采集。

納入標(biāo)準(zhǔn)： 符合AD的William診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡介于18～70歲，無其他嚴(yán)重疾病者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他皮膚病，心肝腎功能不全，臨床及隨訪資料不全。

1.2 exoEasy Maxi Kit試劑盒提取外泌體 預(yù)先過濾細(xì)胞培養(yǎng)上清，將大于0.8 μm的微粒全部除去，將buffer XBP加入到等體積樣品中，試管上下震蕩5次，室溫混合。將上述混合液結(jié)合在核酸純化柱上離心500 g 1 min，棄上清，將柱子復(fù)原至同一個(gè)接受管中。加入10 mL buffer XWP 5000 g離心5 min以去除殘余buffer，棄上清及接受管。轉(zhuǎn)移核酸純化柱至一個(gè)新的接受管。加入400 μL～1 mL bufferXE至膜上孵育1 min，離心500g 5 min，收集洗脫液。再次將洗脫液加入至exoEasy核酸純化膜中，并孵育1 min，離心5000 g 5 min，收集洗脫液轉(zhuǎn)移至凍存管，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外泌體驗(yàn)證

1.3.1 電鏡驗(yàn)證 外泌體戊二醛固定。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。鋨酸固定：加入0.5 mL 2%鋨酸溶液 4度固定2 h。清洗：用1 mL PBS清洗3次，每次靜置15 min。脫水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1 mL梯度脫水分別靜置15 min，再用1 mL 100%乙醇脫水2次，每次20 min。置換：用1 mL丙酮置換2次，每次靜置15 min。浸漬。包埋：將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中。聚合：將包埋板置于65℃條件下聚合48 h。染色：醋酸雙氧鈾染色10 min后清洗；醋酸鉛染色10 min后清洗。上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 外泌體粒徑分析(nanoparticle tracking analysis，NTA) 采用NTA檢測(cè)提取物粒徑大小，若介于30～200 nm之間，即為外泌體提取成功。

1.4 CCK-8法檢測(cè)HaCaT增殖 實(shí)驗(yàn)采用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)的增殖情況。將三組細(xì)胞調(diào)整至1.0×105/孔，取100 μL/孔在96孔板中接種，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入20 μL的CCK-8溶液(APExBIO，USA)，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，不用清洗，直接用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。每組設(shè)6個(gè)副孔，重復(fù)三次。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用0.25%胰酶消化細(xì)胞后血清終止消化，離心300 g 5 min收集細(xì)胞。用冰PBS清洗細(xì)胞一次，300 g離心5 min。加入300 μL的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞。加入5 μL的Annexin V-FITC(BD，USA)混勻后，避光，室溫孵育15 min。上機(jī)前5 min再加入5 μL的PI染色。

1.6 HaCaT細(xì)胞RNA的檢測(cè)

1.6.1 試劑盒提取總RNA 使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN，德國)試劑盒提取血清中總RNA，操作步驟按照說明書進(jìn)行。首先將兩組人群的全血離心2000 g 3 min，加入Buffer RLT震蕩混勻，將液體移入到2 mL的收集管內(nèi)離心2 min，加入一倍體積的70%乙醇，混勻，移出700 μL混合物到Rneasy收集柱，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入700 μL的Buffer RW1，10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE 10000 rpm離心15 s，倒掉濾液，向柱子中加入500 μL Buffer RPE蓋上蓋子，大于10000 rpm離心2 min，將柱子移入到一個(gè)新的2 mL收集管內(nèi)，全速離心1 min，將柱子移入到一個(gè)新的1.5 mL 收集管內(nèi)，加入30 μL的無Rnase water，10000 rpm離心1 min，重復(fù)一次，收集濾液。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和OD值，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 熒光定量-PCR(q-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中RNA的表達(dá) 首先利用primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用miScript Reverse Transcription Kit試劑盒(QIAGEN，德國)將提取出來的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為37℃ 60 min，95℃ 5 min。以cDNA為模板，利用SYBR?Green PCR Kit(QIAGEN，德國)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃ 15 min，1循環(huán)；95℃ 15 s，55℃ 30 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct形式表示，其中△CT=CT(目的基因)-CT(GAPDH)(表1)。

表1 各mRNA引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 文中實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)在SPSS 20.0軟件中統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)圖在Graghpad Prism 7軟件中繪制和編輯加工，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)分析兩組獨(dú)立樣本間的均數(shù)差異，采用ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行多組間均數(shù)差異的比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 外泌體對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)的增殖情況。與對(duì)照組相比，各濃度正常人-外泌體組在12 h、24 h、48 h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖水平均明顯降低(均P<0.001)，40 g/L外泌體組尤為明顯(圖1、表2)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖1CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況

2.2 外泌體對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡的影響 將0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L蛋白濃度的正常人-外泌體分別與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。0 g/L、20 g/L、40 g/L、80 g/L外泌體組細(xì)胞的凋亡率分別是2.53±0.3、14.53±2.6、17.12±2.2、12.12±1.2，與對(duì)照組相比，各濃度外泌體組細(xì)胞凋亡水平均明顯升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果中40 g/L外泌體組尤為顯著(圖2)。

2.3 外泌體驗(yàn)證 為了驗(yàn)證從外周血上清中分離的提取物是外泌體，我們用了兩種方法—電鏡與NTA。透射電鏡下觀察到均一的微小囊泡，NTA鏡下觀察到提取物粒徑在3 nm與200 nm之間，即為外泌體分離成功(圖3、4)。

表2 CCK-8法檢測(cè)各濃度外泌體加入HaCaT細(xì)胞的增殖情況

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

2.4 外泌體對(duì)HaCaT細(xì)胞的調(diào)控作用 根據(jù)加入外泌體情況分為三組：AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對(duì)照組，利用q-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥指標(biāo)(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)。結(jié)果顯示，較于正常人-外泌體組和對(duì)照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL，TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，CXCL1表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖5)。

NC：不加外泌體組；EXO20：蛋白濃度20 g/L外泌體組；EXO40：蛋白濃度40 g/L外泌體組；EXO80：蛋白濃度80 g/L外泌體組

圖2流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況

圖3 透射電鏡下外泌體結(jié)構(gòu)(×400) 圖4 NTA檢測(cè)外泌體粒徑大小 4a：外泌體粒徑檢測(cè)；4b：外泌體粒徑三維模式圖

NC：未加入外泌體的對(duì)照組；NH-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的正常人外泌體組；AD-EXO：加入蛋白濃度為40 g/L的AD外泌體組

圖5qPCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)差異

3 討論

特應(yīng)性皮炎表現(xiàn)為皮膚增厚、瘙癢，有明顯的家族遺傳傾向，易患哮喘、過敏性鼻炎等過敏性疾病。大多從幼時(shí)發(fā)病，皮損遷延不愈、瘙癢劇烈，甚至影響患兒的身心健康[9-11]。目前，AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，探索有關(guān)AD發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)記具有重要意義。如果能利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)手段找出AD患者中的一些表達(dá)差異的生物標(biāo)記物，那么對(duì)AD的早期治療具有非常重要的科學(xué)價(jià)值。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的迅猛發(fā)展，對(duì)AD的研究日益深入，

多種與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)，外泌體即是其中之一[12]。

近期多項(xiàng)研究揭示了各種來源的外泌體對(duì)KC的多種調(diào)控作用。Zhang等[13]的研究解釋了肥胖者傷口愈合速度比正常人慢的現(xiàn)象，脂肪細(xì)胞源性外泌體通過直接與PUM2結(jié)合，促進(jìn)其介導(dǎo)的NF-kB通路激活，進(jìn)而誘導(dǎo)人KC炎癥和凋亡。最近一項(xiàng)研究[14]顯示，泛發(fā)性膿皰性銀屑病中性粒細(xì)胞源外泌體較正常中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)KC中IL-1β、IL-36、IL-18、TNF-α和C-X-C基序趨化因子配體等炎癥基因的高表達(dá)。此外，患者的中性粒細(xì)胞比對(duì)照組分泌更多的外泌體，后被KC迅速內(nèi)化，通過激活NF-kB和MAPK信號(hào)通路增加這些炎癥分子的表達(dá)。綜上研究，脂肪細(xì)胞和中性粒細(xì)胞源外泌體可以調(diào)控人KCs的增殖、凋亡和炎性因子的分泌，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展?；谝酝芯?，我們?cè)诒驹囼?yàn)中擬探索AD患者外周血中外泌體能否對(duì)KC的活化、炎癥產(chǎn)生影響。

首先收集我院AD患者和健康人的外周血樣本各30例并分離血漿中外泌體，采用電鏡與NTA來進(jìn)行外泌體的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，然后進(jìn)行外泌體的功能研究：將不同蛋白濃度的外泌體分別與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、凋亡情況，目的是找出外泌體對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響和它的最佳刺激濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入正常人-外泌體后的細(xì)胞增殖率較對(duì)照組顯著降低、凋亡率明顯升高；其中，加入40 g/L蛋白濃度刺激后的差異尤為顯著。因此我們將該濃度的外泌體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)加入外泌體情況將HaCaT細(xì)胞分為AD-外泌體組、正常人-外泌體組和對(duì)照組，檢測(cè)三組細(xì)胞的活化(K16)、分化(K10、IVL)、炎癥(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)指標(biāo)。結(jié)果顯示，較正常人-外泌體組和對(duì)照組，AD-外泌體組中K16、K10、IVL、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表達(dá)升高，而CXCL1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以，AD-外泌體可以促進(jìn)KC的增殖和炎癥因子的分泌。得出結(jié)論：AD患者外周血外泌體可以抑制KC的凋亡并促進(jìn)KC的增殖、活化及炎癥因子的分泌，從而參與AD的發(fā)生發(fā)展。

在設(shè)計(jì)方面該實(shí)驗(yàn)有一定的不足之處，因各種客觀因素，樣本量較少，從而對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，后期有條件可適當(dāng)對(duì)樣本量進(jìn)行擴(kuò)充。此外，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中我們選用了人正常角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT，值得說明的是，細(xì)胞株與人體細(xì)胞間畢竟具有一定的變異性，目前兩者差異能否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成影響尚不明確。重要的是，外泌體中影響人KC活化、炎癥的具體物質(zhì)，還有待于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和研究。